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문제 정의
- 기존의 L. buchneri 관련 연구는 신경 전달 물질인 GABA 의 생산[4]과 사료에 균을 직접 첨가하여 저장성을 향상시키는 것[5]이 주를 이루었으나 본 연구에서는 김치에서 분리된 L. buchneri 균주를 이용하여 오탄당인 자일로스를 탄소 원으로 이용하여 유용물질인 젖산을 생산하는 기초연구를 수행하였다. 본 연구를 통해 L.
- 본 연구에서는 전통 발효식품인 김치로부터 젖산 생산 능이 우수한 젖산균을 분리하고 자일로스를 이용한 젖산 생산 특성에 대하여 조사하였다.
제안 방법
- 고농도의 자일로즈에서 젖산생산능이 우수한 균주를 선별하기 위하여 분리한 젖산균을 자일로스가 50 g/l로 함유된 5ml의 MRS배지에 접종하고 30oC에서 96시간 동안 배양한 후, 젖산생산능을 평가하였다. 젖산생산능이 우수하였던 8점의 젖산균을 선발하여 이후의 실험을 진행하였다.
- 분리 및 동정하였다. 동정된 젖산균 중에서 5 ml 배양 규모에서 젖산 생산량이 우수한 것으로 나타난 Lactobacillus rhamnosus MBE907, L. buchneri MBE909, L. brevis MBE929, L. parabuchneri MBE936, L. fermentum MBE937, L. harbinensis MBE912, L. perolens MBE913, 및 L. sakei MBE917로 명명된 균주들의 젖산생산량을 평가하였다.
- 선발된 젖산균을 자일로스가 50 g/l 농도로 첨가된 MRS 를 사용하여 호기적 또는 혐기적 조건에서의 균체성장과 젖산생산량을 조사하였다(Fig. 1). 시험에 사용한 8점의 젖산균 중에서 L.
- 측정하였다. 자일로스 농도에 따른 젖산생산량을 비교하기 위하여 자일로스가 각각 20, 50, 100, 150 g/l의 농도로 첨가된 MRS 배지를 사용하였으며 일정 시간마다 배양액을 회수하여 균체농도 및 젖산 농도를 측정하였다.
- 자일로스가 50 g/l의 농도로 첨가된 MRS 배지를 사용하여 배양온도를 25, 30, 37, 42oC로 설정하고 혐기적인 조건에서 배양하면서 균체성장 및 젖산 생산량을 비교하였다 (Table 1). 배양온도가 25oC인 경우 균체성장이 1.
- 젖산 및 자일로스 농도는 Rezex ROA-Organic Acid H+ (Phenomenex, USA) 컬럼이 장착된 HPLC(Shimadzu, Japan)를 사용하였다. 이동상은 0.
- 전통발효식품을 수집하였다. 젖산균을 순수분리하기 위하여 채취된 시료를 멸균된 생리식염수(0.85% NaCl)에 현탁한 후, 적정 농도로 희석하여 자일로스(Sigma-Aldrich, USA)가 20 g/l의 농도로 함유된 MRS (proteose peptone 10 g/l, yeast extract 5 g/l, beef extract 10 g/l, polysorbate 80g/l, ammonium citrate 2 g/l, sodium acetate 1 g/l, manganese sulfate 0.05 g/l, dipotassium phosphate 1.83g/l, xylose 20 g/l) 평판배지에 도말한 후 30oC에서 48시간 배양하여 단일집락을 확보하였다.
- 젖산생산을 위한 최적의 자일로스 농도를 결정하기 위하여 혐기적인 조건에서 배양온도를 37oC로 설정하고 자일로스 농도를 20, 50, 100, 150 g/l로 첨가한 MRS 배지를 이용하여 균체성장과 젖산생산성을 조사하였다(Table 2). 자일로스를 20 g/l 농도로 첨가한 경우 배양초기에 주입한 자일로스는 균체에 의하여 모두 소모되었으며 젖산생산량은 15.
- 분리한 젖산균의 16S rRNA 유전자의 증폭은 518F(5'- CCAGCAGCCGCGGTAATACG)와 800R(5'-TACCAGGGT ATCTAATCC) 프라이머를 이용하였다[2]. 증폭한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 확보한 후 National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA)의 BLAST를 사용하여 타 균주와의 유전자 단편의 상동성을 근거로 동정하였다[12].
- 최적 배양 온도를 설정하기 위하여 25, 30, 37, 42oC에서 50 g/l의 자일로스가 첨가된 200 ml의 MRS 배지를 사용하여 Lactobacillus buchneri를 혐기적으로 배양하고 젖산생산량을 측정하였다. 자일로스 농도에 따른 젖산생산량을 비교하기 위하여 자일로스가 각각 20, 50, 100, 150 g/l의 농도로 첨가된 MRS 배지를 사용하였으며 일정 시간마다 배양액을 회수하여 균체농도 및 젖산 농도를 측정하였다.
- , Korea)를 이용하여 30oC에서 200 rpm으로 24시간 동안 전배양하였다. 흡광광도계(GE Healthcare, Sweden)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하고 원심분리하여 적정량의 세포를 회수한 후 멸균 증류수로 3회 세척하고 50 g/l의 자일로스가 첨가된 100 ml의 MRS 배지에 초기 흡광도가 0.1이 되도록 접종하였다. 호기적 배양은 baffled flask(DURAN, Germany)를 사용하여 200 rpm으로교반하였고, 혐기적 배양은 oxyrase(bioWORLD, USA)를 2%(v/v)의 농도로 첨가된 배지를 screw cap baffled flask (SPL, Korea)에 넣어 밀봉한 후 50 rpm으로 교반하였다.
대상 데이터
- 전국에서 수집한 전통발효 식품으로부터 313점의 젖산균을 분리 및 동정하였다. 동정된 젖산균 중에서 5 ml 배양 규모에서 젖산 생산량이 우수한 것으로 나타난 Lactobacillus rhamnosus MBE907, L.
- 젖산생산능을 평가하였다. 젖산생산능이 우수하였던 8점의 젖산균을 선발하여 이후의 실험을 진행하였다.
- 젖산생산능이 우수한 균주를 확보하기 위하여 전국에서 44점의 전통발효식품을 수집하였다. 젖산균을 순수분리하기 위하여 채취된 시료를 멸균된 생리식염수(0.
- 그 외의 균주들은 호기적, 혐기적 조건 모두 균체성장 및 젖산생산 수준이 유사하였다. 젖산생산량이 가장 우수한 L. buchneri MBE909를 이용하여 이후의 실험을 진행하였다.
데이터처리
- 6 ml/ min의 유속으로 사용하였으며, 굴절률 검출기(Refractive Index Detector, Shimadzu, Japan)를 사용하였다. 모든 측정은 3회 반복하였으며 통계처리는 SPSS 21(IBM, USA)을이용하였으며, Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s multiple range test)으로 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 분리한 젖산균의 염색체 DNA는 5 ml의 MRS 액체배지에서 48시간 배양한 후 Park 등의 방법[12]으로 추출하였다. 분리한 젖산균의 16S rRNA 유전자의 증폭은 518F(5'- CCAGCAGCCGCGGTAATACG)와 800R(5'-TACCAGGGT ATCTAATCC) 프라이머를 이용하였다[2].
성능/효과
- buchneri 균주를 이용하여 오탄당인 자일로스를 탄소 원으로 이용하여 유용물질인 젖산을 생산하는 기초연구를 수행하였다. 본 연구를 통해 L. buchneri MBE909는 자일로스를 효율적으로 대사하여 젖산을 생성한다는 것을 확인하였으며, 혐기적인 조건의 배양온도 37oC에서 초기 자일로스 농도가 50 g/l일 때 상대적으로 가장 우수한 젖산생성능을 나타내었다. 배지최적화 및 균주개량을 통하여 젖산 생산성이추가적으로 향상된다면 생물산업적 관점에서 높은 활용 성이 기대된다.
- 1). 시험에 사용한 8점의 젖산균 중에서 L. buchneri MBE909는 혐기적 배양조건에서 가장 우수한 젖산생산량(21.52±0.05 g/l)을 나타냈으며, 균체 성장 또한 1.67±0.04 g/l로 가장 우수하였다. L.
- 20 g/l로서 상대적으로 가장 낮은 값을 나타났다. 자일로스가 50 g/l의 농도로 첨가되었을 시, 젖산생산량은 22.27±0.30 g/l로 가장 우수하였으며 31.84±1.28 g/l의 자일로스를 소모하여 약 85%의 수율을 나타내었다. 초기 자일로스 농도를 100 g/l로 증가시킨 경우 젖산생산량이 22.
- 34 g/l로 나타났다. 초기 자일로스 농도가 150g/l 인 경우는 젖산생산량이 17.97±0.21 g/l로 50 g/l, 100 g/l의 자일로스를 사용하였을 때보다 감소하였으며 소모한 자일로스 대비 생산된 젖산의 수율이 약 74%로서 모든 실험구 중 가장 낮게 나타났다. 균체성장은 사용한 초기 자일로스 농도에 따라 유의적인 차이가 없었다.
후속연구
- buchneri MBE909는 자일로스를 효율적으로 대사하여 젖산을 생성한다는 것을 확인하였으며, 혐기적인 조건의 배양온도 37oC에서 초기 자일로스 농도가 50 g/l일 때 상대적으로 가장 우수한 젖산생성능을 나타내었다. 배지최적화 및 균주개량을 통하여 젖산 생산성이추가적으로 향상된다면 생물산업적 관점에서 높은 활용 성이 기대된다.
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