선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 실험에서는 탈과립의 지표로 사용되는 β-hexosaminidase를 측정하여 낙지다리 추출물의 억제효과를 확인하였다9).
- 본 연구에서 PCE의 비만세포 탈과립 억제효과의 기전을 연구하기 위해 우선 이 억제효과가 칼슘이온 증가의 상위 신호전달물질인지 하위 신호경로를 억제하는 것인지를 알아보기 위해 본 실험을 진행하였다. 비만세포를 이오노마이신과 탭시가긴을 처리 시 비만세포에서 탈과립이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
- 하지만 알레르기 질환에 대한 낙지다리의 효능에 대한 보고는 존재하지 않는다. 본 연구에서는 낙지다리 추출물의 비만세포 억제 효과 및 알레르기 유발 동물모델에서 알레르기 억제 효과 등을 규명하기 위해 수행하였다.
- 일반적으로 비가역적인 물질은 체내 투여시 체내 단백질에 결합하여 그 단백질이 제거 될 때 까지 약효를 진속하게 되어 부작용 가능성을 증가 시킨다16). 이러한 비가역성에 의한 부작용 가능성을 관찰하기 위해 우리는 낙지다리 추출물의 가역성 실험을 진행하였다. 실험결과 낙지다리 추출물은 비만세포 활성 억제효과가 가역적임을 관찰하였다(Fig.
제안 방법
- β-hexosaminidase 분비 측정은 Tyrode (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM HEPES, 5.6 mM glucose, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.5% fatty acid-free fraction V from bovine serum, pH 7.4)완충용액과 PIPES (25 mM PIPES, 159 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2. 5.6 mM glucose, 0.5%fatty acid-free fraction V from bovine serum, pH 7.4) 완충용액을 이용하여 실험을 진행하였다.
- 1 시간 후 마우스를 안락사 시키고 귀를 적출하여 700 μl의 포름아마이드로 63oC에서 12 시간 동안 에반스블루를 추출 후 상등액을 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 1 시간 후 항원(DNP-BSA, 1 mg/ml)을 에반스 블루 용액을 이용하여 5mg/ml 농도로 제조하여 250 μl를 꼬리로 정맥 투여하였다.
- BMMCs(3.3 × 105/well) 혹은 RBL-2H3 cells(1.8 × 105/well) 두 종류의 비만세포를 24-flask에 분주하고 20 ng/ml DNP-특이 IgE를 포함한 배지에서 12시간 이상 감작하여 비만세포 FcεRI에 IgE가 결합하도록 하였다.
- DNP (dinitrophenol)-specific IgE에 의한 국소 알레르기피부 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 유도하기 위해 마우스(BALB/c, 5주령 수컷) 의 오른쪽 귀에 DNP-specific IgE를 피내로 0.5 μg를 주사하였다.
- IgE로 감작된 BMMCs, RBL-2H3 cells에 PIPES (or Tyrod buffer)로 희석한 PCE를 각각 농도별로 첨가한 다음, 20 ng/ml의 항원을 넣어 10분 동안 자극하고 얼음위에서 반응을 정지시켰다. 항원에 의해 자극된 세포는 약 4oC PBS 완충용액으로 2번 세척한 후 세포파쇄용액 (20 mM HEPES, pH 7.
- RBL-2H3 세포에 한 그룹은 PCE를 100 μg/ml으로 30분 동안 전처리를 진행 하였고 다른 한 그룹은 PCE를 동일한 농도로 30분 전 처리 한 후 PIPES 완충용액으로 5회 세척하여 탈과립의 현상이 회복되는 것을 관찰하였다.
- 낙지다리 추출물(분양번호, 007-019)은 한국식물추출물은행으로부터 분양받아 실험을 진행하였다. 낙지다리 추출과정은 건조된 낙지다리 전초 100 g을 50oC 메탄올1000 ml에서 초음파 추출기를 이용하여 하였으며 스피드백을 이용하여 40oC에서 24시간 건조과정을 거쳤다. 이러한 과정으로 추출한 최종 회수율은 약 15% 였다.
- 5 μg를 주사하였다. 다음 날 5% 아라비아검 용액에 녹인 낙지다리추출물을 40 mg/kg, 200 mg/kg, 1000 mg/kg 경구 투여 하였다. 1 시간 후 항원(DNP-BSA, 1 mg/ml)을 에반스 블루 용액을 이용하여 5mg/ml 농도로 제조하여 250 μl를 꼬리로 정맥 투여하였다.
- 생쥐의 골수에서 유래한 비만세포(BMMCs, Bone marrow-derived mast cells)는 5주령의 수컷 Balb/c 마우스의 골수로부터 채취하였다. 마우스로부터 분리한 골수의 세포는 RPMI배지(RPMI 1640, 10% FBS, 0.1 mM non-essesntial amino acid 및 2 mM L-glutamine)에 IL-3(10 ng/ml)이 포함된 배양액을 사용하여 4주 이상 배양 후 BMMC로의 분화가 98%이상 되었음을 FACS분석을 통해 확인한 후 실험에 사용하였다.
- 05 미만일 경우에 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다. 모든 실험은 3회 반복으로 실시하였다.
- 물과 사료는 자유롭게 먹도록 하였으며, 사육환경은 온도 22±1oC, 습도 55 ± 10%로 유지하였고, 낮과 밤의 주기는 각각 12 시간으로 하였다.
- 본 논문에서도 FcεRI 매개한 신호전달에 중점을 두어 실험을 진행하였다.
- 이러한 과정으로 추출한 최종 회수율은 약 15% 였다. 비만세포 억제 실험에 사용하기 위해서 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 100 mg/ml 농도로 제조 한 후, 최종 처리 농도로 희석하여 실험에 적용하였다.
- 1 시간 후 마우스를 안락사 시키고 귀를 적출하여 700 μl의 포름아마이드로 63oC에서 12 시간 동안 에반스블루를 추출 후 상등액을 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 에반스 블루의 정량은 표준 정량곡선을 이용하여 측정하였다.
- 4) 완충용액을 이용하여 실험을 진행하였다. 우선 37oC 완충용액으로 각각의 세포를 2번 세척 후 well당 각 농도별로 완충용액에 희석된 추출물을 첨가하고 30분 전처리를 하였다. 그 후 20 ng/ml의 항원을 각 well에 첨가하여 10분 동안 세포자극을 진행하였다.
- 이후 분석하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체를 1000배로 희석하여 4oC에서 overnight로 반응시킨 후 TBS-T로 세척한 뒤 2000배로 희석한 HRP-con-jugation된 2차 항체로 1시간 상온에서 반응시켰다. 이후 10분씩 5번 TBS-T 완충액으로 세척하고 chemiluminescence analyzer로 단백질 밴드를 확인하였다.
- 05% Tween 20) 완충액으로 1시간 동안 blocking을 시켰다. 이후 분석하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체를 1000배로 희석하여 4oC에서 overnight로 반응시킨 후 TBS-T로 세척한 뒤 2000배로 희석한 HRP-con-jugation된 2차 항체로 1시간 상온에서 반응시켰다. 이후 10분씩 5번 TBS-T 완충액으로 세척하고 chemiluminescence analyzer로 단백질 밴드를 확인하였다.
대상 데이터
- RBL-2H3 (Rat Basophil Leukemia) cell은 ATCC (Ameri-can Type Culture Collection)에서 분양받아 15% FBS가 포함된 MEM (penicillin /streptomycin 및 L-glutamine 포함)을 배양액으로 하여 5% CO2 incubator에서, 2-3일 간격으로 계대 배양 하였다.
- 또한 PP2는 Calbiochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다. RPMI-1640 및 Minimal Essen-tial Medium (MEM), 배양액에 첨가되는 Glutamine과 그외 세포배양 시약은 GIBCO Technologies Inc. (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. Western blot에 사용되는 Phospho-Syk 및 Phospho-LAT 항체는 Cell signalling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며 그 외에 actin을 검출하기 위한 항체는 Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다.
- (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. Western blot에 사용되는 Phospho-Syk 및 Phospho-LAT 항체는 Cell signalling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며 그 외에 actin을 검출하기 위한 항체는 Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다. 기타 모든 시약은 시중 제품 중 특급 시약을 구입하여 사용하였다.
- 낙지다리 추출물(분양번호, 007-019)은 한국식물추출물은행으로부터 분양받아 실험을 진행하였다. 낙지다리 추출과정은 건조된 낙지다리 전초 100 g을 50oC 메탄올1000 ml에서 초음파 추출기를 이용하여 하였으며 스피드백을 이용하여 40oC에서 24시간 건조과정을 거쳤다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한 PP2는 Calbiochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다. RPMI-1640 및 Minimal Essen-tial Medium (MEM), 배양액에 첨가되는 Glutamine과 그외 세포배양 시약은 GIBCO Technologies Inc.
- 생쥐의 골수에서 유래한 비만세포(BMMCs, Bone marrow-derived mast cells)는 5주령의 수컷 Balb/c 마우스의 골수로부터 채취하였다. 마우스로부터 분리한 골수의 세포는 RPMI배지(RPMI 1640, 10% FBS, 0.
- 실험에 사용한 동물은, (주)오리엔탈바이오(성남)에서 생후 5 주령 수컷 Balb/c 마우스를 구입하여 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 먹도록 하였으며, 사육환경은 온도 22±1oC, 습도 55 ± 10%로 유지하였고, 낮과 밤의 주기는 각각 12 시간으로 하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 mean ± S.E.로 나타내었으며, 각 군 간의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)에 이은 Student’s t-test 분석을 실시하였다.
이론/모형
- 본 연구에서는 PCE 전처리에 의한 비만세포에서의 사이토카인 생산 억제 효과를 RT-PCR 기법으로 측정하였다. PCE는 농도 의존적으로 TNF-α 와 IL-4의 mRNA 발현을 현저히 억제하였다(Fig.
성능/효과
- IL-4의 mRNA 발현은 PCE 30 μg/ml 농도에서부터 대조군과 비교하여 유의적으로 억제되었으며(p < 0.05), TNF-α의 mRNA 발현은 PCE 100 μg/ml 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 억제되었다(p < 0.05), PCE 100 μg/ml에서는 대조약물로 사용된 PP2와 유사한 정도의 억제 효과가 관찰되었다(Fig. 3B).
- PCE 100 μg/ml 농도로 전처리한 군에서 β-hexosaminidase 분비는 대조군과 비교하여 70% 이상 억제 되었으나 PIPES 완충용액으로 5회 세척해 준 군은 대조군의 약 90%까지 회복되었다(Fig. 2).
- 이러한 신호전달을 바탕으로 활성화된 비만세포는 세포질 내 칼슘 농도가 증가되는데 이러한 증가는 비만세포내의 과립의 탈 과립을 유도한다. PCE가 비만세포 탈 과립 억제의 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 1)
- PCE은 세포독성이 없는 0-100 μg/ml에서 비만세포 초기 활성신호전달경로인 Syk/LAT의 신호전달경로 활성을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(Fig. 5).
- 또한 Syk kinsae의 인산화 활성이 억제됨으로 LAT 인산화 활성 역시 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 낙지다리추출물은 Syk kinase의 인산화를 억제하므로서 항원에 의해 유도되는 비만세포의 탈과립을 억제할 수 있음을 알 수 있었다(Fig. 5). 이러한 결과는 RBL-2H3 cell 뿐만 아니라 골수유래의 세포에서 분화시킨 비만세포(BMMC)에서도 항원자극에 의한 Syk/LAT 신호전달경로가 유사한 정도로 억제된다는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 5에서, PCE는 농도 의존적으로 Syk kinase의 인산화를 억제하여 활성을 감소시키는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 Syk kinsae의 인산화 활성이 억제됨으로 LAT 인산화 활성 역시 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 낙지다리추출물은 Syk kinase의 인산화를 억제하므로서 항원에 의해 유도되는 비만세포의 탈과립을 억제할 수 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 이러한 식물 추출물의 마우스에서의 알레르기 반응 억제 ED50는 대부분 200-500 mg/kg 이며 본 연구의 낙지다리 추출물의 경우에도 유사한 ED50를 보였다. 또한,낙지다리 추출물은 비만세포의 신호전달과정 중 Syk kinase의 활성화 억제를 통해 알레르기 반응을 억제하였다. 하지만 이러한 억제가 어떤 상위 kinase의 활성 조절에 의한 것인지는 추후 보완 연구가 더 필요하다.
- 본 연구에서 PCE의 비만세포 탈과립 억제효과의 기전을 연구하기 위해 우선 이 억제효과가 칼슘이온 증가의 상위 신호전달물질인지 하위 신호경로를 억제하는 것인지를 알아보기 위해 본 실험을 진행하였다. 비만세포를 이오노마이신과 탭시가긴을 처리 시 비만세포에서 탈과립이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 이러한 물질을 처리하기 전 PCE을 전처리하였을 때 PP2 와는 달리 PCE의 전처리에 의해서 탈과립의 억제 효과는 보이지 않았다(Fig.
- 이러한 비가역성에 의한 부작용 가능성을 관찰하기 위해 우리는 낙지다리 추출물의 가역성 실험을 진행하였다. 실험결과 낙지다리 추출물은 비만세포 활성 억제효과가 가역적임을 관찰하였다(Fig. 2). 이러한 가역성은 낙지다리 추추물의 부작용 가능성을 다소 낮추어 준 것으로 평가되었다.
- 알레르기 동물모델에서 PCE의 알레르기 반응 억제효과를 측정한 결과, 항원 자극에 의한 알레르기 반응은 잘 유도 되었으며 PCE 처리에 의해 억제되었다(Fig. 6A). 이러한 억제 결과는 PCE 0-1000 mg/kg 농도 범위 내에서 농도 의존적으로 억제되었으며 최고농도인 1000 mg/kg 투여군에서는 대조약물로 사용된 세트리진과 동일한 효과를 보였다.
- 5). 이러한 결과는 RBL-2H3 cell 뿐만 아니라 골수유래의 세포에서 분화시킨 비만세포(BMMC)에서도 항원자극에 의한 Syk/LAT 신호전달경로가 유사한 정도로 억제된다는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 5).
- 2). 이러한 결과로부터, PCE의 비만세포 탈과립 억제효과는 가역성을 가짐을 알 수 있었다.
- 꾸지뽕나무 추출물은 항원에 의한 비만세포의 Lyn/Syk 경로의 활성화억제를 통해 알레르기 반응억제 효능을 가지는 것으로 보고되어 갈매나무 추출물의 억제 기전과는 다소 차이가 있었다18). 이러한 식물 추출물의 마우스에서의 알레르기 반응 억제 ED50는 대부분 200-500 mg/kg 이며 본 연구의 낙지다리 추출물의 경우에도 유사한 ED50를 보였다. 또한,낙지다리 추출물은 비만세포의 신호전달과정 중 Syk kinase의 활성화 억제를 통해 알레르기 반응을 억제하였다.
- 6A). 이러한 억제 결과는 PCE 0-1000 mg/kg 농도 범위 내에서 농도 의존적으로 억제되었으며 최고농도인 1000 mg/kg 투여군에서는 대조약물로 사용된 세트리진과 동일한 효과를 보였다.
- 종합적으로 우리나라에서 자생하는 낙지다리 식물 추출물은 항원 자극에 의한 비만세포의 탈과립, 사이토카인 분비 및 동물모델에서 알레르기 반응을 세포내 Syk/LAT 신호전달경로를 억제하여 나타남을 확인할 수 있었다. 이러한 억제 현상은 가역성을 가져 추후 사람에게의 적용 가능성이 높아 환자에 적용하기 위해 독성 및 성분연구에 대한 추가 연구가 필요한 것으로 생각된다.
- 항원자극에 의한 비만세포에서의 β-hexo-saminidase 분비가 농도 의존적으로 억제되었으며, 처리농도 100 μg/ml에서 비만세포의 탈과립 현상이 약 80% 정도가 억제되는 우수한 효능이 관찰되었다(Fig. 1).
후속연구
- 종합적으로 우리나라에서 자생하는 낙지다리 식물 추출물은 항원 자극에 의한 비만세포의 탈과립, 사이토카인 분비 및 동물모델에서 알레르기 반응을 세포내 Syk/LAT 신호전달경로를 억제하여 나타남을 확인할 수 있었다. 이러한 억제 현상은 가역성을 가져 추후 사람에게의 적용 가능성이 높아 환자에 적용하기 위해 독성 및 성분연구에 대한 추가 연구가 필요한 것으로 생각된다.
- 또한,낙지다리 추출물은 비만세포의 신호전달과정 중 Syk kinase의 활성화 억제를 통해 알레르기 반응을 억제하였다. 하지만 이러한 억제가 어떤 상위 kinase의 활성 조절에 의한 것인지는 추후 보완 연구가 더 필요하다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.