In the course of screening for antioxidant compounds by measuring the DPPH radical scavenging activity, a total extract of the aerial part of Trigonotis peduncularis (Boraginaceae) was found to show potent DPPH radical scavenging activity. Subsequent activity-guided fractionation of the methanolic e...
In the course of screening for antioxidant compounds by measuring the DPPH radical scavenging activity, a total extract of the aerial part of Trigonotis peduncularis (Boraginaceae) was found to show potent DPPH radical scavenging activity. Subsequent activity-guided fractionation of the methanolic extract of T. peduncularis led to the isolation of seven compounds, kaempferol (1), quercetin (2), trigonotin A (3), astragalin (4), trigonotin C (5), kaempferol-3-O-${\alpha}$-L-rhamnopyranosyl(1${\rightarrow}$6)-${\beta}$-D-glucopyranoside (6), and rutin (7) from the active ethyl acetate soluble fraction. Their structures were elucidated by spectroscopic studies. Among seven compounds, compounds 1, 2, 4, 6 and 7 were isolated for the first time from this plant, and compounds 2 and 7 showed the significant DPPH free radical scavenging activities.
In the course of screening for antioxidant compounds by measuring the DPPH radical scavenging activity, a total extract of the aerial part of Trigonotis peduncularis (Boraginaceae) was found to show potent DPPH radical scavenging activity. Subsequent activity-guided fractionation of the methanolic extract of T. peduncularis led to the isolation of seven compounds, kaempferol (1), quercetin (2), trigonotin A (3), astragalin (4), trigonotin C (5), kaempferol-3-O-${\alpha}$-L-rhamnopyranosyl(1${\rightarrow}$6)-${\beta}$-D-glucopyranoside (6), and rutin (7) from the active ethyl acetate soluble fraction. Their structures were elucidated by spectroscopic studies. Among seven compounds, compounds 1, 2, 4, 6 and 7 were isolated for the first time from this plant, and compounds 2 and 7 showed the significant DPPH free radical scavenging activities.
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문제 정의
6) 꽃마리에 대해서는 지금까지 lignan sucrose diester 성분인 trigonotin A-C와 몇 가지 물질만이 보고7)되어 있을 뿐 식물화학적 연구나 약리학적 연구가 자세히 보고된 바가 없어, 본 연구는 천연자원에서 항산화물질을 찾는 연구의 일환으로 본 식물의 methanol 추출물을 용매로 계통분획하여 얻은 분획물을 DPPH radical 소거효과에 기인한 항산화활성을 확인하여 보았다. 그 결과 ethyl acetate 분획에서 강한 활성이 확인되어 ethyl acetate 분획에서 물질을 분리하여 그 구조를 확인한 다음 DPPH radical 소거 효과를 측정하여 천연 항산화제로서의 이용가능성을 알아보고자 하였다.
6) 꽃마리에 대해서는 지금까지 lignan sucrose diester 성분인 trigonotin A-C와 몇 가지 물질만이 보고7)되어 있을 뿐 식물화학적 연구나 약리학적 연구가 자세히 보고된 바가 없어, 본 연구는 천연자원에서 항산화물질을 찾는 연구의 일환으로 본 식물의 methanol 추출물을 용매로 계통분획하여 얻은 분획물을 DPPH radical 소거효과에 기인한 항산화활성을 확인하여 보았다. 그 결과 ethyl acetate 분획에서 강한 활성이 확인되어 ethyl acetate 분획에서 물질을 분리하여 그 구조를 확인한 다음 DPPH radical 소거 효과를 측정하여 천연 항산화제로서의 이용가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
1 H-NMR spectrum에서는 δ 7.97(2H, d, J = 8.8 Hz)과 6.79(2H, d, J = 8.8 Hz)의 proton signal과 δ 6.28(1H, d, J = 1.8 Hz)과 6.07(1H, d, J = 1.8 Hz)의 proton signal이 확인되어 flavonoid 화합물인 kaempferol 로 추정하였으며, 13C-NMR spectrum 자료와 함께 문헌치9) 와 비교하여 이를 확정하였다.
DPPH Free Radical 소거법에 의한 항산화활성8) − 96 well plate에 시료를 EtOH로 각 농도별로 조제한 용액에 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (EtOH)을 일정량씩 가하였다.
E32를 methanol로 재결정을 시도하여 화합물 6(15 mg)을 확보하였다. E5분획을 Sephadex LH-20(MeOH) column을 통과시켜 5개의 분획(E51-E55)으로 나누고 E52와 E54를 methanol로 재결정을 시도하여 화합물 6(8 mg)과 7(16 mg)을 각각 확보하였다.
항산화효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거작용을 3회 반복하여 측정하였다.
0 kg을 methanol로 가끔 진탕하면서 5시간씩 50oC에서 3회 온침 추출하였다. 그 추출액을 수욕상에서 감압농축하여 methanol 엑스 약 210 g을 얻었으며, 이 methanol 엑스를 증류수로 현탁시키고 상법에 따라 동량의 methylene chloride(16 g) 및 ethyl acetate(21 g)로 용매 분획하여 각각의 분획물을 얻었다. 이들 분획물에 대해 DPPH radical 소거활성을 측정하여 강한 소거효능을 보인 ethyl acetate분획에서 물질 분리를 시도하였다.
꽃마리 지상부로부터 얻은 methanol 엑스를 용매로 분획하여 methylene chloride 및 ethyl acetate엑스를 제조하였다. 이 중 더 강한 DPPH 라디칼 소거활성(Fig.
꽃마리 지상부로부터 얻은 methanol 엑스를 용매로 분획하여 methylene chloride 및 ethyl acetate엑스를 제조하였다. 이 중 더 강한 DPPH 라디칼 소거활성(Fig. 1)을 나타낸 ethyl acetate 분획물에서 몇 가지 column chromatography를 반복 실시하여 7종의 화합물을 단리하였다(Fig. 2).
그 추출액을 수욕상에서 감압농축하여 methanol 엑스 약 210 g을 얻었으며, 이 methanol 엑스를 증류수로 현탁시키고 상법에 따라 동량의 methylene chloride(16 g) 및 ethyl acetate(21 g)로 용매 분획하여 각각의 분획물을 얻었다. 이들 분획물에 대해 DPPH radical 소거활성을 측정하여 강한 소거효능을 보인 ethyl acetate분획에서 물질 분리를 시도하였다. Ethyl acetate분획 3 g을 CHCl3-MeOH(4:1)을 유출용매로 silica gel column을 통과시켜 TLC 양상에 따라 5개의 분획(E1-E5)으로 나누었다.
이상의 자료를 종합하여 검토한 결과 화합물 3과 5는 본 식물에서 이미 분리되어 발표된 천연 형광물질일 것으로 추정되었으며, 문헌치7)와 비교하여 화합물 3은 aryldihydronaphthalene type lignan의 sucrose diester 화합물인 trigonotin A로 화합물 5는 trigonotin C로 확인·동정하였다. 이상과 같이 꽃마리 지상부의 methanol 추출물 분획 중 DPPH free 라디칼 소거활성이 좋은 ethyl acetate 분획으로부터 물질 7종을 분리하여 그 구조를 동정하였다. 화합물 1, 2, 4, 6 및 7은 본 식물에서 처음 보고되는 화합물이며, 분리된 화합물의 DPPH free 라디칼 소거활성은 Fig.
추출 및 분리 − 꽃마리 지상부를 세절한 다음 건조하여 얻은 시료 약 1.0 kg을 methanol로 가끔 진탕하면서 5시간씩 50oC에서 3회 온침 추출하였다.
화합물 2는 FeCl3 반응에 양성으로 나타났으며, 1 H-NMR spectrum의 aromatic 영역에서 δ 7.68(1H, d, J = 2.2 Hz), 7.56(1H, dd, J = 8.2, 2.2 Hz) 및 6.90(1H, d, J = 8.2 Hz) 에서 전형적인 ABX coupling system의 3개의 proton이 확인되고, δ 6.43(1H, d, J = 1.9 Hz)과 6.19(1H, d, J = 1.9 Hz)의 proton signal이 확인되어 flavonoid 화합물인 quercetin 으로 추정하였으며, 13C-NMR spectrum 자료와 함께 문헌치12)와 비교하여 이를 확정하였다.
화합물 4와 6은 aromatic 영역에서 화합물 1과 유사한 양상의 peak signal로 관찰되었으며, 화합물 4의 1 H-NMR spectrum의 δ 5.24(H, d, J =7.5 Hz)에서, 화합물 6은 δ 5.11(1H, d, J = 7.2 Hz)과 4.51(1H, brs)에서 anomeric proton으로 추정되는 proton peak가 관찰되어 이 두 화합물은 kaempferol glycoside로 추정하였으며, 13C-NMR spectrum 자료와 함께 문헌치와 비교하여 화합물 4는 kaempferol glucoside인 astragalin10)으로, 화합물 6은 kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-βD-glucopyranoside11)로 각각 확인·동정하였다.
화합물 7은 aromatic 영역에서 화합물 2와 유사한 양상의 peak signal로 관찰되었으며, δ 5.09(1H, d, J = 7.4 Hz)와 4.52(1H, brs)에서 anomeric H으로 추정되는 2개의 proton peak가 관찰되어 quercetin glycoside로 추정하였으며 13C-NMR spectrum 자료와 함께 문헌치11)와 비교하여 화합물 7은 quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside인 rutin으로 확정하였다.
대상 데이터
추출 및 분획용 시약은 1급 용매를 사용하였으며, TLC 및 column용 시약 등은 1급 용매 또는 특급시약을 사용하였다. Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(Art. 1.07734, 230-400 mesh, Merck)을 사용하였으며, molecular sieve column chromatography용 packing material은 Sephadex LH-20(Pharmacia)을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F254 precoated plate(Art.
10초간 진탕한 후 25oC에서 30분간 방치한 후 microplate reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조약물은 L-ascorbic acid를 사용하였다. 항산화효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다.
07752, Merck)를 사용하였으며, LPLC용 column은 Lobar A(LiChroprep Si 60, Merck) column을 사용하였다. 발색시약으로는 10% H2SO4 (in EtOH) 시약을 사용하였으며, UV의 검색은 254, 365 nm에서 하였다.
시약 및 기기 − 실험에 사용한 기기로는 1H-NMR 및 13CNMR spectrum은 Jeol JMN-EX 400 spectrometer(Japan)를 이용하여 확보하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용한 꽃마리는 2011년 6월에 전북 완주군에서 채집하여, 정확히 감정한 후에 실험에 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WSU-11-018).
성능/효과
꽃마리의 methanol 추출물 중 ethyl acetate분획에서 항산화 활성을 갖는 7종의 화합물을 단리하였으며, 이들의 spectral data로부터 구조를 확인한 결과 kaempferol(1), quercetin(2), trigonotin A(3), astragalin(4), trigonotin C(5), kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside(6) 및 rutin(7)으로 각각 확인·동정하였다.
한편 천연 형광물질인 화합물 3과 5는 비교적 약한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타냈다. 이상의 결과로 화합물 3과 5는 꽃마리의 methanol 추출물이 갖고 있는 항산화활성을 나타내는 일부 구성 물질임을 알 수 있었으며, 꽃마리 지상부는 항산화활성을 갖는 천연 자원소재으로서의 이용가능성이 있을 것으로 사료된다.
이상의 자료를 종합하여 검토한 결과 화합물 3과 5는 본 식물에서 이미 분리되어 발표된 천연 형광물질일 것으로 추정되었으며, 문헌치7)와 비교하여 화합물 3은 aryldihydronaphthalene type lignan의 sucrose diester 화합물인 trigonotin A로 화합물 5는 trigonotin C로 확인·동정하였다.
화합물 1, 2, 4, 6 및 7은 본 식물에서 처음 보고되는 화합물이며, 분리된 화합물의 DPPH free 라디칼 소거활성은 Fig. 3에 나타난 바와 같이 화합물 2(IC50; 3.7 µg/mL)와 화합물 7(IC50;15.7 µg/mL)이 농도 의존적으로 비교적 강한 DPPH free 라디칼 소거활성을 보여 주었으며, vitamin C의 IC50는 3.1 µg/ mL으로 측정되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
체내에 축적된 활성산소종은 어떤 문제를 일으키는가?
체내에서 발생되는 산소의 대부분은 에너지 대사과정에서 인산화를 통해서 환원되지만 그 중 일부는 활성산소종의 형태로 유리기를 형성하여 인체에 장해를 일으키는 것으로 보고되어 있다. 체내에 축적된 활성산소는 인체의 구성성분인 DNA, 단백질, 지질, 아민 및 탄수화물 등을 비가역적으로 파괴하여 세포를 파괴하고 산화를 촉진시키며 노인성 질환 등을 비롯한 노화 관련된 질병의 주요 원인으로 보고되어 있다. 따라서 부작용이 적고 안전한 천연 항산화제의 개발이 요구되고 있으며, 근래에 활성 산소종이나 자유 라디칼을 제거하기 위한 많은 항산화제의 연구가 진행되고 있다.
꽃마리는 분류학적으로 어디에 속하는가?
꽃마리 Trigonotis peduncularis Bentham는 지치과(Boraginaceae)에 속하는 월년초로 산이나 들의 메마른 곳에서 자란다.6) 꽃마리에 대해서는 지금까지 lignan sucrose diester 성분인 trigonotin A-C와 몇 가지 물질만이 보고7)되어 있을 뿐 식물화학적 연구나 약리학적 연구가 자세히 보고된 바가 없어, 본 연구는 천연자원에서 항산화물질을 찾는 연구의 일환으로 본 식물의 methanol 추출물을 용매로 계통분획하여 얻은 분획물을 DPPH radical 소거효과에 기인한 항산화활성을 확인하여 보았다.
꽃마리는 어떤 곳에서 자라는가?
꽃마리 Trigonotis peduncularis Bentham는 지치과(Boraginaceae)에 속하는 월년초로 산이나 들의 메마른 곳에서 자란다.6) 꽃마리에 대해서는 지금까지 lignan sucrose diester 성분인 trigonotin A-C와 몇 가지 물질만이 보고7)되어 있을 뿐 식물화학적 연구나 약리학적 연구가 자세히 보고된 바가 없어, 본 연구는 천연자원에서 항산화물질을 찾는 연구의 일환으로 본 식물의 methanol 추출물을 용매로 계통분획하여 얻은 분획물을 DPPH radical 소거효과에 기인한 항산화활성을 확인하여 보았다.
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