아시아에서 한방약초로 널리 알려진 당귀 추출물의 미백활성을 알아보기 위하여 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 1,000 ${\mu}g/ml$의 농도에서 70% 이상의 활성을 나타내었다. 또한 당귀 추출물에 대한 멜라노마 세포(B16F10)의 세포생존율을 확인한 결과 500 ${\mu}g/ml$의 농도에서 99% 이상의 세포생존율을 확인할 수 있었다. 미백 관련 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 mRNA 발현량을 측정한 결과 50 ${\mu}g/ml$의 농도에서 각각 85.7%, 123.9%, 68.8%, 208%로 당귀 추출물을 처리하지 않은 군보다 감소하였음을 확인할 수 있었다. 이러한 연구 결과에 따라 당귀 추출물이 melanin 합성과 관련이 있는 유전자 발현의 억제효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 미백 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였다.
아시아에서 한방약초로 널리 알려진 당귀 추출물의 미백활성을 알아보기 위하여 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 1,000 ${\mu}g/ml$의 농도에서 70% 이상의 활성을 나타내었다. 또한 당귀 추출물에 대한 멜라노마 세포(B16F10)의 세포생존율을 확인한 결과 500 ${\mu}g/ml$의 농도에서 99% 이상의 세포생존율을 확인할 수 있었다. 미백 관련 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 mRNA 발현량을 측정한 결과 50 ${\mu}g/ml$의 농도에서 각각 85.7%, 123.9%, 68.8%, 208%로 당귀 추출물을 처리하지 않은 군보다 감소하였음을 확인할 수 있었다. 이러한 연구 결과에 따라 당귀 추출물이 melanin 합성과 관련이 있는 유전자 발현의 억제효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 미백 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였다.
The purpose of this study was to research the whitening effects of the extract from Angelica gigas Nakai, which is one of the most widely used herbal medicines in Asia. For whitening effects, the tyrosinase inhibition effect of the A. gigas Nakai extract was shown to be greater than 70% at 1,000
The purpose of this study was to research the whitening effects of the extract from Angelica gigas Nakai, which is one of the most widely used herbal medicines in Asia. For whitening effects, the tyrosinase inhibition effect of the A. gigas Nakai extract was shown to be greater than 70% at 1,000 ${\mu}g/ml$ concentration. The result of measuring the cell toxicity effect of the extract from A. gigas Nakai on melanoma cells showed 99% toxicity at 500 ${\mu}g/ml$ concentration. The microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), and tyrosinase mRNA expression inhibitory effect by reverse transcription-PCR of the extract from A. gigas Nakai were decreased by 85.7%, 123.9%, 68.8%, and 208%, respectively, at 50 ${\mu}g/ml$ concentration. All these findings could verify that extract from A. gigas Nakai could have an effect on whitening. Moreover, extract from A. gigas Nakai has great potential as a cosmetic ingredient.
The purpose of this study was to research the whitening effects of the extract from Angelica gigas Nakai, which is one of the most widely used herbal medicines in Asia. For whitening effects, the tyrosinase inhibition effect of the A. gigas Nakai extract was shown to be greater than 70% at 1,000 ${\mu}g/ml$ concentration. The result of measuring the cell toxicity effect of the extract from A. gigas Nakai on melanoma cells showed 99% toxicity at 500 ${\mu}g/ml$ concentration. The microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), and tyrosinase mRNA expression inhibitory effect by reverse transcription-PCR of the extract from A. gigas Nakai were decreased by 85.7%, 123.9%, 68.8%, and 208%, respectively, at 50 ${\mu}g/ml$ concentration. All these findings could verify that extract from A. gigas Nakai could have an effect on whitening. Moreover, extract from A. gigas Nakai has great potential as a cosmetic ingredient.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 당귀 추출물의 tyrosinase 저해활성 및 미백인자 인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 mRNA 발현억제 효과를 확인하여 미백용 화장품 소재로서의 가능성을 살펴보고자 한다.
따라서 이 반응을 억제하게 되면 melanin 생합성을 억제할 수 있어, 기미, 주근깨, 검버섯 등과 같은 과잉색소증 치료 등 광범위하게 이용될 수 있으며 피부 미백제의 개발에 있어서 tyrosinase 활성 억제 실험은 유용한 평가법으로 인정되고 있다[10, 13, 14]. 따라서 본 연구에서는 당귀 추출물이 피부 내에서 melanin 중합체 생합성을 효과적으로 저해할 수 있는 tyrosinase 저해활성을 농도별로 측정한 결과를 Fig. 1에 나타내었다.
제안 방법
DEPC를 50 μl씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 μl와 멸균수 195 μl 를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다.
PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초(35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.
실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초(35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)를 하였다.
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초(35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100 V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
따라서 이하의 멜라노마 세포(B16F10)에서의 미백 관련 신호 전달 인자 측정은 생존율이 100% 이상의 농도인 5, 25, 50 μg/ml의 농도로 실험하였다.
미백인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), tyrosinase의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다.
본 연구에서는 당귀 추출물이 melanin 합성에 관계된 주요 효소인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 멜라노마 세포(B16F10)에 5, 25, 50 μg/ml의 샘플을 농도별로 처리한 후 24시간 뒤에 PCR으로 mRNA 발현량을 측정하여 Fig. 3∼6과 같이 나타내었다.
3∼6과 같이 나타내었다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. Fig.
대상 데이터
본 실험에 사용한 당귀(Angelica gigas Nakai)는 대전대학교부속 한방병원에서 구입 정선하여 사용하였으며 원산지는 한국 경북 청송군 부남면이다. 당귀 100 g에 증류수 2,000 ml를 가하여 열탕 추출기에서 2시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치로 농축하여, 이를 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조한 당귀 추출물 24.
본 실험에 이용한 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 세포배양기에 적응시켜 계대 배양하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 결과 통계처리는 SPSS10.0 (Evanston, IL, USA) software를 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석 (analysis of variance ANOVA)을 한 후 α=0.05 수준에서 Turkey’s HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.
이론/모형
Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법[30]에 따라 측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[7]에 따라 측정하였다. 멜라노마 세포(B16F10)을 96 well plate에 5×104 cells/well이 되게 0.
성능/효과
Fig. 3∼6에서 보는 바와 같이 당귀 추출물을 5, 25, 50 μg/ml을 농도별로 처리한 B16F10군에서는 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA 발현이 당귀 추출물을 처리하지 않은 군보다 감소하는 것을 확인할 수 있었으며.
MITF, TRP-1,tyrosinase mRNA 발현이 비교군인 50 μg/ml의 농도의 Kojic acid보다 감소한 것을 확인할 수 있었다.
당귀 추출물은 1,000 μg/ml의 농도에서 70% 이상의 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다.
이는 Na [20]의 목단피 추출물의 경우 tyrosinase, MITF의 발현을 억제시키지 못한 결과와 비교하여 당귀 추출물은 농도 증가 시 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이와 같은 결과로 당귀 추출물이 멜라노마 세포(B16F10)에 대하여 멜라닌 색소 생성 억제 및 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 억제 효과를 가지고 있는 것으로 보임에 따라 미백 관련 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 있음을 확인하였다.
이는 Bae [5]가 보고한 승마갈근탕 구성약제의 경우 승마 열수 및 에탄올 추출물 500 μg/ml에서 각각 52.1%, 46.2%의 세포 생장 억제능을 나타내었으며, An 등[4]의 내소황련탕 복합처방의 경우 100 μg/ml에서 열수 추출물과 에탄올 추출물이 각각 55%, 38% 이하의 낮은 증식억제 효과를 나타내었다는 연구결과와 비교하였을 때 당귀 추출물의 멜라노마 세포(B16F10)에 대한 세포 독성이 적은 것을 확인할 수 있었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
멜라닌은 무엇인가?
멜라닌은 자외선 흡수에 의한 피부 세포의 손상을 억제할 목적으로 생성이 되지만 자외선의 영향을 받기 쉬운 기관인 피부는 계속적으로 자외선에 노출되면 과도한 멜라닌 합성과 축적은 기미, 주근깨, 홍반, 검버섯 등의 시각적으로 좋지 않은 질병을 야기한다 [9, 28]. 멜라닌(melanin)은 적갈색 또는 흑갈색의 고분자 화합물로서 멜라닌 세포(melanocyte)내 멜라닌 소체(melanosome) 라는 소기관에서 단계적 효소 반응에 의해 합성된다[11]. 멜라닌의 생합성 과정에 작용하는 주요 효소는 polyphenol oxidase의 일종인 tyrosinase로서 구리를 함유한 효소이며 tyrosine을 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)으로 변환 하고 효소적 산화반응을 거쳐 dopaquinone으로 변환시킨다 [6, 12].
TRP-1과 DCT 외에 멜라닌의 생합성 과정에 작용하는 주요 효소는 무엇이며, 어떠한 물질에 작용하는가?
멜라닌(melanin)은 적갈색 또는 흑갈색의 고분자 화합물로서 멜라닌 세포(melanocyte)내 멜라닌 소체(melanosome) 라는 소기관에서 단계적 효소 반응에 의해 합성된다[11]. 멜라닌의 생합성 과정에 작용하는 주요 효소는 polyphenol oxidase의 일종인 tyrosinase로서 구리를 함유한 효소이며 tyrosine을 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)으로 변환 하고 효소적 산화반응을 거쳐 dopaquinone으로 변환시킨다 [6, 12]. Tyrosinase 이외에도 잘 알려진 효소로는 tyrosinase related protein-1 (TRP-1)과 dopachrome tautomerase (DCT) 등이 있다.
당귀 추출물이 melanin 합성과 관련 주요 효소인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA에 미치는 영향을 확인한 결과로 어떠한 결론을 도출할 수 있었는가?
이는 Na [20]의 목단피 추출물의 경우 tyrosinase, MITF의 발현을 억제시키지 못한 결과와 비교하여 당귀 추출물은 농도 증가 시 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이와 같은 결과로 당귀 추출물이 멜라노마 세포(B16F10)에 대하여 멜라닌 색소 생성 억제 및 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 억제 효과를 가지고 있는 것으로 보임에 따라 미백 관련 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 있음을 확인하였다.
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