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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 다양한 분리원에서 분리된 E. coli O157:H7 박테리오파지를 확보하고, 각각의 박테리오파지가 보유하고 있는 병원성 인자의 종류와 보유 특성을 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 분변으로부터 분리한 E. coli O157:H7 박테리오파지 9주와 박테리오파지은행에서 구입한 하천수, 오수, 해수 유래의 박테리오파지 14주의 병원성인자 보유 여부를 조사하였다. 23개 박테리오파지 분리주에서 eae, stx2, ial, estI, astA가 검출되었으며, 각각의 병원성인자 검출율은 eae (23/23; 100%), stx2 (16/23; 69.
제안 방법
- 대장균의 병원성인자 검출을 위한 양성대조군은 선행연구에서 사용된 표준균주 또는 분리균주를 TSA에 배양하고, 여기서 얻어진 단일 집락을 TSB에 접종하고 24시간 배양한 배양액을 사용하여 AccuPrep Genomic DNA Extraction kit (Bioneer, Daejeon, Korea)로 genomic DNA 를 추출하였다10-11). 박테리오파지 배양액은 0.
- 기존의 연구된 대장균 박테리오파지에서는 eae가 검출 보고된 바 없음에도 불구하고, 본 연구에 사용된 박테리오파지는 모두 eae 양성반응 보였다. 따라서 숙주세균의 genomic DNA오염을 배제하기 위하여 E. coli O157:H7 ATCC 43889, E. coli O157:H7 ATCC 43890, E. coli O157:H7 ATCC 35150의 배양액과 0.2 um syringe filter 여과액을 Phage DNA isolation kit로 추출하여 얻은 DNA에 대하여 eae의 존재여부를 조사하였다. 세 대장균 모두 배양액에서 추출된 DNA는 eae 양성 반응을 보였으나, 제균한 여과액을 phage DNA isolation kit으로 추출한 경우 E.
- . 박테리오파지 배양액은 0.2 um syringe filter로 여과하여 숙주세균의 오염을 배제하였으며, bacteriophage DNA는 Phage DNA isolation kit (Norgen Biotek, Ontario, Canada)로 표준 추출법에 따라서 DNase I (20 U)을 처리한 뒤 phage DNA를 추출하였다.
- 1 ul/ml Ethidium bromide가 포함된 1x Tris acetate EDTA (TAE buffer) 1% gel agarose상에서 100 V, 45 min 조건으로 수행하였다. 전기영동 결과는 UV illuminator (SL-20 25W Transilluminator, Seoulin BioScience, USA)로 관찰하였으며, Launch DocIT LS program (UVP Advanced BioImaging Software version. 5.5.5a, cambridge, UK)로 분석하였다.
대상 데이터
- E. coli O157:H7 ATCC 43889는 선행연구와 같이 Tryptone Soya Broth (TSB)에 접종시켜 37℃에서 18시간 배양시켜 사용하였다12-14). 각 분리원에서 얻은 샘플 20 g, Luria Bertani broth including 0.
- coli O157:H7 ATCC 35150은 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. 박테리오파지 분리에 사용될 축 분은 경기도 지역의 10개 농장으로부터 수집하였다.
- 한국의 하수에서 분리된 Escherichia coli O157:H7 용균성 박테리오파지 14개 주는 한국외국어대학교 박테리오파지 은행으로부터 구입하여 사용하였다. 박테리오파지 분리에 사용한 숙주 균주인 E. coli O157:H7 ATCC 43889와 E. coli O157:H7 ATCC 43890, E. coli O157:H7 ATCC 35150은 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. 박테리오파지 분리에 사용될 축 분은 경기도 지역의 10개 농장으로부터 수집하였다.
- . 한국의 하수에서 분리된 Escherichia coli O157:H7 용균성 박테리오파지 14개 주는 한국외국어대학교 박테리오파지 은행으로부터 구입하여 사용하였다. 박테리오파지 분리에 사용한 숙주 균주인 E.
- 현재까지 알려진 대장균의 병원성인자 stx1, stx2, eae, aafII, ial, elt, estI, estII, astA, afa, cnf 를 검출하기 위한 양성대조 균주는 선행연구에서 사용한 대장균 표준균주와 분리주를 사용하였다10-11). 한국의 하수에서 분리된 Escherichia coli O157:H7 용균성 박테리오파지 14개 주는 한국외국어대학교 박테리오파지 은행으로부터 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- E. coli 병원성인자 stx1, stx2, eae, aafII, ial, elt, estI, estII, astA, afa, cnf에 대한 중합효소연쇄반응은 선행연구에서 사용된 방법에 따라서 수행되었다10-11). 중합효소연쇄반응을 위한 primer는 모두 Bioneer에 의뢰하여 제작되었다(Table 1).
- , Gottingen, Germany)로 여과하여 분리하였다. 분리된 박테리오파지는 선행연구에서 보고된 plaque assay법을 이용하여 용균활성을 확인하였다. 숙주 균주 100 ul와 SM buffer (0.
성능/효과
- coli O157:H7 박테리오파지 9주와 박테리오파지은행에서 구입한 하천수, 오수, 해수 유래의 박테리오파지 14주의 병원성인자 보유 여부를 조사하였다. 23개 박테리오파지 분리주에서 eae, stx2, ial, estI, astA가 검출되었으며, 각각의 병원성인자 검출율은 eae (23/23; 100%), stx2 (16/23; 69.6%), estI (3/23;13.0%), astA (3/23; 13.0%), ial (2/23; 8.7%) 순으로 높았다 (Table 2). 박테리오파지가 보유하고 있는 병원성인자의 프로파일은 stx2+eae (13/23; 56.
- . 기존의 연구된 대장균 박테리오파지에서는 eae가 검출 보고된 바 없음에도 불구하고, 본 연구에 사용된 박테리오파지는 모두 eae 양성반응 보였다. 따라서 숙주세균의 genomic DNA오염을 배제하기 위하여 E.
- 3%)과 같이 조사되었다. 박테리오파지에 1개의 병원성인자를 보유한 경우는 21.7%, 2개와 3개의 병원성인 자를 보유한 경우는 각각 69.6%와 13.0%로 다양한 병원 성인자를 보유하는 것으로 조사되었다.
- 본 연구에서 분리된 가축분변 유래 박테리오파지 분리주들은 모두 stx2+eae 보유하고 있음을 확인하였다. stx2와 eae 이외의 병원성인자는 검출되지 않았다(Table 2).
- 본 연구에서는 분변유래 박테리오파지는 모두 stx2+eae를 보유하고 있었으나, 하수유래 박테리오파지 분리주에서는 다양한 병원성인자와 병원성 프로파일을 확인할 수 있었다. 따라서 향후 연구에서는 다양한 종류의 식품 또는 상수와 같이 위생적인 분리원으로부터 박테리오파지를 분리할 필요가 있을 것이다.
- 2 um syringe filter 여과액을 Phage DNA isolation kit로 추출하여 얻은 DNA에 대하여 eae의 존재여부를 조사하였다. 세 대장균 모두 배양액에서 추출된 DNA는 eae 양성 반응을 보였으나, 제균한 여과액을 phage DNA isolation kit으로 추출한 경우 E. coli O157:H7 ATCC 43890과 E. coli O157:H7 ATCC 35150 여과액에서는 eae 가 검출되지 않았다. 흥미롭게도 박테리오파지 분리 숙주인 E.
- 하수 유래 박테리오파지 분리주에서는 stx2+eae, eae+astA, eae, stx2+eae+estI, eae+estI, stx2+eae+ial, eae+ial와 같이 다양한 병원성인자 프로파일이 조사되었다. 하수유래 박테리오파지 6개 분리주가 장독소형대장균(Enterotoxigenic E. coli: ETEC)이 주로 보유하고 있는 내열성 장독소인 estI 또는 astA를 보유하고 있었다. 내열성 독소(heat-stable enterotoxin; ST)는 이열성 독소(heat-labile enterotoxin; LT) 와 함께 대장균이 보유하는 Ent plasmid에 위치하는 것으로 알려져 있다.
- 흥미롭게도 하수에서 분리된 2개의 박테리오파지에서 장침투성대장균(Enteroinvasive E. coli: EIEC)의 병원성인 자인 ial (invasion-associated locus)이 확인되었다. 그러나 태국, 베트남, 미얀마 등에서는 발생하는 병원성 대장균에서는 검출율이 낮거나 없으며17), 국내에서도 EIEC에 의한 대장균 감염 사례는 보고된 바 없다.
후속연구
- EIEC는 IpaA, IpaB, IpaC와 IpaD를 포함하는 140-Md invasion plasmid, VirG를 합성하는 병원성 플라스미드와 superoxide dismutase를 포함한 Chromosomal virulence factors를 특징적으로 보유하고 있다18). 따라서 ial 을 보유하고 있는 박테리오파지가 식품 또는 환경에서 비병원성 대장균으로 병원성인자를 전달할 수 있는지 여부 등을 후속연구에서 평가할 필요가 있을 것이다.
- coli O157:H7 ATCC 43889에서 기인한 오염 DNA 또는 숙주세균 내에 존재하는 prophage에 의한 것으로 추측된다. 따라서 향후 연구에서는 E. coli O157:H7 ATCC 43889를 이용한 박테리오파지 분리시 eae gene의 오염을 고려하거나, 다른 숙주세균을 사용할 필요가 있을 것이다.
- 본 연구에서는 분변유래 박테리오파지는 모두 stx2+eae를 보유하고 있었으나, 하수유래 박테리오파지 분리주에서는 다양한 병원성인자와 병원성 프로파일을 확인할 수 있었다. 따라서 향후 연구에서는 다양한 종류의 식품 또는 상수와 같이 위생적인 분리원으로부터 박테리오파지를 분리할 필요가 있을 것이다. 식품 및 환경 분야 응용을 위해서는 실용화 이전에 병원성인자의 보유 여부를 확인하고, 박테리오파지 분리주의 안전성 평가를 반드시 병행해야 할 것으로 판단된다.
- 식품 및 환경 분야 응용을 위해서는 실용화 이전에 병원성인자의 보유 여부를 확인하고, 박테리오파지 분리주의 안전성 평가를 반드시 병행해야 할 것으로 판단된다. 또한 식품에 활용할 수 있는 박테리오파지의 안전성 검사기술 개발 및 안전 기준을 확보해야 할 것이다.
- coli O157: H7의 독소 생산을 효과적으로 저해하였다고 하였다26). 본 연구에서 사용된 박테리오파지 분리주에 stx2의 보유율이 69.6%로 높았으므로, 각각의 박테리오파지에 존재하는 stx2의 안전성과 숙주 세균 제어와 관련한 활성평가가 필요할 것이다.
- 따라서 향후 연구에서는 다양한 종류의 식품 또는 상수와 같이 위생적인 분리원으로부터 박테리오파지를 분리할 필요가 있을 것이다. 식품 및 환경 분야 응용을 위해서는 실용화 이전에 병원성인자의 보유 여부를 확인하고, 박테리오파지 분리주의 안전성 평가를 반드시 병행해야 할 것으로 판단된다. 또한 식품에 활용할 수 있는 박테리오파지의 안전성 검사기술 개발 및 안전 기준을 확보해야 할 것이다.
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