선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 연구에서 우리는 좀보리사초 추출물은 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 비만세포 활성 및 IgE 매개성 알레르기 반응 억제 기전을 규명하였다. 좀보리사초는 FcεRI 매개성 신호 경로 중 초기 신호 전달 분자인 Syk의 활성화 억제를 통해 하위 신호분자인 LAT 및 MAP kinase 등의 활성화를 순차적으로 억제함으로써 탈과립 및 알레르기 반응 억제 효능을 나타내었다.
- 우리나라의 해안사구식물들 중 순비기나무, 갯방풍, 갯기름나물 등도 민간약재로 사용되어 왔고, 그 외 사구식물들에도 항염증 효과를 보이는 플라보노이드가 다량 존재한다는 연구결과도 있다11). 우리는 해안사구식물 추출물의 항알레르기 효능 여부를 검색하는 중 좀보리사초 추출물에서 유의적인 알레르기 억제 효과가 확인하여 그 기전을 규명하였다.
제안 방법
- 1시간 후 DNPBSA를 5 mg/ml 에반스 블루 염색액에 1 mg/ml의 농도로 희석하여 250 μl를 꼬리정맥에 투여하였다.
- CPE 처리 후 비만세포 탈과립 억제 효과의 가역성을 확인하기 위해 CPE 처리 1시간 후 PIPES 완충용액으로 세포를 5번 씻어준 뒤 항원으로 자극하여 RBL-2H3에서 탈과립을 측정하였다. 그 결과 RBL-2H3 세포에 CPE처리 후 세척하면 탈과립 현상이 다시 회복되었다(Fig.
- CPE의 비만세포에서 생성되는 염증성 싸이토카인의 생성을 저해하는 효과를 확인하기 위해, 비만세포에 IgE를 감작 한 후 항원을 처리하여 TNF-α 및 IL-4의 발현에 대한 CPE의 억제 효과를 RT-PCR을 통하여 확인하였다.
- PCA는 IgE를 마우스의 귀에 피내주사 후 꼬리 정맥으로 IgE에 특이적인 antigen이 포함된 에반스블루 용액을 주입하여, 항원이 IgE에 감작된 귀의 비만세포를 자극하여 탈과립을 유도하여 과립 내 물질들이 혈관 투과성을 높임으로써 혈관 내 에반스 블루가 귀에 삼출하게 되는 알레르기 동물모델이다. IgE 매개형 PCA에 대해 억제 작용을 가진 물질을 투여할 경우 위의 반응을 억제하여 귀에 삼출되는 에반스블루의 양을 감소시키기 때문에 이 원리를 이용하여 in vivo에서 알레르기 반응 억제실험을 수행하였다. 실험 결과로 CPE는 마우스에서 항원에 의해 유도된 PCA 반응을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig.
- IgE 및 비만세포 매개성 수동 피부 감작 알레르기 반응(Passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 유도하기 위해 마우스의 한쪽 귀에 IgE 를 0.5 μg를 주입하였다.
- RNA pellet을 DEPC-water 50μl에 녹여서 얻은 total RNA를 reverse transcriptase와 dNPT, oligo primer, superase, 5× 반응완충액, MgCl2를 이용하여 제조회사가 제공하는 완충용액과 방법에 따라 25℃, 5분, 42℃, 60분, 72℃, 5분, 4℃로 유지시켜 cDNA를 제조한다.
- 05% Tween-20)로 5% BSA을 만들어 1 시간 동안 blocking 시킨 다음, 각각의 특이적인 항체와 4℃에서 overnight시켰다 (1차 항체 반응). 그리고 horseradish peroxidase (HRP)가 붙은 단일클론 항체 또는 다클론 항체로 한 시간 동안 반응시킨 다음 (2차 항체 반응), 비 특이적으로 남아있는 항체를 TBS-T로 10분 간격으로 5~6회 씻어준 후, ECL detection kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
- 다음으로 BALB/c 마우스를 이용하여 국소적 알레르기 질환 동물 모델(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)에서 CPE의 알레르기 억제 효과 및 피부의 병리학적 분석을 수행하였다. PCA는 IgE를 마우스의 귀에 피내주사 후 꼬리 정맥으로 IgE에 특이적인 antigen이 포함된 에반스블루 용액을 주입하여, 항원이 IgE에 감작된 귀의 비만세포를 자극하여 탈과립을 유도하여 과립 내 물질들이 혈관 투과성을 높임으로써 혈관 내 에반스 블루가 귀에 삼출하게 되는 알레르기 동물모델이다.
- 다음으로 비만세포에서 항원에 의한 탈과립 과 사이토카인 생산을 억제하는 기전을 실험하였다. CPE는 RBL2H3 cells에서 항원 자극에 의한 Syk과 LAT의 활성화를 농도 의존적으로 억제하였다(Fig.
- 따라서 항원 자극에 의한 비만세포의 활성화로 유도되는 탈과립을 측정하는 지표 단백질로써 β-hexosaminidase을 측정하였다.
- 물과 사료는 자유롭게 먹도록 하였으며, 사육환경은 온도 22 ± 1℃, 습도 55 ± 10%로 유지하였고, 낮과 밤의 주기는 각각 12시간으로 하였다.
- 변성된 단백질시료를 10%의 poly acryl amide gel (poly acrylamide: bisacrylamide = 29: 1)을 사용하여 80 볼트에서 30분, 120 볼트에서 1시간 동안 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 진행한 후 PVDF membrane (Schleicher & Schuell, BA85)로 transfer 시켰다.
- 비만세포의 탈과립 시 CPE 처리로 인한 억제효과를 측정하기 위해 CPE를 10, 30, 100 μg/ml의 농도로 처리하였다.
- 2)을 사용하여 진행하였다. 실험은 완충용액으로 세포를 2회 세척 후, 다시 완충용액을 넣고 CO2 incubator에서 5분간 반응시킨 후, CPE를 각 농도별로 완충용액에 희석시켜 각 well에 30 분 처리하였다. 다음으로, 25 ng/ml의 항원(DNP-BSA)를 각 well에 첨가하여 10 분 동안 자극시킨 후, 5 분간 얼음 위에 두어 자극을 정지시켰다.
- 5 μg를 주입하였다. 약 12 시간 후 5% Arabic gum 용액에 녹인 CPE와 표준약물(cetirizine, 20 mg/kg)을 농도별로 경구투여 하였다. 1시간 후 DNPBSA를 5 mg/ml 에반스 블루 염색액에 1 mg/ml의 농도로 희석하여 250 μl를 꼬리정맥에 투여하였다.
- 일반적으로 비만세포의 분비를 억제하는 방법으로 첫 번째, FcεRI에 결합된 IgE에 항원이 이들의 응집을 막는 것과, 두 번째, 응집체 형성 이 후 개시되는 FcεRI 매개 신호전달단백질을 막는 방법이 있는데, 본 연구는 두 번째 방법에 초점을 맞춰 실험을 진행하였다.
- 8 × 105 cells/well)에 분주하여, 20 ng/ml의 DNP 특이적인 IgE가 포함된 MEM 배지에서 12 시간 동안 배양 감작하였다. 탈과립 측정은 PIPES 완충용액(159 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM Glucose, 0.4 mM MgCl2, 25 mM PIPES, 4 mM CaCl2, 0.1% fatty acid and protease-free fraction V from bovine serum, pH 7.2)을 사용하여 진행하였다. 실험은 완충용액으로 세포를 2회 세척 후, 다시 완충용액을 넣고 CO2 incubator에서 5분간 반응시킨 후, CPE를 각 농도별로 완충용액에 희석시켜 각 well에 30 분 처리하였다.
- 한 시간 후 마우스를 안락사하고 IgE를 주입한 귀를 잘라서 700 μl의 포름아마이드에 넣고 63℃에서 12시간 이상 염색약을 추출 후 원심분리하여 상등액을 얻은 후, 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입한 RBL-2H3 (Rat Basophil Leukemia) cells을 200 mM Lglutamin, 10, 000 units/ml penicillin streptomycin, 15% fetal bovine serum (FBS)이 포함된 MEM을 배양액으로 하여 CO2 incubator (5% CO2, 37℃)에서 배양하였고 1~2 일 간격으로 계대 배양하였다. Bone marrow-derived mast cells (BMMCs)는 5 주령의 수컷 Balb/c 마우스로부터 채취한 골수 세포를 10% FBS, 100 μg/ml streptomycin, 100 μM MEM non-essential amino acid solution, 5 mM sodium pyrubate를 포함한 RPMI 1640에 10 ng/ml의 murine recombinant IL-3를 첨가한 배양액을 사용하여 5주 정도 배양 후 98% 이상의 homogenous한 BMMCs를 얻어 실험에 사용하였다.
- Bone marrow-derived mast cells (BMMCs)는 5 주령의 수컷 Balb/c 마우스로부터 채취한 골수 세포를 10% FBS, 100 μg/ml streptomycin, 100 μM MEM non-essential amino acid solution, 5 mM sodium pyrubate를 포함한 RPMI 1640에 10 ng/ml의 murine recombinant IL-3를 첨가한 배양액을 사용하여 5주 정도 배양 후 98% 이상의 homogenous한 BMMCs를 얻어 실험에 사용하였다.
- 세포배양에 사용한 MEM (Minimal Essential Medium) 배양액과 R PMI-1640 배양액은 Gibco에서 구입하였다. DNP (dinitrophenol)-BSA (bovine serum albumin), DNPspecific mon℃lonal IgE, formamide, Arabic gum, PP2는 Calbiochem에서 구입하였다. Immunoblot에 사용한 PhosphoSyk specific polyclonal 항체, LAT specific polyclonal 항체와 phospho-Akt (polyclonal), Phospho-Erk1/2 (monoclonal), Phospho-JNK (polyclonal), Phospho-p38 (polyclonal)은 Cell Signalling Technology사에서, phospho-tyrosine specific monoclonal 항체, phospho-LAT specific polyclonal 항체는 Upstate사에서 구입하였다.
- DNP (dinitrophenol)-BSA (bovine serum albumin), DNPspecific mon℃lonal IgE, formamide, Arabic gum, PP2는 Calbiochem에서 구입하였다. Immunoblot에 사용한 PhosphoSyk specific polyclonal 항체, LAT specific polyclonal 항체와 phospho-Akt (polyclonal), Phospho-Erk1/2 (monoclonal), Phospho-JNK (polyclonal), Phospho-p38 (polyclonal)은 Cell Signalling Technology사에서, phospho-tyrosine specific monoclonal 항체, phospho-LAT specific polyclonal 항체는 Upstate사에서 구입하였다. Syk specific polyclonal 항체, actin specific monoclonal 항체, phospho-PLCγ는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하여 사용하였다.
- PIPES, HEPES, Triton X-100, carbonate, p-nitrophenyl-N-acetyl-β-d-glucosaminide 는 Sigma사에서 구입하였다.
- Syk specific polyclonal 항체, actin specific monoclonal 항체, phospho-PLCγ는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하여 사용하였다. RT-PCR에 사용한 easy-blueTM Total RNA Extraction Kit는 iNtRON Bio technology로부터 구매하였다. PIPES, HEPES, Triton X-100, carbonate, p-nitrophenyl-N-acetyl-β-d-glucosaminide 는 Sigma사에서 구입하였다.
- Syk specific polyclonal 항체, actin specific monoclonal 항체, phospho-PLCγ는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하여 사용하였다.
- 세포배양에 사용한 MEM (Minimal Essential Medium) 배양액과 R PMI-1640 배양액은 Gibco에서 구입하였다. DNP (dinitrophenol)-BSA (bovine serum albumin), DNPspecific mon℃lonal IgE, formamide, Arabic gum, PP2는 Calbiochem에서 구입하였다.
- 실험동물은 (주)오리엔탈바이오 (성남, 한국)에서 생후 5주령 수컷 Balb/c 마우스를 구입하여 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 먹도록 하였으며, 사육환경은 온도 22 ± 1℃, 습도 55 ± 10%로 유지하였고, 낮과 밤의 주기는 각각 12시간으로 하였다.
- 모든 실험동물은 1 주일 동안 적응기간을 가진 후 실험에 사용하였다. 통계적 유의성을 위해 군당 마우스의 수는 5 마리로 하였다.
데이터처리
- 결과의 표시는 최소 3 번 반복한 실험결과를 이용 mean ± S.E.M.로 표시하고 one-way ANOVA 및 Dunnet's test를 이용 통계적 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- Syk의 활성화로 하위 신호들인 LAT, SLP-76, Gab2, phospholipase(PL)Cγ, PLD 등의 신호전달분자 및 어댑터가 차례대로 활성화되어, 전체 알레르기 반응을 유도하는 신호체계가 활성화된다15, 16). CPE는 Lyn-Syk-LAT경로에서 초기신호전달 단백질인 Syk의 활성화를 농도 의존적으로 억제하였고, 그 다음 하위신호분자인 LAT도 동일한 경향으로 억제하였다(Fig. 3). 이러한 결과를 바탕으로 CPE는 비만세포 활성화에 중요한 Lyn-Syk-LAT 신호전달과정을 억제하여 비만세포의 활성화를 억제하는 것으로 생각된다17, 18).
- CPE는 항원에 의해 생성되는 TNF-α 나 IL-4의 생산도 농도의존적으로 억제하였다(Fig. 2).
- Fig. 2A에서 보이는 것처럼 항원에 의한 RBL-2H3 cells에서의 TNF-α 및 IL4의 발현의 증가를 CPE가 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 동물알레르기 실험에서도 CPE는 알레르기 반응을 억제하였다. 그 작용 기전으로 CPE는 항원자극에 의한 Syk kinase의 활성화를 억제하여 알레르기 반응 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 따라서 추가적인 실험을 통해 CPE를 알레르기 치료제로서의 개발이 가능할 것으로 생각된다.
- 3). 또한, BMMC에서도 초기 신호분자를 억제하는지를 immunoblot을 통해 분석한 결과 RBL-2H3 cells과 동일한 억제 효과를 나타냈다(Fig. 3). 이로써 CPE의 알레르기 반응 억제 효과는 비만세포에서 초기 신호 분자인 Syk과 LAT의 활성화 및 그 하위 신호전달단백질인 MAP kinase를 억제하는데 기인함을 알 수 있었다.
- 3). 또한, CPE는 비만세포에서 사이토카인의 생산에 중요한 신호전달단백질인 MAP kinase인 ERK1/2, p-38 및 JNK의 활성화를 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 3). 또한, BMMC에서도 초기 신호분자를 억제하는지를 immunoblot을 통해 분석한 결과 RBL-2H3 cells과 동일한 억제 효과를 나타냈다(Fig.
- 비만세포의 탈과립 시 CPE 처리로 인한 억제효과를 측정하기 위해 CPE를 10, 30, 100 μg/ml의 농도로 처리하였다. 실험 결과 CPE는 농도 의존적으로 RBL-2H3 cells과 BMMCs의 탈과립을 억제하였다(Fig. 1A 및 1B).
- IgE 매개형 PCA에 대해 억제 작용을 가진 물질을 투여할 경우 위의 반응을 억제하여 귀에 삼출되는 에반스블루의 양을 감소시키기 때문에 이 원리를 이용하여 in vivo에서 알레르기 반응 억제실험을 수행하였다. 실험 결과로 CPE는 마우스에서 항원에 의해 유도된 PCA 반응을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 4A). 더우기 귀 조직의 병리학적 관찰에서도 CPE는 귀 조직내 비만세포의 탈과립을 억제하였다(Fig.
- 3). 이러한 결과는 CPE가 비만세포에서 항원에 의한 사이토카인 생성 억제효과는 MAP kinase 활성억제 효과에 기인한다는 것을 알 수 있었다.
- 1C). 이러한 결과를 통해 CPE의 비만세포 탈과립 억제효과는 가역적임을 알 수 있었다.
- 2). 이러한 결과와 일치하게 CPE는 세 종류의 MAP kinase를 모두 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 3). 이러한 결과는 CPE가 비만세포에서 항원에 의한 사이토카인 생성 억제효과는 MAP kinase 활성억제 효과에 기인한다는 것을 알 수 있었다.
- 4B). 이러한 실험을 통해 CPE가 항원 자극에 의한 IgE 매개성 알레르기 반응을 in vivo에서도 효과적으로 차단함을 알 수 있었다.
- 3). 이로써 CPE의 알레르기 반응 억제 효과는 비만세포에서 초기 신호 분자인 Syk과 LAT의 활성화 및 그 하위 신호전달단백질인 MAP kinase를 억제하는데 기인함을 알 수 있었다.
- 종합하면, 해안사구식물인 CPE는 항원자극에 의한 비만세포의 세포내 과립 및 사이토카인 등의 알레르기 유발인자의 분비를 억제하였다. 동물알레르기 실험에서도 CPE는 알레르기 반응을 억제하였다.
후속연구
- 그 작용 기전으로 CPE는 항원자극에 의한 Syk kinase의 활성화를 억제하여 알레르기 반응 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 따라서 추가적인 실험을 통해 CPE를 알레르기 치료제로서의 개발이 가능할 것으로 생각된다.
- 좀보리사초는 FcεRI 매개성 신호 경로 중 초기 신호 전달 분자인 Syk의 활성화 억제를 통해 하위 신호분자인 LAT 및 MAP kinase 등의 활성화를 순차적으로 억제함으로써 탈과립 및 알레르기 반응 억제 효능을 나타내었다. 이러한 연구결과를 통해 좀보리사초가 향후 알레르기질환 치료제의 소재로 활용될 수 있음을 제시하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.