김치에서 분리된 Leuconostoc 속 젖산균의 ${\\beta}$-1,4-xylosidase 효소생산 특성 ${\\beta}$-1,4-Xylosidase Activity of Leuconostoc Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi원문보기
[ ${\beta}$ ]Xylosidase 효소활성이 높은 균주를 선발하기 위하여 다양한 김치에서 분리된 Leuconostoc 속 젖산균의 ${\beta}$-xylosidase 활성을 탐색하였다. 김치에서 분리된 55개의 Leuconostoc 속 젖산균 중 36개의 균주만이 자일로스를 탄소원으로 이용하였으며, 배추김치에서 분리된 Leu. lactis KCTC 13344 균주가 가장 높은 세포내 ${\beta}$-xylosidase 효소활성을 나타내었으며, 효소활성은 pH 6, $30^{\circ}C$ 반응조건에서 가장 높게 나타났다. $Zn^{2+}$을 제외한 금속이온은 효소활성을 유의적으로 증가시켰으며, $Fe^{2+}$은 1 mM의 농도에서 ${\beta}$-xylosidase 대조구와 비교하여 효소활성을 약 40% 증가시켰다. 균주를 배양할 때 사용한 탄소원 중 자일로스가 가장 높은 효소활성을 나타내었고, 효소활성을 위한 최적의 자일로스 농도는 30 g/L였다. 단백질 전기영동 및 활성염색을 수행한 결과 분자량이 약 64 kDa인 Leu. lactis KCTC 13344 균주의 ${\beta}$-xylosidase는 자일로스에 의하여 발현이 유도되는 것으로 추정되었다. 자일로스가 30 g/L의 농도로 첨가된 MRS 배지에서 Leu. lactis KCTC 13344 균주의 성장은 20시간 후에 최고에 도달하였고, ${\beta}$-xylosidase 효소활성은 16시간 후에 최대 $7.1{\pm}0.3units/mL$이었다. 배양 초기에 주입한 자일로스는 약 20% 정도 소모하였고, 젖산과 아세트산은 3.0 g/L 수준으로 생성되었지만 에탄올은 생성되지 않았다.
[ ${\beta}$ ]Xylosidase 효소활성이 높은 균주를 선발하기 위하여 다양한 김치에서 분리된 Leuconostoc 속 젖산균의 ${\beta}$-xylosidase 활성을 탐색하였다. 김치에서 분리된 55개의 Leuconostoc 속 젖산균 중 36개의 균주만이 자일로스를 탄소원으로 이용하였으며, 배추김치에서 분리된 Leu. lactis KCTC 13344 균주가 가장 높은 세포내 ${\beta}$-xylosidase 효소활성을 나타내었으며, 효소활성은 pH 6, $30^{\circ}C$ 반응조건에서 가장 높게 나타났다. $Zn^{2+}$을 제외한 금속이온은 효소활성을 유의적으로 증가시켰으며, $Fe^{2+}$은 1 mM의 농도에서 ${\beta}$-xylosidase 대조구와 비교하여 효소활성을 약 40% 증가시켰다. 균주를 배양할 때 사용한 탄소원 중 자일로스가 가장 높은 효소활성을 나타내었고, 효소활성을 위한 최적의 자일로스 농도는 30 g/L였다. 단백질 전기영동 및 활성염색을 수행한 결과 분자량이 약 64 kDa인 Leu. lactis KCTC 13344 균주의 ${\beta}$-xylosidase는 자일로스에 의하여 발현이 유도되는 것으로 추정되었다. 자일로스가 30 g/L의 농도로 첨가된 MRS 배지에서 Leu. lactis KCTC 13344 균주의 성장은 20시간 후에 최고에 도달하였고, ${\beta}$-xylosidase 효소활성은 16시간 후에 최대 $7.1{\pm}0.3units/mL$이었다. 배양 초기에 주입한 자일로스는 약 20% 정도 소모하였고, 젖산과 아세트산은 3.0 g/L 수준으로 생성되었지만 에탄올은 생성되지 않았다.
The ${\beta}$-xylosidase (EC 3.2.1.37) production capabilities of lactic acid bacteria in the genus Leuconostoc, isolated from a variety of kimchi (fermented vegetables), were examined. The intracellular levels of ${\beta}$-xylosidase were similar to the extracellular levels, w...
The ${\beta}$-xylosidase (EC 3.2.1.37) production capabilities of lactic acid bacteria in the genus Leuconostoc, isolated from a variety of kimchi (fermented vegetables), were examined. The intracellular levels of ${\beta}$-xylosidase were similar to the extracellular levels, when most Leuconostoc lactic acid bacteria were grown in a medium containing xylose as the carbon source. Intracellular ${\beta}$-xylosidase with a maximum activity of $1.2{\pm}0.1units/mL$ (mean${\pm}$standard error) was obtained from Leuconostoc lactis KCTC 13344, which was isolated from fermented Chinese cabbage. The optimum reaction conditions for Leu. lactis KCTC 13344 ${\beta}$-xylosidase activity were pH 6.0 and $30^{\circ}C$, and the addition of most divalent cations, except zinc, to the reaction mixture resulted in a slight increase in enzyme activity. Compared with a media containing other carbon sources, the ${\beta}$-xylosidase activity was 5 times higher when Leu. lactis KCTC 13344 was grown in a medium containing xylose as carbon source. Zymographic analysis indicated that the synthesis of Leu. lactis KCTC 13344 ${\beta}$-xylosidase (approximate size, 64 kDa) is induced by xylose. A maximum intracellular ${\beta}$-xylosidase activity of $7.1{\pm}0.3units/mL$ was obtained in a batch cultivation in an MRS medium containing 30 g/L xylose.
The ${\beta}$-xylosidase (EC 3.2.1.37) production capabilities of lactic acid bacteria in the genus Leuconostoc, isolated from a variety of kimchi (fermented vegetables), were examined. The intracellular levels of ${\beta}$-xylosidase were similar to the extracellular levels, when most Leuconostoc lactic acid bacteria were grown in a medium containing xylose as the carbon source. Intracellular ${\beta}$-xylosidase with a maximum activity of $1.2{\pm}0.1units/mL$ (mean${\pm}$standard error) was obtained from Leuconostoc lactis KCTC 13344, which was isolated from fermented Chinese cabbage. The optimum reaction conditions for Leu. lactis KCTC 13344 ${\beta}$-xylosidase activity were pH 6.0 and $30^{\circ}C$, and the addition of most divalent cations, except zinc, to the reaction mixture resulted in a slight increase in enzyme activity. Compared with a media containing other carbon sources, the ${\beta}$-xylosidase activity was 5 times higher when Leu. lactis KCTC 13344 was grown in a medium containing xylose as carbon source. Zymographic analysis indicated that the synthesis of Leu. lactis KCTC 13344 ${\beta}$-xylosidase (approximate size, 64 kDa) is induced by xylose. A maximum intracellular ${\beta}$-xylosidase activity of $7.1{\pm}0.3units/mL$ was obtained in a batch cultivation in an MRS medium containing 30 g/L xylose.
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문제 정의
본 연구에서는 전통 발효식품인 김치에서 분리된 Leuconostoc 속 젖산균의 β-xylosidase 활성을 탐색하여 높은 β-xylosidase 활성을 갖는 균주를 선발하고자 하였다.
제안 방법
β-Xylosidase의 활성염색은 Lee 등(22)의 방법을 변형하여 수행하였으며, SDS-PAGE 후 gel을 50 mM sodium phosphate(pH 6) 완충액으로 30분간 2회 세척한 후 형광 기질인 5 mM p-methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside(βMUX)와 50 mM sodium phosphate(pH 6)가 포함된 agarose gel(0.8%, w/v)을 올려놓고 30℃에서 30분 반응시킨 후 자외선 하에서 관찰하였다.
Bradford Dye Reagent(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 제조사가 제시한 조건에서 단백질 농도를 측정하였으며, 적정 농도로 희석된 bovine serum albumin(BSA, Bio-Rad)을 이용하여 검량선을 작성하였다.
lactis KCTC 13344 균주를 이용하여 pH와 온도에 대한 β-xylosidase의 효소활성 변화를 조사하였다.
lactis KCTC 13344 균주에서의 β-xylosidase 단백질 발현 경향을 조사하기 위하여 탄소원으로 포도당과 자일로스가 각각 첨가된 MRS 배지에서 흡광도가 1까지 성장한 세포를 회수하였다.
lactis KCTC 13344 균주의 β-xylosidase 효소활성을 조사하기 위하여 반응용액에 실험에 사용한 금속이온들의 최종농도가 2 mM이 되도록 첨가하여 효소활성을 측정하였다.
lactis KCTC 13344가 생산하는 β-xylosidase의 탄소원에 대한 발현경향 및 효소단백질의 분자량을 추정하기 위해 20 g/L의 포도당과 30 g/L의 자일로스가 각각 탄소원으로 첨가된 MRS 배지에서 배양된 세포로부터 얻은 단백질을 전기영동한 후 형광 기질인 βMUX를 이용하여 활성염색을 실시하였다.
β-Xylosidase 효소활성이 가장 높은 30 g/L의 자일로스를 사용하여 Leu. lactis KCTC 13344를 배양하여, 배양시간에 따른 균체 성장, 효소 생산, 자일로스 소모량, 젖산, 아세트산 및 에탄올의 생성 경향을 조사하였다(Fig. 6). Leu.
lactis KCTC 13344를 배양할 때 사용하는 탄소원이 세포 내 β-xylosidase 효소활성에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 4A).
lactis KCTC 13344 균주를 멸균 증류수로 2회 세척한 후 초기 세포흡광도가 0.1이 되도록 접종하였다.
금속이온에 대한 β-xylosidase의 효소활성 변화를 조사하기 위하여 효소반응 용액에 CaCl2, CoCl2, CuCl2, FeCl2, MgCl2, MnCl2 및 ZnCl2의 최종 농도가 2 mM이 되도록 첨가하여 효소활성을 측정하였다.
배양시간에 따른 균체의 성장과 효소생산의 경향을 조사하기 위하여 탄소원으로 자일로스가 30 g/L 첨가된 MRS 배지 100 mL을 포함하고 있는 500 mL 플라스크(Nalgene, Rochester, NY, USA)에 20 g/L 포도당이 포함된 MRS 배지에서 배양된 Leu.
배추김치를 비롯한 21여 종류의 김치로부터 분리된 자일로스를 탄소원으로 이용하는 36개의 Leuconostoc 속에 대하여 β-xylosidase 효소활성을 측정하였다.
보관된 균주를 탄소원으로서 20 g/L의 포도당이 첨가된 5 mL의 MRS(BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 배지에 접종하고, 진탕배양기(Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea)를 이용하여 30℃에서 10시간 동안 배양한 뒤, 600 nm에서 흡광도(OD600)를 측정하고 원심 분리하여 적정량의 세포를 회수하였다.
접종 후 36시간 동안 배양하면서 일정 시간마다 배양액을 회수한 뒤 균체농도 및 효소활성을 측정하였으며, HPLC(LC-20A Prominence, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 자일로스, 젖산, 아세트산 및 에탄올 농도를 측정하였다.
젖산균을 배양하는데 주로 사용하는 MRS 배지에 함유된 포도당을 자일로스로 대체하여 김치에서 분리된 Leuconostoc속 자일로스 대사능을 조사하였다. 탄소원을 자일로스로 대체하여 젖산균을 배양하였을 때, 실험에 사용한 55개의 균주 중 36개의 균주는 자일로스를 탄소원으로 이용하였지만, Leu.
효소반응은 100 μL의 0.5 M Na2CO3(Duksan, Ansan, Korea)를 주입하여 종결하였다.
대상 데이터
세포가 제거된 상등액을 조효소액으로 이용하였고, p-nitrophenol 용액(Sigma-Aldrich)을 여러 농도로 희석한 뒤 450 nm에서의 흡광도를 측정하여 검량선을 작성하였다.
한국식품연구원(Korea Food Research Institute, KFRI) 및 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁되어 있는 배추김치를 비롯한 다양한 김치에서 분리된 Leuconostoc 속 젖산균 55개 균주를 분양 받아 이들 균주의 β-xylosidase 활성을 탐색하였다.
데이터처리
모든 측정은 5회 반복하였으며 결과의 평균값과 표준오차는 SigmaPlot(ver. 11; Systat Software Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였고, 통계처리는 SPSS(ver. 18, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
lactis KCTC 13344 균주에서의 β-xylosidase 단백질 발현 경향을 조사하기 위하여 탄소원으로 포도당과 자일로스가 각각 첨가된 MRS 배지에서 흡광도가 1까지 성장한 세포를 회수하였다. Sodium dodecyl sulphate-polyacryamide gel electrophoresis(SDS-PAGE, 10%)는 Sambrook과 Russell의 방법(23)에 따라 수행하였으며 단백질 염색은 Coomassie Brilliant Blue G-250(SigmaAldrich)을 이용하였다. β-Xylosidase의 활성염색은 Lee 등(22)의 방법을 변형하여 수행하였으며, SDS-PAGE 후 gel을 50 mM sodium phosphate(pH 6) 완충액으로 30분간 2회 세척한 후 형광 기질인 5 mM p-methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside(βMUX)와 50 mM sodium phosphate(pH 6)가 포함된 agarose gel(0.
성능/효과
Leu. lactis KCTC 13344의 균체 성장은 접종 후 약 20시간 후에 정지기에 도달하였으며, 배양초기에 주입한 자일로스를 완전히 대사하지 못하고 시간이 경과할수록 점차 감소하였다. 자일로스의 경우 20%의 소모량을 나타냈고, 젖산과 아세트산은 약 3.
반응온도에 대한 KCTC 13344 균주의 β-xylosidase의 활성은 30℃에서 가장 높은 효소활성을 나타내었으며, 높은 반응온도(40, 50, 60℃)보다는 낮은 반응온도(20)에서 상대적으로 효소활성이 우수하였다(Fig. 2B).
이러한 결과로부터 β-xylosidase의 발현 유도는 세포내로 유입되기 어려운 자일란보다 상대적으로 분자량이 작은 자일로스에 의한 효과가 크다는 것을 의미하는 것이며, 본 연구에 사용된 균주의 세포외 β-xylosidase 활성이 매우 낮다는 사실은 자일란에 의한 β-xylosidase 발현 유도 효과가 크지 않다는 실험결과를 일부 증명하는 것으로 추정되었다.
lactis KCTC 13344가 생산하는 β-xylosidase의 탄소원에 대한 발현경향 및 효소단백질의 분자량을 추정하기 위해 20 g/L의 포도당과 30 g/L의 자일로스가 각각 탄소원으로 첨가된 MRS 배지에서 배양된 세포로부터 얻은 단백질을 전기영동한 후 형광 기질인 βMUX를 이용하여 활성염색을 실시하였다. 표준크기 단백질과의 상대적인 이동거리(relative mobility, Rf)를 바탕으로 단백질의 분자량을 추정한 결과 약 64 kDa 크기의 단백질이 자일로스가 탄소원으로 사용된 실험구에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 따라서 Leu.
활성염색 결과 전체 단백질과 가용성 단백질에서 β-xylosidase의 기질분해능이 나타나고, 불용성 단백질에서 나타나지 않아 본 균주에서 발현되는 β-xylosidase는 가용성 단백질인 것으로 판단되었다.
효소활성은 xylose를 첨가하였을 때 가장 높게 나타났으며, 자일로스 농도에 대한 β-xylosidase의 활성을 조사한 결과, 자일로스 농도가 30 g/L인 경우에 가장 높은 효소활성을 나타내었다(Fig. 4B).
lactis KCTC 13344 균주의 β-xylosidase 효소활성을 조사하기 위하여 반응용액에 실험에 사용한 금속이온들의 최종농도가 2 mM이 되도록 첨가하여 효소활성을 측정하였다. 효소활성을 측정한 결과, Zn2+을 제외하고 대부분의 금속이온에 대해 유의적인 효소활성의 증가를 나타냈으며, 그 중 Fe2+을 첨가하였을 때 가장 높은 효소활성을 나타내었다(Fig. 3A). Fe2+을 농도별(1, 2, 3, 4 mM)로 실험한 결과, 1 mM이 가장 높았다(Fig.
후속연구
젖산균을 이용하여 자일로오스를 발효할 경우에 생성되는 젖산은 생분해성 플라스틱을 제조하는 원료로 이용될 수 있다(15). 따라서 효율적으로 자일로오스를 탄소원으로 이용하는 젖산균을 확보한다면 바이오매스를 더욱 효율적으로 이용할 수 있는 기술적 기반을 구축하는데 기여할 것으로 기대된다(15).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
프로바이오틱 젖산균의 효과 및 효능은 어떠합니까?
젖산균은 오랫동안 산업적으로 이용되어 온 중요한 균주의 하나로, 우유 가공품과 발효식품인 김치, 간장, 된장 등에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있다(1). 특히 프로바이오틱 젖산균은 장관의 미생물 균총 유지, 유당 불내증의 완화, 혈중 콜레스테롤의 감소, 항암작용, 면역 증강작용, 식품의 영양학적 가치 증진 등의 유익한 효과와 변비의 완화, 유아의 설사 방지 등의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다(2-4). 김치 및 발효 유제품으로부터 분리된 젖산균과 공시 젖산균주를 대상으로 내산성, 내담즙성, 장내 부착능, 병원성균 억제능 등의 프로바이오틱 특성과 장관 면역활성 및 대식세포 활성 등의 면역활성을 연구한 결과 Lactobacillus acidophilus 균주인 DDS-1과 B3208이 프로바이오틱 균주로서 요구되는 조건을 충족시키는 것으로 보고되었다(5).
젖산균의 장점은 무엇입니까?
인류는 수천 년 동안 발효식품 생산을 위하여 젖산균을 이용하여 왔는데, 젖산균은 맛, 풍미 그리고 조직감에서 바람직한 변화를 일으킬 뿐만 아니라 식중독 및 부패 미생물들의 생육을 억제할 수 있는 발효능력을 가지고 있기 때문이다. 젖산균은 오랫동안 산업적으로 이용되어 온 중요한 균주의 하나로, 우유 가공품과 발효식품인 김치, 간장, 된장 등에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있다(1).
β-Xylosidase효소가 매우 중요한 이유는 무엇입니까?
β-Xylosidase는 자연에서 셀룰로스 다음으로 많이 존재하는 탄수화물인 자일란을 자일로스로 가수분해하기 위하여 endoxylanase, α-arabinosidase와 함께 요구되는 효소이다(6). 또한 최종산물에 의한 endoxylanase의 억제를 감소시키는데 기여하기 때문에 미생물의 자일란 분해계에서 매우 중요한 효소 중의 하나이다(6). 자일란은 최근 대체에너지인 바이오에탄올의 생산을 위한 기질로서 주목을 받고 있을 뿐만 아니라, 부탄올과 같은 유기용매 및 자일리톨과 같은 감미료의 생산원료로서도 그 이용이 기대되고 있는 중요한 바이오매스 자원 중의 하나이다(7-9).
참고문헌 (28)
Kim MJ, Kim GR. In vitro evaluation of cholesterol reduction by lactic acid bacteria extracted from kimchi. Korean J. Culin. Res. 12: 259-268 (2006)
Gill HS. Probiotics to enhance anti-infective defences in the gastrointestinal tract. Best Pract. Res. Cl. Ga. 17: 755-773 (2003)
Saarela M, Lahteenmaki L, Crittenden R, Salminen S, Mattila-Sandholm T. Gut bacteria and health foods- the European perspective. Int. J. Food Microbiol. 78: 99-117 (2002)
Seo JH, Lee H. Characteristics and immunomodulating activity of lactic acid bacteria for the potential probiotics. Korean J. Food Sci. Technol. 39: 681-687 (2007)
Ernest K, Yu C, Deschatelets L, Saddler JN. The combined enzymatic hydrolysis and fermentation of hemicellulose to 2,3-butanediol. Appl. Microbiol. Biot. 19: 365-372 (1984).
Meyrial V, Delgenes JP, Moletta R, Navarro JM. Xylitol production from D-xylose by Candida guillermondii: fermentation behaviour. Biotechnol. Lett. 13: 281-286 (1991)
Martin C, Galbe M, Wahlbom CF, Hahn-Hagerdal B, Jonsson LJ. Ethanol production from enzymatic hydrolysates of sugarcane bagasse using recombinant xylose-utilising Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb. Tech. 31: 274-282 (2002)
Godden B, Legon T, Helvenstein P, Penninckx M. Regulation of the production of hemicelluloytic and cellulolytic enzymes by a Streptomyces sp. growing on lignocellulose. J. Gen. Microbiol. 135: 285-292 (1989)
Nanmori T, Watanabe T, Shinke R, Kohno A, Kawamura Y. Purification and properties of thermostable xylanase and $\beta$ -xylosidase produced by a newly isolated Bacillus stearothermophilus strain. J. Bacteriol. 172: 6669-6672 (1990)
Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Vol. 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. NY. USA. pp. A 8.40-A 8.51 (2001)
Ko JL, Oh CK, Oh MC, Kim SH. Isolation and Identification of lactic acid bacteria from commercial kimchi. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 38: 732-741 (2009)
Flores ME, Perea M, Rodriguez O, Malvaez A, Huitron C. Physiological studies on induction and catabolite repression of $\beta$ -xylosidase and endoxylanase in Streptomyces sp. CH-M-1035. J. Biotechnol. 49: 179-187 (1996)
Yu JW, Kim HK, Kim CK, Lim JY. Characterization of $\beta$ -xylosidase from Pseudomonas sp. CB-33. Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 24: 197-205 (1996)
Lee HJ, Choi YD, Han MH. Studies of hemicellulase system in Aspergillus niger-purification and characterization of $\beta$ -xylosidase. Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 11: 93-100 (1983)
Kang DH, Lee KH, Ji GE. Production of $\beta$ -xylosidase from Bifidobacterium sp. Int-57. Korean J. Food Sci. Technol. 25: 89-93 (1993)
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