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가설 설정
- 천마의 성분 중에서 신경보호 및 진정효과가 있는 성분들로는 GABA, gastrodin, 4-hydroxybenzyl alcohol, 4-hydroxybenzyl aldehyde, vanillin 및 Parishin C으로 알려져 있다.12-16,22) 본 연구에서는 천마의 가공형태에 따라서 생리활성의 증대하리라는 가설 하에 유산균을 이용하여 천마의 생리활성 및 성분변화를 유도하였다. 유산균 Lactobacillus brevis 발효에 의하여 수면유도 효과의 변화를 측정한 결과, 유산균 발효에 의하여 천마의 수면시간의 증가, 입면시간의 감소 및 GABAA-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성도 증대효과를 나타내었으며, 발효된 천마의 성분 중에서 항불안, 진정 효과를 나타내는 parishin C와 GABA 성분이 증가하였다.
제안 방법
- 96-well plate에 membrane suspension 180 µL, 각각의 추출물 시료 10 µl 및 3H-flumazenil(1 nM, final concentration) 10 µL을 넣고 ice-bath에서 40분간 반응하였다.
- GABA 함량 측정은 아미노산분석기(Amino acid analyzer, L-8900, Hitachi, Japan)사용하여 정량 분석하였으며, 6,000×g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 0.45 µm membrane(Millipore)으로 여과한 후 분석용 시료로 사용하였다.
- GABAA-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 − 발효 천마와 발효하지 않은 천마 추출물의 벤조다이아제핀 수용체의 선택적인 길항제인 3H-Flumazenil의 수용체에 대한 결합 반응을 억제하는 활성도를 측정하였다(Fig. 1).
- 시험에 사용한 천마는 세척, 건조 및 분쇄하여 동결건조를 거친 동결건조천마를 사용하였다. 발효천마를 제조하기 위하여 건조된 천마 1 kg를 물에 침지한 후 불림을 행하였으며, 침지 후 물빼기를 실시한 다음 200 g씩 배양용기에 분취하였다. 이후 121℃에서 15분간 가압 멸균하고 실온으로 냉각시킨 다음 Lactobacillus brevis (KCCM 41029) 배양액을 5% (v/w)로 접종 한 후 30℃에서7일간 발효하였다.
- 비특이적 결합(nonspecific binding, NSB)은 clonazepam(1 µM, final concentration)을 이용하여 그 값을 결정하였고, binding displacement 값(%)은 아래와 같이 계산하였다.
- 사육조건은 22±2℃ 상대습도 55±5%, 환기횟수 시간당 10~12회, 명암주기 12시간으로 유지하고, 모든 실험동물은 실험 동물실에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 수면시간 및 입면시간의 변화 − 유산균 발효 천마와 발효시키지 않은 천마 각각을 경구투여 30 후에 pentobarbital (30 mg/kg, i.p.)을 마우스 복강으로 주사하여 수면시간 (sleeping time)과 입면시간(sleep latency)을 측정해 보았다.
- 사육조건은 22±2℃ 상대습도 55±5%, 환기횟수 시간당 10~12회, 명암주기 12시간으로 유지하고, 모든 실험동물은 실험 동물실에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 시료는 1일 1회로 5일간 투여하였고, 최종 시료의 경구투여 30 후에 pentobarbital(30 mg/ kg, i.p.)을 마우스 복강으로 주사하여 수면시간(sleeping time)과 입면시간(sleep latency)을 측정하였다.18)
- 유산균 발효에 의한 천마 성분의 변화 − 천마의 성분 중에서 수면유도 효과와 관련이 있다고 판단되는 성분인 gastrodin, 4-hydroxybenzyl alcohol, 4-hydroxybenzyl aldehyde, vanillin 및 Parishin C의 함량은 유산균 발효 천마와 발효하지 않은 천마에 대하여 HPLC 분석을 실시하였고, GABA의 함량은 아미노산분석기를 이용하여 함량의 변화를 측정하였다(Table III).
- 주요 성분 분석 − 천마의 생리활성물질들 중 다음의 5가지 물질, 가스트로딘(gastrodin), 4-하이드록시벤질 알코올(4- hydroxybenzyl alcohol), 4-하이드록시벤질 알데하이드(4- hydroxybenzyl aldehyde), 바닐린(vanillin) 및 파리신 씨 (Parishin C)은 시그마 등에서 구입하여 증류수에 녹인 후 측정하였으며, 천마의 열수추출물과 그 발효액은 증류수에 100배 희석한 후 0.22 µm 막 필터로 여과한 후 측정하였다.
대상 데이터
- 3H-Flumazenil은 PerkinElmer Life & Analytical Sciences(USA)로부터 구입하였다.
- 3H-Flumazenil은 PerkinElmer Life & Analytical Sciences(USA)로부터 구입하였다. Dulbeccos Modified Eagles Medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 Invitrogen(USA)으로부터 구입하였다. 천마는 전북 무주에서 구입하였다.
- 동물시험 − 수면유도 시험 동물로는 체중 15~20 g ICR 수컷 마우스를 사용하였다.
- 유산균 발효−발효 균주인 Lactobacillus brevis(KCCM 41029)는 MRS broth에 2% 접종하여 37℃ 배양기에 18시간 배양하여 준비하였다. 시험에 사용한 천마는 세척, 건조 및 분쇄하여 동결건조를 거친 동결건조천마를 사용하였다. 발효천마를 제조하기 위하여 건조된 천마 1 kg를 물에 침지한 후 불림을 행하였으며, 침지 후 물빼기를 실시한 다음 200 g씩 배양용기에 분취하였다.
- 유산균 발효−발효 균주인 Lactobacillus brevis(KCCM 41029)는 MRS broth에 2% 접종하여 37℃ 배양기에 18시간 배양하여 준비하였다.
- 재료 − Dimethyl sulfoxide(DMSO), pentobarbital sodium, penicillin-streptomycin, 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5- Diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT) 및 Diazepam은 시그마(Sigma-Aldrich USA)로부터 구입하였다.
- Dulbeccos Modified Eagles Medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 Invitrogen(USA)으로부터 구입하였다. 천마는 전북 무주에서 구입하였다.
데이터처리
- 그룹간의 유의적인 통계차를 분석하기 위하여 p<0.05의 유의수준으로 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후, Duncan의 다중범위 검정법(Duncan’s multiple range test)을 이용하여 사후검증을 하였다.
- 통계 분석 − 실험 결과의 통계분석은 SPSS 프로그램을 이용하여 평균 및 표준편차를 구하였다.
이론/모형
- 추출물 조제 − 유산균 발효된 천마와 발효시키지 않은 천마는 모두 동결 건조하였고, 추출 공정은 김 등의 방법에 따라서 에탄올을 이용하여 추출하였다.
성능/효과
- 8-11) 이와 같은 효능을 나타내는 천마의 성분으로는 페놀성 화합물로서 대표적인 성분으로는 gastrodin이 있으며, 이외에 vanillyl alcohol, valnillin, benzaldehydes 및 페놀성 배당체 등이 보고 되었다.12-16) 본 연구에서는 기존의 천마의 항불안 효과를 나타내는 성분을 증강시켜서, 발효하지 않은 천마 및 발효 천마의 추출물에서 수면유도에 대한 효과가 있는지를 유기용매로 추출 및 분획하여 시험한 결과, 발효 천마의 항불안 효과를 나타내는 성분의 증가와 함께 수면유도 효과가 우수한 것을 확인하였다.
- 17) 에탄올의 농도는 60%로 하였고, 추출 온도 및 시간은 상온에서 7시간으로 하였다.
- 1) 수면제는 일반적으로 불면증의 단기적 치료에 효과적이나 약물의존성, 인지기능저하 등 각종 부작용이 있다하여 초기에는 비약물적 치료을 권고하며 심한 경우 수면제를 처방하는 것이 일반적인 불면증의 치료법이다.2) 이러한 수면장애의 치료제로는 quazepam, flurazepam 및 triazolam 등의 benzodiapine 계통 약물과 zolpidem이 있다. 이러한 약물의 단점은 불안, 흥분 및 금단현상과 유사한 증상이 나타날 수 있어, 일상생활의 어려움뿐만 아니라 인지적 장애나 우울등 다른 질병을 일으키는 위험요인이 되기도 한다.
- 유산균 발효에 의한 천마 성분의 변화 − 천마의 성분 중에서 수면유도 효과와 관련이 있다고 판단되는 성분인 gastrodin, 4-hydroxybenzyl alcohol, 4-hydroxybenzyl aldehyde, vanillin 및 Parishin C의 함량은 유산균 발효 천마와 발효하지 않은 천마에 대하여 HPLC 분석을 실시하였고, GABA의 함량은 아미노산분석기를 이용하여 함량의 변화를 측정하였다(Table III). HPLC 분석시험에서 발효전의 천마에서의 gastrodin, 4-hydroxybenzyl alcohol, 4- hydroxybenzyl aldehyde, vanillin 및 Parishin C의 함량은 각각 0.403, 32.597, 0.226, 0.654, 0.256 및 0.487 mg%으로 측정되었고, 발효 후의 천마에서의 gastrodin, 4-hydroxybenzyl alcohol, 4-hydroxybenzyl aldehyde, vanillin 및 Parishin C의 함량은 각각 0.114, 36.547, 0.297, 0.794, 1.097 및 2.346 mg%으로 측정되었다. 유산균 발효 전과 후는 천마의 위의 성분들에 대한 함량변화를 일으켰다.
- 두 시료의 농도를 0.1, 1, 10, 100 및 1,000 µg/mL로 달리하여 GABAA-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 결과, 발효 천마는 각각 6, 29, 45 56 및 87%의 3H-Flumazenil의 결합을 치환하는 GABAA-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성도를 나타내었다.
- 따라서 발효 천마와 발효하지 않은 천마 추출물의 GABAA-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성의 IC50값은 각각 62 및 114 µg/mL으로 측정되었다.
- 346 mg%로 크게 증가 하였다. 따라서 위 성분들 중에서 발효 전과 후의 함량이 크게 증가한 물질로는 parishin C와 GABA로 나타났다.
- 22) 따라서 본 연구에서 유산균 발효에 의하여 항불안 및 진정효과를 나타내는 GABA와 Parishin C의 증가를 가져왔다. 또한 수면시간 증진 및 입면시간의 감소 효과로 볼 때 이러한 성분의 증가는 수면유도 효과를 증진시키는 것으로 사료되었다.
- 반면에 유산균으로 발효시키지 않은 천마의 투여에 의한 수면시간의 증가효과는 투여농도 2, 20 및 200 mg/kg에서 각각 33±5, 36±8 및 54±7분으로 나타났으나, 발효 천마의 투여 대비 모든 투여농도에서 수면시간의 증대 효과는 낮게 나타났다(Table I).
- 반면에 유산균으로 발효시키지 않은 천마의 투여에 의한 입면시간의 증가효과는 투여농도 2, 20 및 200 mg/kg에서 각각 8±0.3, 7±0.5 및 7±0.2분으로 20 및 200 mg/kg에서는 감소효과가 나타났으나 통계적인 유의성이 나타나지 않아 유의하게 입면시간의 감소를 가져왔다고는 판단할 수 없었다.
- )을 마우스 복강으로 주사하여 수면시간 (sleeping time)과 입면시간(sleep latency)을 측정해 보았다. 시료 투여에 의한 수면시간 측정한 결과, 유산균 발효 천마의 경우가 발효시키지 않은 천마에 비하여 수면시간의 증대를 가져왔다. 즉, pentobarbital(30 mg/kg) 투여에 의한 정상적인 마우스의 수면시간은 32±3분으로 나타났으나, 유산균 발효 천마 2, 20 및 200 mg/kg의 투여군에서의 수면시간은 각각 42±4, 44±6 및 69±5분으로 측정되어 시료 투여에 의한 수면시간이 농도의존적으로 증가하였고, 20 및 200 mg/kg군에서는 각각 137% 및 216%의 수면시간 증가를 나타내었고 통계적인 유의성이 인정되어 시료투여에 의한 수면시간 증대의 효과가 나타났다.
- Table II에서는 잠이 들기까지의 시간을 나타내는 입면시간을 측정한 결과이다. 시료 투여에 의한 입면시간의 감소효과를 측정한 결과, 수면시간의 증대의 효과가 동일 양상으로 유산균 발효 천마의 경우가 발효시키지 않은 천마에 비하여 입면시간의 감소효과를 나타내었다. 즉, pentobarbital(30 mg/kg) 투여에 의한 정상적인 마우스의 입면시간은 8±1.
- 유산균 발효 후에 증가된 성분들로는 4-hydroxybenzyl alcohol, vanillin 및 Parishin C이었고, 감소된 성분들로는 gastrodin이었다. 아미노산분석기로 측정한 GABA의 함량에 있어서는 발효 전과 후에 유의적으로 커다란 변화를 나타내었는데 발효 전에는 0.487 mg%이었으나 발효 후에는 2.346 mg%로 크게 증가 하였다. 따라서 위 성분들 중에서 발효 전과 후의 함량이 크게 증가한 물질로는 parishin C와 GABA로 나타났다.
- 12-16,22) 본 연구에서는 천마의 가공형태에 따라서 생리활성의 증대하리라는 가설 하에 유산균을 이용하여 천마의 생리활성 및 성분변화를 유도하였다. 유산균 Lactobacillus brevis 발효에 의하여 수면유도 효과의 변화를 측정한 결과, 유산균 발효에 의하여 천마의 수면시간의 증가, 입면시간의 감소 및 GABAA-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성도 증대효과를 나타내었으며, 발효된 천마의 성분 중에서 항불안, 진정 효과를 나타내는 parishin C와 GABA 성분이 증가하였다. 최근 항불안제인 benzodiazepine계 약물의 작용기전은 억제적 신경전달물질인 GABA의 강화라고 알려져 있다.
- 유산균 발효 전과 후는 천마의 위의 성분들에 대한 함량변화를 일으켰다. 유산균 발효 후에 증가된 성분들로는 4-hydroxybenzyl alcohol, vanillin 및 Parishin C이었고, 감소된 성분들로는 gastrodin이었다. 아미노산분석기로 측정한 GABA의 함량에 있어서는 발효 전과 후에 유의적으로 커다란 변화를 나타내었는데 발효 전에는 0.
- 즉, pentobarbital(30 mg/kg) 투여에 의한 정상적인 마우스의 수면시간은 32±3분으로 나타났으나, 유산균 발효 천마 2, 20 및 200 mg/kg의 투여군에서의 수면시간은 각각 42±4, 44±6 및 69±5분으로 측정되어 시료 투여에 의한 수면시간이 농도의존적으로 증가하였고, 20 및 200 mg/kg군에서는 각각 137% 및 216%의 수면시간 증가를 나타내었고 통계적인 유의성이 인정되어 시료투여에 의한 수면시간 증대의 효과가 나타났다.
- 즉, pentobarbital(30 mg/kg) 투여에 의한 정상적인 마우스의 입면시간은 8±1.0분으로 나타났으나, 유산균 발효 천마 2, 20 및 200 mg/kg의 투여군에서의 입면시간은 각각 7±0.4, 6±0.8 및 5±0.6분으로 측정되어 시료 투여에 의한 입면시간이 농도의존적으로 감소하였고, 200 mg/kg군에서는 정상 마우스 대비 38%의 입면시간 감소효과가 나타났고 통계적인 유의성이 인정되어 시료투여에 의한 입면시간의 감소효과가 나타났다.
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