젖산 생성능이 우수한 김치 유래 젖산균의 분리 및 두유 발효 특성 Isolation and Identification of Lactic acid Producing Bacteria from Kimchi and Their Fermentation Properties of Soymilk원문보기
본 연구는 경기도 일대의 배추김치로부터 젖산 생성능이 우수한 젖산균주 분리 및 두유 발효 특성에 대해 조사하였다. 먼저 0.01% bromocresol green이 첨가된 MRS한천 배지에서 clear zone의 size 측정을 통하여 우수한 젖산 생성능을 갖는 균주를 선발 후 탄수화물 이용성 조사 및 16S rRNA 염기서열 분석으로 L. plantarum Gk04, Ped. pentosaceus Gk07, L. brevis Gk35 및 L. curvatus Gk36이 동정되었으며 특히 99%의 상동성을 갖는 L. curvatus Gk36을 두유발효를 위한 최종균주로 사용하였다. L. curvatus Gk36과 시판 균주 L. actobacillus에 의한 두유 발효 결과 pH는 L. actobacillus에서 유의적으로 더 낮은 것으로 나타났으나 생균수 및 산도 측정 결과 두 균주간에 유의적 차이가 없는 것으로 나타나 L. curvatus Gk36 균주는 두유발효 등 발효제품 제조를 위한 젖산균 균주로 이용이 가능할 것으로 판단되었다.
본 연구는 경기도 일대의 배추김치로부터 젖산 생성능이 우수한 젖산균주 분리 및 두유 발효 특성에 대해 조사하였다. 먼저 0.01% bromocresol green이 첨가된 MRS 한천 배지에서 clear zone의 size 측정을 통하여 우수한 젖산 생성능을 갖는 균주를 선발 후 탄수화물 이용성 조사 및 16S rRNA 염기서열 분석으로 L. plantarum Gk04, Ped. pentosaceus Gk07, L. brevis Gk35 및 L. curvatus Gk36이 동정되었으며 특히 99%의 상동성을 갖는 L. curvatus Gk36을 두유발효를 위한 최종균주로 사용하였다. L. curvatus Gk36과 시판 균주 L. actobacillus에 의한 두유 발효 결과 pH는 L. actobacillus에서 유의적으로 더 낮은 것으로 나타났으나 생균수 및 산도 측정 결과 두 균주간에 유의적 차이가 없는 것으로 나타나 L. curvatus Gk36 균주는 두유발효 등 발효제품 제조를 위한 젖산균 균주로 이용이 가능할 것으로 판단되었다.
Lactic acid bacteria were selected on the basis of lactic acid producing ability from kimchi, a traditional Korean fermented food. Among the initial screening of over 150 strains selected from the sample, 27 strains were selected as lactic acid producing bacteria, and 4 strains were finally selected...
Lactic acid bacteria were selected on the basis of lactic acid producing ability from kimchi, a traditional Korean fermented food. Among the initial screening of over 150 strains selected from the sample, 27 strains were selected as lactic acid producing bacteria, and 4 strains were finally selected based on their ability to produce relatively high levels of lactic acid. The four strains were identified as Lactobacillus (L.) plantarum Gk04, Pediococcus pentosaceus Gk07, L. brevis Gk35 and L. curvatus Gk36 by the conventional morphological, cultural, physiological and biochemical characteristics, as well as by 16S rRNA sequence analysis. Among the identified lactic acid bacteria, L. curvatus Gk36 was used for soymilk fermentation. The viable cell counts and acidity values measured for the L. curvatus Gk36 were comparable to the commmercial L. acidopillus. Thus, the L. curvatus Gk36 is a potential probiotic strain to prepare fermented soy products, such as kephir, yogurt, tempeh and soy sauce.
Lactic acid bacteria were selected on the basis of lactic acid producing ability from kimchi, a traditional Korean fermented food. Among the initial screening of over 150 strains selected from the sample, 27 strains were selected as lactic acid producing bacteria, and 4 strains were finally selected based on their ability to produce relatively high levels of lactic acid. The four strains were identified as Lactobacillus (L.) plantarum Gk04, Pediococcus pentosaceus Gk07, L. brevis Gk35 and L. curvatus Gk36 by the conventional morphological, cultural, physiological and biochemical characteristics, as well as by 16S rRNA sequence analysis. Among the identified lactic acid bacteria, L. curvatus Gk36 was used for soymilk fermentation. The viable cell counts and acidity values measured for the L. curvatus Gk36 were comparable to the commmercial L. acidopillus. Thus, the L. curvatus Gk36 is a potential probiotic strain to prepare fermented soy products, such as kephir, yogurt, tempeh and soy sauce.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 두유의 영양학적 가치를 높이기 위한 기초연구로서 한국의 전통 발효식품인 김치로부터 젖산 발효도와 성장력이 우수한 균주를 분리 및 동정하였으며, 분리균주 및 시판균주를 이용하여 두유의 발효 특성에 대한 연구를 수행하였다.
본 연구는 경기도 일대의 배추김치로부터 젖산 생성능이 우수한 젖산균주 분리 및 두유 발효 특성에 대해 조사하였다. 먼저 0.
제안 방법
분리세균의 특성조사는 그람염색 후 광학현미경(BX60, Olympus, Tokyo, Japan)을 통한 형태학적 관찰, catalase 활성여부 및 API 50 CHL kit(BioMérieux sa, Marcy I'Etoile, Lyon, France)에 의한 50여종의 탄수화물 이용성을 확인하였다. API 50 CHL 실험에 의한 strip의 판독은 각 tube의 색 변화로 negative(-), positive(+) 등으로 판정 하였으며 API 50 CHL database를 이용하여 동정하였다.
콩은 5℃에서 24시간 불려 껍질을 제거하고 물기를 제거한 대두의 15배(v/w)가 되도록 증류수를 가한 후 분쇄하였으며 여과한 두유를 80℃에서 30분간 저온살균하여 사용하 였다. 두유의 발효는 살균한 두유를 냉각시킨 후 전배양한 젖산균을 1% 접종하여 30℃에서 24시간 동안 정치배양하면서 3시간 간격으로 시료를 채취하여 분석하였다.
분리세균의 특성조사는 그람염색 후 광학현미경(BX60, Olympus, Tokyo, Japan)을 통한 형태학적 관찰, catalase 활성여부 및 API 50 CHL kit(BioMérieux sa, Marcy I'Etoile, Lyon, France)에 의한 50여종의 탄수화물 이용성을 확인하였다.
선발균주는 MRS 액체배지에서 24시간 배양하여 genomic DNA를 추출(SolGent TM Cenomic DNA Prep kit, Solgent Co., Ltd., Daejeon, Korea) 후 ribosomal RNA gene 증폭을 위하여 universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 사용 하였으며 염기서열은 ABI PrismTM BigdyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit v3.1(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)와 ABI 3730XL capillary DNA Sequencer(Applied Biosystems)를 사용하여 (주) Solgent에서 염기서열을 분석하였다.
선발균주의 동정은 16S rRNA의 염기서열 결정 및 상동성 검색을 통하여 실시하였다. 선발균주는 MRS 액체배지에서 24시간 배양하여 genomic DNA를 추출(SolGent TM Cenomic DNA Prep kit, Solgent Co.
1(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)와 ABI 3730XL capillary DNA Sequencer(Applied Biosystems)를 사용하여 (주) Solgent에서 염기서열을 분석하였다. 염기서열 결정은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)와 EzTaxon server 2.1(http://147.47.212.35:8080/)에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 가장 높은 상동성을 나타내는 분류군을 해당 염기서열에 해당하는 bacteria로 결정하였으며, PHYLIP package(12)의 Dnadist와 Neighbor program에 기초해서 계통도를 나타내었다.
종 수준까지의 정확한 동정을 위하여 분자생물학적 기술을 이용한 각 균주의 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 상동성을 비교하였다. 일반 분류학상으로 97% 이상의 염기 서열 상동성을 나타내는 균주들의 경우 하나의 종으로 정의할 수 있는데 분석결과 Table 3에 나타낸 바와 같이 97~ 99%의 상동성을 나타내었으며 각각 L.
, Tokyo, Japan)하여 생육곡선을 작성하였으며, 생육에 따른 산도는 AACC method 02-31(13)에 따라 적정 산도를 측정하였다. 즉 배양액 10 mL를 동량의 증류수를 넣고 균질화한 후 1.0% phenolphthalein 지시약을 가하여 0.1 N NaOH 용액 으로 적정하여 소비된 NaOH 용액의 부피를 산도로 환산하여 계산하였다.
대상 데이터
plantarum Gk04, Ped. pentosaceus Gk07, L. brevis Gk35 및 L. curvatus Gk36이 동정되었으며 특히 99%의 상동성을 갖는 L. curvatus Gk36을 두유발효를 위한 최종균주로 사용하였다. L.
경기도 일대의 각 가정에서 수집한 배추김치 전체를 마쇄한 후 멸균 거즈로 여과한 액을 유효 균주 분리를 위한 시료로 사용하였다. 시료를 희석한 후 0.
01% bromocresol green이 첨가된 MRS(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 한천배지에 도말하여 30℃에 48시간 배양하였다. 균주의 생육과정에서 산을 생성하여 노란색을 띠는 균주를 선별하였으며 MRS 평판배지에 3회에 걸쳐 순수배양하여 형성된 colony 중에서 투명환(clear zone)이 가장 큰 4개의 균주를 선발하였고 -70℃에 보존하면서 실험에 사용하였다.
Lactobacillus 및 Pediococcus 속은 김치와 같은 발효된 야채나 과일에 존재하는 젖산균으로 일반적으로 Lactobacillus 속의 젖산균은 발효 유제품에서도 확인되는 반면, Pediococcus 속 젖산균은 유제품에는 잘 이용되지 않으며 된장이나 간장 양조에 중요한 젖산균으로 알려져 있다. 본 연구에서는 유제품 제조에 주로 이용되는 Lactobacillus 속 중 젖산 생성능이 상대적으로 우수한 L. curvatus Gk36을 두유 발효를 위한 최종균주로 사용하였으며 이 균주의 유전학적 계통수(phylogenetic tree)는 Fig. 2에 나타내었다.
1) 후의 활성도를 clear zone의 크기로 측정한 결과 Table 1에 나타낸 바와 같이 총 27종의 젖산생성 균주를 얻었다. 이중 상대적으로 성장 속도가 빠르고 clear zone의 크기가 9 mm 이상인 Gk04, Gk07, Gk35 및 Gk36을 젖산생성 능력이 우수한 균주로 선발하였다.
데이터처리
모든 분석결과는 SPSS program(SPSS, version 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계처리 하였으며 5% 수준에서 분산분석(ANOVA)을 이용한 Duncan의 다중범위검정 또는 Student's t-test를 실시하여 유의적 차이를 검정하였다.
이론/모형
분리 균주를 37℃에서 정치배양하면서 3시간 간격으로 시료를 채취하여 600 nm에서 흡광도를 측정(UV-1601 UV-Vis Spectrophotometer, Shimadzu Co. Ltd., Tokyo, Japan)하여 생육곡선을 작성하였으며, 생육에 따른 산도는 AACC method 02-31(13)에 따라 적정 산도를 측정하였다. 즉 배양액 10 mL를 동량의 증류수를 넣고 균질화한 후 1.
성능/효과
acidophillus KCTC 3168을 이용하여 발효시간에 따른 생균수, pH 및 산도를 경시적으로 관찰한 결과는 Table 4와 같다. L. curvatus Gk36 균주의 생균 수는 접종 초기 6.29 log CFU/mL에서 발효 24시간 후 8.41 log CFU/mL까지 증가하였으며, L. acidophillus KCTC 3168의 생균수는 접종 초기 6.46 log CFU/mL에서 발효 24시간 후 8.15 log CFU/mL로 나타났으나 두 균주간에 유의적 차이는 없었다. pH는 L.
curvatus Gk36을 두유발효를 위한 최종균주로 사용하였다. L. curvatus Gk36과 시판 균주 L. actobacillus에 의한 두유 발효 결과 pH는 L. actobacillus에서 유의적으로 더 낮은 것으로 나타났으나 생균수 및 산도 측정 결과 두 균주간에 유의적 차이가 없는 것으로 나타나 L. curvatus Gk36 균주는 두유발효 등 발효 제품 제조를 위한 젖산균 균주로 이용이 가능할 것으로 판단 되었다.
4와 같다. 각 온도에서 24시간 배양 후 균체의 생육정도를 측정한 결과 25℃ 및 30℃에서 유의적으로 가장 높게 나타났으며 배양액의 pH를 측정한 결과는 45℃ 에서 유의적으로 가장 높게 나타났으며 25, 30 및 37℃에서는 유의적으로 차이를 보이지 않았다. 산도 측정 결과는 pH 값과 반대 경향을 보였으며 45℃에서 가장 낮게 나타나 균생장 및 산 생성정도를 고려한다면 L.
3과 같다. 균체의 생육은 배양 6~15시간에 증가폭이 가장 크게 나타났으나 배양 15 시간 이후부터는 증가폭이 둔화되었고, 24시간 이후에는 균의 생장에 변화가 거의 없음을 알 수 있었다(Fig. 3A). 배양액의 pH는 초기 6.
김치시료로부터 분리한 균주의 동정을 위해 그람염색에 의한 형태, catalase 생성여부 및 49개의 탄소원에 대한 이용성 차이로 동정하는 생화학적인 방법인 API test결과는 Table 2에 나타내었으며 동정용 프로그램을 이용하여 해석한 결과, Gk04는 L. plantarum과 93.8%, Gk07은 Pediococcus(Ped.) pentosaceus와 99.8%, Gk35는 L. brevis와 98.5%, Gk36은 L. curvatus와 98.5% 유사한 것으로 판정되었다.
김치시료로부터 약 150여종의 균주를 1차 선별한 후 0.01% bromocresol green이 첨가된 MRS 한천 배지에 천자배양 하여 젖산 생성균이 생성한 산에 의해 노란색의 clear zone을 형성하는 총 36 colony의 젖산 생성균을 분리하여 이들을 각각 Gk01에서 Gk36으로 명명하고, 각 colony에 대하여 젖산생성 선별배지에 toothpick 기법으로 접종하여 24시간 및 48시간 배양(Fig. 1) 후의 활성도를 clear zone의 크기로 측정한 결과 Table 1에 나타낸 바와 같이 총 27종의 젖산생성 균주를 얻었다. 이중 상대적으로 성장 속도가 빠르고 clear zone의 크기가 9 mm 이상인 Gk04, Gk07, Gk35 및 Gk36을 젖산생성 능력이 우수한 균주로 선발하였다.
각 온도에서 24시간 배양 후 균체의 생육정도를 측정한 결과 25℃ 및 30℃에서 유의적으로 가장 높게 나타났으며 배양액의 pH를 측정한 결과는 45℃ 에서 유의적으로 가장 높게 나타났으며 25, 30 및 37℃에서는 유의적으로 차이를 보이지 않았다. 산도 측정 결과는 pH 값과 반대 경향을 보였으며 45℃에서 가장 낮게 나타나 균생장 및 산 생성정도를 고려한다면 L. curvatus의 최적 배양 온도는 25~30℃임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Kask 등(18)과 Mataragas 등(19)이 각각 Estonian semi-hard cheese 및 Greek dry fermented salami에서 분리한 L.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
식품에서 젖산균의 역할은 무엇인가?
젖산균은 오랫동안 산업적으로 이용되어 온 중요한 균주중 하나로 자연계에 널리 분포하고 있으며 인간의 장내에서 정상균총을 형성하는 그람양성의 구균 또는 간균으로 catalase 음성을 나타낸다. 이러한 젖산균은 유가공품과 발효식 품인 김치, 된장, 간장 등에서 풍미를 향상시키고, bacteriocin과 같은 미생물 생육억제물질과 다량의 젖산을 생성하여 식품 내의 부패균 성장을 억제하는 등 식품의 보존성과 안전성 향상에 기여하고 있다(6-8). 특히 김치는 배추나 무를 주원료로 마늘, 생강, 고춧가루 등 다양한 향신료를 첨가하여 발효시킨 한국 전통의 발효식품으로(9,10), 김치 발효에 관여하는 주발효균인 젖산균은 발효초기에는 Leuconostoc 속이 우세하게 증식하며 발효후기에는 Lactobacillus 속이 왕성하게 증식하는 것으로 알려져 있다(11).
젖산균이란 무엇인가?
젖산균은 오랫동안 산업적으로 이용되어 온 중요한 균주중 하나로 자연계에 널리 분포하고 있으며 인간의 장내에서 정상균총을 형성하는 그람양성의 구균 또는 간균으로 catalase 음성을 나타낸다. 이러한 젖산균은 유가공품과 발효식 품인 김치, 된장, 간장 등에서 풍미를 향상시키고, bacteriocin과 같은 미생물 생육억제물질과 다량의 젖산을 생성하여 식품 내의 부패균 성장을 억제하는 등 식품의 보존성과 안전성 향상에 기여하고 있다(6-8).
L. curvatus의 생육은 배양시간에 따라 어떻게 변화하는가?
3과 같다. 균체의 생육은 배양 6~15시간에 증가폭이 가장 크게 나타났으나 배양 15 시간 이후부터는 증가폭이 둔화되었고, 24시간 이후에는 균의 생장에 변화가 거의 없음을 알 수 있었다(Fig. 3A).
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