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문제 정의
- 상심 자의 NO 생성 및 COX-2의 발현 억제, 상엽의 NO, TNF-α 및 IL-1β 생성 억제, 서리태의 Carrageenan으로 급성염증이 유도된 동물모델 족부 부종 억제 등 효과들이 상호보완적으로 항염증효과를 충족시킬 것으로 예상되어 상심자, 상엽, 서리태 추출물을 배합한 상심자추출물 등 복합물을 대상으로 퇴행성관절염의 개선효과를 연구하였다.
제안 방법
- 먼저, FBS와 항생제가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 96well plate에 1 × 10４cells/well로 세포를 분주 후 37℃, 5% CO2항온기에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 후, 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 FBS와 항생제가 함유되지 않은 새로운 배지를 분주한 후 CME를 200 ㎍/mL 의 농도로 처리하였다. 1시간 후 1 ㎍/mL의 농도로 LPS를 첨가하여 24시간 배양하였다.
- 즉, 실험동물 수는 각 군당 10 마리로 하여 체중 300 g-350 g의 흰쥐의 무릎 관절강내로 1 mL 주사기를 사용하여 실험군 (CME 400 ㎎/ 체중 ㎏ 경구투여), 음성대조군 (정제수 경구투여), 양성대조군 (Ibuprofen 20 ㎎/ 체중 ㎏ 경구투여)에는 MIA (40 ㎎/mL)를 50 μL씩 주사하고 Sham군에는 MIA 대신 PBS를 주사하였다. 24시간 후부터 Table 1에 나타낸 바와 같이 각 군별로 정제수 또는 CME 또는 ibuprofen을 14일간 매일 정해진 투여량으로 경구투여하였다.
- Carrageenan 유도 족부 부종억제 실험은 Winter 등 (1962) 의 방법을 응용하여 실험하였다. 즉, SD계 흰쥐를 대상으로 Table 2에 나타낸 바와 같이 각 군의 개체수를 10마리로 하여 시료를 각 농도별로 1일 1회 3일간 경구투여하고 마지막 경구투여 1시간 후 Digimatic micrometer (Mitutoyo Corporation, Kanagawa, Japan)를 사용하여 족부종을 유발하기 전의 족부 두께를 측정하고 1% Carrageenan을 용해한 생리식염수를 100 μL의 양으로 좌측 족저부에 주사하여 족부 부종을 유도하고 5시간 후 다시 족부 두께를 측정하였다.
- Cell culture dish (100 ㎜)에 5 × 10４ cells/mL로 Raw 264.7 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간동안 배양한 후, 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 FBS와 항생제가 함유되지 않은 새로운 배지를 분주하고 CME를 200 ㎍/ mL 및 1,000 ㎍/mL의 농도로 Raw 264.7 세포에 1시간 처리한 후 LPS를 1 ㎍/mL의 농도로 추가로 처리하여 COX-2의 발현을 유도하였다.
- MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 대상으로 TNF-α 또는 IL-1β sandwich ELISA kit (eBiosience, Inc., San Diego, California, USA)을 사용하여 측정하였다.
- 7 and HepG2 cells. RAW 264.7 and HepG2 cells were treated with various concentrations (312.5, 625, 1,250, 2,500, 5,000 ㎍/mL) of CME for 24 hours. Cell viability was measured by MTT assay.
- Spraugue Dauley계 흰쥐에 MIA (Mono sodium iodoacetate, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA)를 무릎 관절강 내 intra-articular injection함으로써 chondrocyte의 metabolism를 저해하고 이로 인해 cartilage, ligament 및 tendon의 손상을 유발시켜 골관절염을 발생시키는 원리를 이용하였다 (Janusz et al., 2001). 즉, 실험동물 수는 각 군당 10 마리로 하여 체중 300 g-350 g의 흰쥐의 무릎 관절강내로 1 mL 주사기를 사용하여 실험군 (CME 400 ㎎/ 체중 ㎏ 경구투여), 음성대조군 (정제수 경구투여), 양성대조군 (Ibuprofen 20 ㎎/ 체중 ㎏ 경구투여)에는 MIA (40 ㎎/mL)를 50 μL씩 주사하고 Sham군에는 MIA 대신 PBS를 주사하였다.
- TBS-T 완충용액으로 3회 세척하고 TBS-T 완충용액에 1/2,000으로 희석한 이차 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, Texas, USA)로 상온에서 1시간 반응시킨 후 TBS-T 완충용액으로 3회 세척하고 화학발광키트 (Pierce, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, Illinois, USA)를 이용하여 X-ray필름에 현상하였고 총 단백질량의 동일성은 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, Texas, USA)의 양으로 검증하였다.
- TNF-α 또는 IL-1β의 양은 ELISA kit에 포함된 표준 재조합 TNF-α 또는 IL-1β의 반응표준곡선을 이용하여 산술비례적으로 구하였다.
- , Dallas, Texas, USA)의 양으로 검증하였다. 각 단백질의 발현량은 ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) 프로그램을 이용하여 정량하였다.
- 먼저, 96 well plate에 코팅되어 있는 anti-rat TNF-α 또는 IL-1β antibody에 혈장에 존재하는 TNF-α 또는 IL-1β를 4℃, 24시간 결합시키고 각 well을 5번 세척한 후 biotin-conjugated anti-rat TNF-α 또는 IL-1β antibody를 상온에서 1시간 반응시킨 후 각 well을 5번 세척하고 streptavidinHRP를 40분간 처리하고 최종적으로 tetramethyl-benzidine으로 발색하여 ELISA reader를 이용해서 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 반응 후 배지를 모두 제거하고 생성된 formazan을 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 200 μL로 10분간 녹인 다음 ELISA reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 본 연구의 퇴행성관절염 동물모델에서 CME의 TNF-α 및 IL-1β 생성억제 효과는 이러한 cytokine에 의해 유도되는 염증반응의 활성화를 CME에 의해 억제시키는 효과를 기대할 수 있게 한다.
- 상심자추출물, 상엽추출물 및 서리태추출물 중 퇴행성관절염 개선에 필요한 항염증효과물질들의 함량을 고려하여 상심자추출물 등 복합물을 제조하였다. 상심자추출물 중 안토시아닌 (ca. 1%), 서리태 추출물 중 이소플라본 (ca. 0.2%), 상엽추출물 중 루틴 (ca. 1%)의 함량을 고려하여 상심자추출 분말 70 g, 상엽추출분말 14 g, 서리태추출분말 16 g을 혼합하여 상심자추출물 등 복합물을 제조하였고 이를 Complex of Mulberry Extract (CME)라 명하였다.
- 상심자추출물, 상엽추출물 및 서리태추출물 중 퇴행성관절염 개선에 필요한 항염증효과물질들의 함량을 고려하여 상심자추출물 등 복합물을 제조하였다. 상심자추출물 중 안토시아닌 (ca.
- )추출물은 서리태를 경상남도 함양농협에서 1 ㎏ 구입하여 다음과 같이 제조하였다. 서리태를 세척 후 서리태의 4배량 (w/v)의 30% 에탄올 수용액으로 60℃에서 4시간, 총 3회 추출한 다음 냉각하고 0.125 ㎜ (80 mesh) 규격의 스테인레스 스틸 거름망을 사용하여 여과하고 여기에서 얻은 여과액을 다시 여과지 (Whatman No. 2)를 사용하여 여과하였다. 얻어진 여액을 60℃에서 30 brix까지 감압 농축하고 여기서 얻어진 농축액을 동결건조하여 서리태 추출분말을 134.
- 즉, SD계 흰쥐를 대상으로 Table 2에 나타낸 바와 같이 각 군의 개체수를 10마리로 하여 시료를 각 농도별로 1일 1회 3일간 경구투여하고 마지막 경구투여 1시간 후 Digimatic micrometer (Mitutoyo Corporation, Kanagawa, Japan)를 사용하여 족부종을 유발하기 전의 족부 두께를 측정하고 1% Carrageenan을 용해한 생리식염수를 100 μL의 양으로 좌측 족저부에 주사하여 족부 부종을 유도하고 5시간 후 다시 족부 두께를 측정하였다.
- 즉, 각 시료를 경구투여한 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 희생하고 채혈 및 혈장분리를 한 다음 혈장내에 존재하는 TNF-α 또는 IL-1β의 농도를 ELISA kit의 제조회사가 제시한 방법을 응용하여 측정하였다.
- 즉, 실험동물 수는 각 군당 10 마리로 하여 체중 300 g-350 g의 흰쥐의 무릎 관절강내로 1 mL 주사기를 사용하여 실험군 (CME 400 ㎎/ 체중 ㎏ 경구투여), 음성대조군 (정제수 경구투여), 양성대조군 (Ibuprofen 20 ㎎/ 체중 ㎏ 경구투여)에는 MIA (40 ㎎/mL)를 50 μL씩 주사하고 Sham군에는 MIA 대신 PBS를 주사하였다.
대상 데이터
- ) Merr.)추출물은 서리태를 경상남도 함양농협에서 1 ㎏ 구입하여 다음과 같이 제조하였다. 서리태를 세척 후 서리태의 4배량 (w/v)의 30% 에탄올 수용액으로 60℃에서 4시간, 총 3회 추출한 다음 냉각하고 0.
- 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 인간 간세포주인 HepG2 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 세포배양을 위해 penicillin (100 IU/mL)과 streptomycin (100 ㎍/mL) 및 10% FBS (Fetal Bovine Serum)를 포함하는 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California, USA)배지를 사용하였다 (Bao et al., 2009).
- 상심자 (Morus alba L.)는 전라북도 부안군 농업기술센터에서 1 ㎏ 구입하였다. 상심자 생과를 식품용 분쇄기를 이용하여 700 rpm으로 5분간 분쇄 후 분쇄된 상심자 즙에 3배량 (w/v)의 40% 에탄올 수용액으로 50℃에서 4시간, 총 3회 추출한 다음 냉각하고 0.
- 상엽 추출물은 상엽을 전라북도 부안군 농업기술센터에서1 ㎏ 구입하여 다음과 같이 제조하였다. 상엽을 정제수로 세척 후 50℃, 24시간 건조하고 식품용 분쇄기를 이용하여 700 rpm으로 5분간 분쇄 후 분쇄된 분말에 4배량 (w/v)의 50% 에탄올 수용액으로 60℃에서 4시간, 총 3회 추출한 다음 냉각하고 0.
- 상온에서 30분간 반응하고 96 well plate에 반응액 200 μL를 옮긴 후, ELISA reader (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, California, USA)를 사용하여 520 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 EGCG (epigallocatechin gallate)와 Vitamin C를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거활성 (%)은 (1-시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가구의 흡광도) × 100의 계산식을 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 3회 반복하여 평균 ± 표준오차 (Mean ± SE)로 나타냈으며, SPSS (version 21) 통계프로그램으로 Student’s ttest를 이용하여 p < 0.05일 때 유의한 것으로 판정하였고, oneway ANOVA를 실시한 후 p < 0.05의 유의수준에서 Duncan’s Multiple Range Text (DMRT)에 의하여 각 실험군의 평균치 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 5, 625, 1,250, 2,500, 5,000 ㎍/mL) of CME for 24 hours. Cell viability was measured by MTT assay. Data were obtained from three independent experiments and are expressed as the mean ± SE.
- DPPH radical 소거능의 측정은 Blios (1958)의 방법에 의해 실행되었다. 각 농도별 시료 75 μL를 에탄올에 0.
- DPPH 라디칼 소거활성 (%)은 (1-시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가구의 흡광도) × 100의 계산식을 사용하였다.
- RAW 264.7 세포와 HepG2에 대한 CME의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. CME를 농도별 (312.
- Raw264.7 세포와 HepG2 세포에 대한 CME의 독성 측정은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)법을 실시하여 측정하였다 (Sladowski et al., 1993). Raw 264.
- 각 시료가 염증유발 물질인 NO의 생성을 억제하는 효과는 마우스 대식세포 유래의 Raw 264.7 세포에 Lipopolysaccharide (LPS)를 처리함으로써 배양액에서 생성되는 NO의 안정화된 형태인 NO2-의 농도를 Griess 반응을 이용하여 측정하였다(Kwak et al., 2008). 먼저, FBS와 항생제가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 96well plate에 1 × 10４cells/well로 세포를 분주 후 37℃, 5% CO2항온기에서 24시간동안 배양하였다.
성능/효과
- CME 100 ㎎/㎏체중 투여군의 TNF-α는 1.13 ± 0.14 ng/ mL로서 대조군에 비해 63.7% 억제된 것으로 나타났다.
- Fig. 5에 나타낸 바와 같이 정제수를 3일간 경구투여하고 Carrageenan으로 급성염증을 유도한 음성대조군의 경우, Carrageenan 주사 5시간 후 족부 부종율은 149.20 ± 7.50%이었으며 ibuprofen을 20 ㎎/㎏체중, 3일간 경구투여한 양성대조군의 경우, 족부 부종율은 110.15 ± 8.07%이었고 CME를 100 또는 400 ㎎/㎏체중, 3일간 경구투여한 실험군의 경우, 족부 부종율은 각각 118.14 ± 5.76% 및 106.94 ± 6.26%로 나타났다.
- RAW 264.7 세포에서 LPS를 처리하여 생성된 염증유발물질인 NO는 LPS 처리 후 PBS를 처리한 음성대조군의 경우 144.22 ± 16.48 μM이었으며 LPS 처리 후 CME를 200 ㎍/mL 처리한 경우 45.79 ± 4.81 μM로 나타나 음성대조군에 대비하여 약 68.25% NO 생성억제 효과를 보였다 (Table 4).
- 선행 연구로부터 식용 가능한 천연물 중에서 항산화 및 항염증 효과가 뛰어난 32종의 천연물을 탐색한 결과, 상심자, 상엽 및 서리태가 퇴행성관절염의 개선효과가 탁월하였다. 상심 자의 NO 생성 및 COX-2의 발현 억제, 상엽의 NO, TNF-α 및 IL-1β 생성 억제, 서리태의 Carrageenan으로 급성염증이 유도된 동물모델 족부 부종 억제 등 효과들이 상호보완적으로 항염증효과를 충족시킬 것으로 예상되어 상심자, 상엽, 서리태 추출물을 배합한 상심자추출물 등 복합물을 대상으로 퇴행성관절염의 개선효과를 연구하였다.
- 즉, MIA를 처리하고 정제수를 14일간 경구투여한 음성대조군의 경우, 혈중 TNF-α 및 IL-1β는 각각 2.57 ± 0.15 ng/mL 및 1.33 ± 0.25 ng/mL이었으며 관절염 치료제로 사용되는 합성의약품인 ibuprofen을 20 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로 14일간 경구투여한 경우, 1.93 ± 0.16 ng/mL 및 1.34 ± 0.14 ng/mL으로 미미한 TNF-α 및 IL-1β 감소효과를 보였으나 CME를 400 ㎎/㎏체중의 투여량으로 14일간 경구투여한 경우, 각각 0.82 ± 0.03 ng/mL 및 0.29 ± 0.09 ng/mL으로 현저한 TNF-α 및 IL-1β 감소효과를 보였다.
후속연구
- Botting (2006)에 의하면 활성화된 macrophages에서 발현이 증가된 COX-2에 의해 생성된 PGE2가 혈관확장, 발열 및 통증을 유발하고 관절염이나 다발성 경화증과 같은 질병을 야기하거나 악화시킨다. CME는 이러한 COX-2의 발현을 억제함으로써 PGE2의 생성을 감소시켜 관절염과 같은 염증성 질환의 악화를 방지할 것으로 기대된다.
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