선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 또한, 서리태의 풍부한 isoflavone은 에스트로겐과 유사한 생리기능을 하는 것으로 알려져 폐경기 여성의 골다공증 예방에 사용되고 있다. 따라서 이러한 식물추출물의 복합물은 퇴행성관절염과 같은 염증성 질환을 개선하는 효과가 있을 것으로 사료되어 본 연구를 수행하였다.
- 본 연구소의 선행연구에서 퇴행성관절염 개선제를 개발하기 위해 32종의 천연물을 탐색한 결과, 桑椹子, 桑葉 및 서리태가 퇴행성관절염의 개선에 필요한 여러 조건을 상호보완적으로 충족시킴을 확인하였다. 이에 이들을 배합한 桑椹子추출물 등 복합물(이하, CME)을 대상으로 퇴행성관절염의 개선 효과를 연구하였다.
제안 방법
- 즉, 실험동물 수는 각 군당 10 마리로 하여 7주령, 체중 300g~350g의 SD계 흰쥐의 무릎 관절강내로 27 gauge의 주사바늘이 있는 1 mL 주사기를 사용하여 실험군, 음성대조군, 양성대조군에는 MIA (40 mg/mL)를 50 µL씩 주사하고 Sham군에는 MIA 대신 PBS를 주사하였다. 24시간 후부터 1일 1회씩 실험군은 CME를 100 mg/kg 체중 또는 CME 400 mg/kg 체중, 음성대조군은 정제수 2 mL, 양성대조군은 ibuprofen을 20 mg/kg 체중, Sham군은 정제수 2 mL을 14일간 경구투여하였다.
- 7주령 Spraugue dauley(SD)계 흰쥐에 Table 1.에 표기한 바와 같이 대조군과 실험군을 나누어 MIA(Sigma Chemical, MO, USA)를 무릎 관절강내 주사(intra-articular injection)함으로써 chondrocyte의 대사를 저해하고 이로 인해 cartilage, ligament 및 tendon의 손상을 유발시켜 골관절염을 발생시키는 원리를 이용하였다. 즉, 실험동물 수는 각 군당 10 마리로 하여 7주령, 체중 300g~350g의 SD계 흰쥐의 무릎 관절강내로 27 gauge의 주사바늘이 있는 1 mL 주사기를 사용하여 실험군, 음성대조군, 양성대조군에는 MIA (40 mg/mL)를 50 µL씩 주사하고 Sham군에는 MIA 대신 PBS를 주사하였다.
- CME 투여군과 대조군은 시료 투여 12시간 전에 절식시키고 2 g/kg으로 1회 경구투여 한 후 14일 동안 임상증상을 식품의약품안전청의 독성시험기준 및 OECD test guideline 420 (TG 420)에 따라서 관찰하였다. 즉, 모든 실험동물은 시료투여 당일 날에 투여 후 6시간 동안 매 시간마다 동물의 일반상태의 변화, 중독증상의 발현 및 사망유무를 관찰 하였으며, 다음날부터 14일까지는 1일 1회씩 관찰하였다.
- MIA를 이용한 퇴행성관절염 동물모델에서 염증 및 통증유발인자인 prostaglandin의 생성을 억제하는 효능을 측정하기 위해 Prostaglandin screening EIa Kit (Cayman Chemical, MI, USA)를 사용하였다. 먼저, kit에 포함된 Prostaglandin AChE Tracer와 antiserum을 anti-PGs antibody가 코팅된 96 well plate에 넣고 표준 prostaglandin 또는 각 실험군의 동물에서 얻은 혈청을 50 µl씩 첨가한 후 18시간 상온에서 반응시키고 각 well을 5번 세척하고 Ellman's Reagent를 200 ml씩 넣고 70분간 발색하고 ELISA reader (Molecular Devices)를 이용하여 420 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.
- . The degenerative arthritis was induced by mono-sodium iodoacetate (MIA) only (DW), MIA and 20 mg/kg body weight of ibuprofen for 14 days (ibuprofen), MIA and 100 mg/kg body weight of CME for 14 days (CME100), MIA and 400 mg/kg body weight of CME for 14 days (CME400), respectively. All data are presented as means ± SDs of three independent experiments.
- 먼저, kit에 포함된 Prostaglandin AChE Tracer와 antiserum을 anti-PGs antibody가 코팅된 96 well plate에 넣고 표준 prostaglandin 또는 각 실험군의 동물에서 얻은 혈청을 50 µl씩 첨가한 후 18시간 상온에서 반응시키고 각 well을 5번 세척하고 Ellman's Reagent를 200 ml씩 넣고 70분간 발색하고 ELISA reader (Molecular Devices)를 이용하여 420 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. prostaglandins의 양은 ELISA kit에 포함된 표준곡선을 이용하여 산술비례적으로 구하였다.
- 桑椹子추출물, 桑葉추출물 및 서리태추출물이 퇴행성관절염의 개선에 필요한 여러 조건들 각각의 중요도와 각 추출물이 가지는 효과의 정도를 고려하여 桑椹子추출물 : 桑葉추출물 : 서리태추출물 = 70 : 14 : 16의 중량비로 배합하여 제조하고 이를 CME라 명하였다.
- 각 시료를 경구투여한 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델의 슬관절 조직을 절취하여 4% 포르말린(pH 7.4)으로 고정하고 5% formic acid로 칼슘을 제거한 후 에탄올 수용액(50%, 70%, 95%, 100%)으로 순차적 탈수 및 xylene으로 투명화하고 파라핀 포매하였다. 포매된 조직을 6µm의 두께로 박절하고 슬라이드에 부착한 후 Gill’s Hematoxylin 및 Eosin을 이용하여 H&E 염색을 하고 광학현미경(200배)으로 관찰하였다.
- 즉, 모든 실험동물은 시료투여 당일 날에 투여 후 6시간 동안 매 시간마다 동물의 일반상태의 변화, 중독증상의 발현 및 사망유무를 관찰 하였으며, 다음날부터 14일까지는 1일 1회씩 관찰하였다. 또한 시험물질 투여 당일과 14일째의 체중변화를 측정하였다. 시험 종료 후 실험동물을 마취하고 치사 시킨 다음 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안으로 관찰하였다.
- 배경염색은 Mayer’s hematoxylin으로 하고 광학현미경(200배 배율)으로 촬영하였다.
- 배지를 PBS로 3회 수세하고 4% formalin (in PBS, pH 7.4)로 고정하고 일차항체인 COX-2 (Cell signaling Technology, MA, USA) 또는 5-LO (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 또는 iNOS(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 이용하여 항원을 표지하고 3,3′-Diaminobenzidine (DAB, Sigma Chemical, MO, USA)으로 발색하였다.
- 사육조건을 온도 22±2℃, 상대습도 55±10%, 조명시간 12시간(오전 6시~오후 6시)으로 설정 한 뒤 시험하였고 실험동물용 고형사료(Samtako, Korea)와 정수시스템을 사용한 물을 자유섭취 하도록 하였다.
- 또한 시험물질 투여 당일과 14일째의 체중변화를 측정하였다. 시험 종료 후 실험동물을 마취하고 치사 시킨 다음 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안으로 관찰하였다.
- 아라키돈산을 기질로 하여 prostaglandin을 생성하는 COX-2의 효소활성을 측정하기 위하여 COX inhibitor screening assay kit (Cayman chemical, MI, USA)을 사용하였다. 먼저, 1.
- CME 투여군과 대조군은 시료 투여 12시간 전에 절식시키고 2 g/kg으로 1회 경구투여 한 후 14일 동안 임상증상을 식품의약품안전청의 독성시험기준 및 OECD test guideline 420 (TG 420)에 따라서 관찰하였다. 즉, 모든 실험동물은 시료투여 당일 날에 투여 후 6시간 동안 매 시간마다 동물의 일반상태의 변화, 중독증상의 발현 및 사망유무를 관찰 하였으며, 다음날부터 14일까지는 1일 1회씩 관찰하였다. 또한 시험물질 투여 당일과 14일째의 체중변화를 측정하였다.
- 즉, 실험동물 수는 각 군당 10 마리로 하여 7주령, 체중 300g~350g의 SD계 흰쥐의 무릎 관절강내로 27 gauge의 주사바늘이 있는 1 mL 주사기를 사용하여 실험군, 음성대조군, 양성대조군에는 MIA (40 mg/mL)를 50 µL씩 주사하고 Sham군에는 MIA 대신 PBS를 주사하였다.
- 포매된 조직을 6µm의 두께로 박절하고 슬라이드에 부착한 후 Gill’s Hematoxylin 및 Eosin을 이용하여 H&E 염색을 하고 광학현미경(200배)으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 桑椹子는 전라북도 부안군 농업기술센터에서 1kg 구입하였다. 桑椹子 생과를 식품용 분쇄기를 이용하여 700 rpm으로 5분간 분쇄 후 분쇄된 桑椹子 즙에 3배량(w/v)의 40% 에탄올 수용액으로 50℃에서 4시간, 총 3회 추출한 다음 냉각하고 0.
- 桑葉 추출물은 桑葉을 전라북도 부안군 농업기술센터에서 1kg 구입하였다. 桑葉을 정제수로 세척 후 50℃, 24시간 건조하고 식품용 분쇄기를 이용하여 700 rpm으로 5분간 분쇄 후 분쇄된 분말에 4배량(w/v)의 50% 에탄올 수용액으로 60℃에서 4시간, 총 3회 추출한 다음 냉각하고 0.
- 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 세포배양을 위해 penicillin (100 IU/mL)과 streptomycin (100 µg/mL) 및 10% Fetal Bovine Serum (FBS)를 포함하는 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL, MD, USA)배지를 사용하였다.
- 서리태는 경상남도 함양농협에서 1kg 구입하였다. 서리태를 정제수로 세척 후 서리태의 4배량(w/v)의 30% 에탄올 수용액으로 60℃에서 4시간, 총 3회 추출한 다음 냉각하고 0.
- 실험동물은 6주령 Sprague Dawley(SD) 계통의 rat(Samtako, Korea)로, 시험군은 암컷과 수컷 각 5마리씩 대조군과 CME 투여군으로 정하였다. 이 동물들은 인수 시 및 적응 기간 동안 일반증상의 이상이 관찰되지 않았다.
- 2)를 사용하여 여과하였다. 얻어진 여액을 60℃에서 30 brix까지 감압 농축하고 여기서 얻어진 농축액을 동결건조하여 서리태 추출분말을 134.7g을 수득하였다.
- 2)를 사용하여 재여과하였다. 얻어진 여액을 60℃에서 60 brix까지 감압 농축하고 여기서 얻어진 농축액을 동결건조하여 桑椹子 추출분말을 113.2g 수득하였다.
데이터처리
- 실험결과는 3회 반복하여 평균±표준오차(mean±SEM)로 나타냈으며, Student’s t-test로 통계처리하여 비교하였다.
이론/모형
- 96 well을 완충액으로 5회 세척한 후 Ellman's reagent를 200 µL씩 넣고 60분간 발색한 후 ELISA reader (VERSAmax, Molecular Devices, CA, USA) 기기를 이용하여 410 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. COX-2 활성억제의 정도는 kit 제조사의 방법을 준용하여 계산하였으며 50% 억제하는 농도인 IC50(ppm)값으로 나타내었다.
성능/효과
- 또한, CME는 MIA를 이용한 관절염 동물모델에서 비록 단일물질이며 합성의약품인 ibuprofen보다는 염증과 통증을 유발하는 prostaglandins 감소시키는 효과가 있지 않지만 CME가 천연식물 추출물로 이루어진 복합물질임을 감안하면 매우 우수한 prostaglandins 감소효과가 있다고 판단된다. CME가 MIA에 의해 손상되는 슬관절의 퇴행성 변형을 억제하는 조직학적 실험결과는 CME의 COX-2 활성저해, COX-2, 5-LO 및 iNOS 발현억제, 혈중 prostaglandins 생성억제 효과가 복합적으로 관절염 동물모델에 영향을 미친 결과라고 사료된다.
- MIA로 유도한 퇴행성관절염 동물모델에서 CME를 경구투여한 동물의 혈청 prostaglandin 농도(CME 100 mg/kg 체중 투여군 : 1430.05±446.17, CME 400 mg/kg 체중 투여군 : 857.78±254.91)는 ibuprofen을 경구투여한 양성대조군(ibuprofen 20 mg/kg 체중 투여군 : 266.06±176.81)에 비해 높았지만 정제수를 경구투여한 음성대조군(DW 2 mL/rat 투여군 : 2908.15±195.06)의 50% 이하로 감소하였고 CME의 경구투여량에 의존적인 prostaglandins 감소효과를 보였다(Fig. 8).
- MIA로 유도한 퇴행성관절염 동물모델에서 적출한 슬관절을 H&E 염색을 하고 광학현미경으로 200배율에서 관찰한 결과, 정제수를 경구투여한 음성대조군에 비해 양성대조군(ibuprofen 경구투여) 및 실험군(CME 경구투여)에서 MIA에 의한 슬관절 연골의 손상이 감소되었다(Fig. 9).
- 또한, CME는 MIA를 이용한 관절염 동물모델에서 비록 단일물질이며 합성의약품인 ibuprofen보다는 염증과 통증을 유발하는 prostaglandins 감소시키는 효과가 있지 않지만 CME가 천연식물 추출물로 이루어진 복합물질임을 감안하면 매우 우수한 prostaglandins 감소효과가 있다고 판단된다. CME가 MIA에 의해 손상되는 슬관절의 퇴행성 변형을 억제하는 조직학적 실험결과는 CME의 COX-2 활성저해, COX-2, 5-LO 및 iNOS 발현억제, 혈중 prostaglandins 생성억제 효과가 복합적으로 관절염 동물모델에 영향을 미친 결과라고 사료된다.
- 면역세포화학 염색 실험결과, 마우스 대식세포주인 RAW264.7세포 LPS를 이용하여 염증반응을 유도한 다음 세포내 발현이 증가한 COX-2 (Fig. 5), 5-LO (Fig. 6) 및 iNOS (Fig. 7)를 ibuprofen은 발현을 억제하지 않았지만 CME는 효과적으로 발현을 감소시켰다.
- 본 연구소의 선행연구에서 퇴행성관절염 개선제를 개발하기 위해 32종의 천연물을 탐색한 결과, 桑椹子, 桑葉 및 서리태가 퇴행성관절염의 개선에 필요한 여러 조건을 상호보완적으로 충족시킴을 확인하였다. 이에 이들을 배합한 桑椹子추출물 등 복합물(이하, CME)을 대상으로 퇴행성관절염의 개선 효과를 연구하였다.
- 본 연구의 실험결과, CME는 aspirin이나 ibuprofen보다 염증유발 효소인 COX-2를 더 많이 억제하지 못했지만 단일 물질이 아닌 복합물질임을 감안하면 매우 우수한 COX-2 활성저해 효과가 있는 것으로 사료된다.
후속연구
- 면역세포화학염색 실험에서 CME는 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해서 발현이 증가되는 염증유발 효소인 COX-2, 5-LO 및 iNOS의 발현증가를 억제하였는데 이는 CME가 발현된 염증유발 효소들의 활성저해 이전에 ibuprofen과는 달리 세포내 발현단계를 억제함으로써 보다 효과적으로 염증 및 통증을 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.