[논문]On-line Screening HPLC-ABTS+ assay를 이용한 청호로부터 유용성분의 항산화 활성 분석

이광진; 마진열

doi:10.3839/jabc.2014.047

On-line Screening HPLC-ABTS+ assay를 이용한 청호로부터 유용성분의 항산화 활성 분석
Antioxidant Activity Analysis of Useful Compounds from Artemisiae Annuae Herba Using On-line Screening HPLC-ABTS+ Assay 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.57 no.4, 2014년, pp.301 - 305

이광진 (Korean Institute of Oriental Medicine (KIOM), KM-Based Herbal Drug Development Group) , 마진열 (Korean Institute of Oriental Medicine (KIOM), KM-Based Herbal Drug Development Group)

초록
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On-line screening high performance liquid chromatography (HPLC)-$ABTS^+$ assay를 이용한 청호로부터 chlorogenic acid, caffeic acid, vitexin, queretin, aremisinin의 항산화 활성을 온라인스크리닝 하였다. 이때 침적방법을 적용한 추출시간과 추출용매 조성으로부터 추출효율을 확인하였다. 이 결과 100% 물 추출물에서 수율이 가장 좋왔고 chloroenic acid의 항산화 활성이 가장 높았다. 또한 on-line screening HPLC-$ABTS^+$ assay 분석은 천연물에서 항산화 활성을 신속하게 탐색하는데 효율적이다.

Abstract ▼ AI-Helper

The Antioxidant activity screening identification of five kind compounds in Artemisiae annuae herba with the on-line screening high performance liquid chromatography (HPLC) $ABTS^+$ assay. The various experimental variables such as the extraction time (h) and extraction solvent composition (%) of dipping method were investigated efficiently extraction at the room temperature $25^{\circ}C$. The results, the highest yield of total extract amount (0.458 g, 15.250%) was obtained by dipping method with 100% water and extraction time to 3 h. And the on-line screening HPLC-$ABTS^+$ assay method was rapid and efficient to search for bioactivity from natural products.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

Fig. 3에서는 청호 시료1 g에서 최적의 추출조건을 확립하기 위하여 침적방법(dipping)을 적용한 상온(25°C)에서 추출용매 100% 물, 추출시간 1−6 h 동안 수행하였다.
Radical scavenging 항산화 활성 분석을 위하여 ABTS+ 시험법을 사용했으며 사용된 시약은 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS+ , C18H24N6S4)와 potassium persulfate를 사용하여 완전히 녹인 후, ABTS+ 시약과 충분히 교반 후 차광시켰다.
따라서 100% 물 추출물의 추출효율이 가장 좋왔고 100% 메탄올 추출물의 추출효율이 가장 낮았다. Table 2에서는 5가지 지표성분에 대하여 각각 200 ppm으로 제조한 뒤 빠른 항산화 활성 능력을 on-line screening HPLC-ABTS⁺ assay 시스템으로 살펴보았다.
UV 검출기(DAD; diode array detector)의 파장범위를 200−450 nm로 적용하여 210, 254, 280, 320 nm로 검출하였고, 항산화 활성은(MWD; multiple wavelength detector)의 734 nm로 나타내었다.
각 시료는 200 mL 비이커에 추출용매 50% 수용성 메탄올, 100% 메탄올, 100% 물을 각각 100 mL를 첨가하여 침적방법(dipping)을 적용하여 추출시간 1−6 h동안 2회 반복 실험을 시행하여 물질의 변화를 확인하였다.
070) 순으로 활성도가 높았다. 또한 추출 시료의 양이 증가된 50 g을 100% 물 추출(수율: 8.34%)에서 확보된 시료를 50 mg/mL로 제조하여 분석하였다. 결과적으로 각 지표성분의 항산화 활성은 50% 수용성 메탄올에서는 chlorogenic acid (1, Negative peak area (mAU) 23.
약리작용으로서는 해열, 이담, 구충 및 피부진균, 황달, 악창, 탈모의 치료 등에 쓰여지고 있다(Kim, 등 1999; 2002). 본 연구는 상용공정의 기초 데이터를 제시하기 위한 방법으로 청호의 추출액 포함된 chlorogenic acid, caffeic acid, queretin, aremisinin, vitexin의 성분을(Jung 등, 2011), On-line screening high performance liquid chromatography (HPLC)-ABTS⁺ assay을 이용하여 항산화 활성을 온라인스크리닝 하였고, 각 추출물의 추출 효율을 확인 하였다(Lee 등, 2009).
1 v/v%), B: Acetonitrile(100 v/v%)을 사용하여 (A:B 90-30:10-70 v/v%)으로 60 min 동안 일정용매조성법으로 실험하였다. 본 연구는 청호의 지표성분인 chlorogenic acid, caffeic acid, vitexin, queretin, aremisinin를 선정하였고 추출 거동을 확인하기 위하여 침적추출(dipping)을 적용한 추출용매 50% 수용성 메탄올, 100% 메탄올, 100% 물의 조건을 설정하였다. 이것의 각 추출물에서 얻은 지표성분(표준물질; 순도: 98%>)과 추출물의 빠른 항산화 활성이 확인되었고 각 추출물의 함량과 수율을 분석하여 기능성소재로 사용이 가능한 기초 자료를 제시하였다.
분석에 사용된 컬럼은(RS-Tech 4.6×250 mm, 5 µm, C18, Korea)와 유속은 1.0 mL/min, 주입부피는 10 µL, 컬럼오븐 온도 40°C로 고정하였다.
시료의 균일성을 위하여 수분조절 용기(desiccator)에 보관하여 사용하였고 모든 시료들은 주입하기 전에 막 여과지(PVDF 0.2 µm, Waters Co., USA)를 이용하여 여과를 하였다.
18 L ×550 mm Viper 550 mm, USA)가 연결되었고, 데이터 처리는 Dionex Co.의 PC에 설치된 Chromeleon data acquisition system (Dionex version 7)과 HPLC-DAD를 사용하여 분석을 하였다. Fig 2에서는 on-line screening HPLC-ABTS⁺ assay 시스템을 나타내었다.
이것의 각 추출물에서 얻은 지표성분(표준물질; 순도: 98%>)과 추출물의 빠른 항산화 활성이 확인되었고 각 추출물의 함량과 수율을 분석하여 기능성소재로 사용이 가능한 기초 자료를 제시하였다.
UV 검출기(DAD; diode array detector)의 파장범위를 200−450 nm로 적용하여 210, 254, 280, 320 nm로 검출하였고, 항산화 활성은(MWD; multiple wavelength detector)의 734 nm로 나타내었다. 이동상은 이성분계 A: H₂O/TFA (99.9/0.1 v/v%), B: Acetonitrile(100 v/v%)을 사용하여 (A:B 90-30:10-70 v/v%)으로 60 min 동안 일정용매조성법으로 실험하였다. 본 연구는 청호의 지표성분인 chlorogenic acid, caffeic acid, vitexin, queretin, aremisinin를 선정하였고 추출 거동을 확인하기 위하여 침적추출(dipping)을 적용한 추출용매 50% 수용성 메탄올, 100% 메탄올, 100% 물의 조건을 설정하였다.
이후 소량의 시료를 0.2 µm PVDF Membrane filter로 여과하여 on-line screening HPLC-ABTS+ assay 분석에 사용하였다.
3 A person Hannil Mixer FM)에서 2 min 동안 분쇄 후 입자를 채 거름(30 µm)으로 분별하여 시료로 사용하였다. 이후, 청호 건조분말로부터 추출 효율을 확인하기 위하여 추출시간 변화는 시료 1g을, 다양한 용매 조성변화는 시료 3g을, 각각 적용하였다. 각 시료는 200 mL 비이커에 추출용매 50% 수용성 메탄올, 100% 메탄올, 100% 물을 각각 100 mL를 첨가하여 침적방법(dipping)을 적용하여 추출시간 1−6 h동안 2회 반복 실험을 시행하여 물질의 변화를 확인하였다.
청호 건조시료 50 g을 샘플의 10배 부피로 물에 1 h 동안 침적한 다음 3 h 동안 100oC에서 열탕 추출(Gyeongseo, Cosmos-660, Korea) 하였다. 추출된 추출물은 standard testing sieve (150 µm, Rs-tech, Germany)로 여과 후 동결 건조 하였다.
추출물에는 많은 양의 불순물들이 포함되어 있기 때문에 용매추출 후 여지필터(pore size: 5 µm)에서 감압 여과하여 시료 잔유물과 분리시켰고 이후 감압 농축 후 동결건조(refrigerated vapor trap)를 하여 전체 추출 수율 계산과 시험용액으로 사용 하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 청호(Artemisiae Annuae Herba) 시료는 영천 현대약업사(한국)에서 구매하여 한국한의학 연구원 한의신약개발그룹에서 엄선된 시료를 사용하였다. 표준시료인 chlorogenic acid, caffeic acid, queretin, aremisinin은 Sigma-Aldrich (USA)에서 vitexin은 Fluka (USA)에서 구입하였다.
용매는 HPLC급(99.9%)으로 메탄올, 아세토나이트릴은 J.T. Baker Inc (USA)과 TFA은 Sigma-Aldrich용액을 사용하였으며 그리고 물은 초순수 제조장치 Waters (Milipore, USA)를 이용하여 제조한 3차 증류수를 0.2 µm mbrane filter (Advantec, Japan)로 여과 처리하여 사용하였다.
일정한 상온(25°C)에서 수행 하였으며 건조 분쇄된 시료는 푸두믹스(220 W, 1.3 A person Hannil Mixer FM)에서 2 min 동안 분쇄 후 입자를 채 거름(30 µm)으로 분별하여 시료로 사용하였다.
본 연구에 사용된 청호(Artemisiae Annuae Herba) 시료는 영천 현대약업사(한국)에서 구매하여 한국한의학 연구원 한의신약개발그룹에서 엄선된 시료를 사용하였다. 표준시료인 chlorogenic acid, caffeic acid, queretin, aremisinin은 Sigma-Aldrich (USA)에서 vitexin은 Fluka (USA)에서 구입하였다. 시료의 균일성을 위하여 수분조절 용기(desiccator)에 보관하여 사용하였고 모든 시료들은 주입하기 전에 막 여과지(PVDF 0.

성능/효과

결과적으로 각 지표성분의 항산화 활성은 50% 수용성 메탄올에서는 chlorogenic acid (1, Negative peak area (mAU) 23.769) > caffeic acid (2, Negative peak area (mAU) 13.550)의 활성을 보였고, 100% 메탄올에서는 caffeic acid (2, Negative peak area (mAU) 11.827) > chlorogenic acid (1, Negative peak area (mAU) 9.581)의 활성을 보였으며, 100% 물에서는 chlorogenic acid (1, Negative peak area (mAU) 32.780) > caffeic acid (2, Negative peak area (mAU) 12.911)의 활성을 나타내었다.
4575 g을 얻을 수 있었다. 따라서 100% 물 추출물의 추출효율이 가장 좋왔고 100% 메탄올 추출물의 추출효율이 가장 낮았다. Table 2에서는 5가지 지표성분에 대하여 각각 200 ppm으로 제조한 뒤 빠른 항산화 활성 능력을 on-line screening HPLC-ABTS⁺ assay 시스템으로 살펴보았다.
또한 추출물 함량은 50% 수용성 메탄올 추출물에서 0.459−0.434 g과 평균 0.4465 g, 100% 메탄올 추출물에서 0.227−0.210 g과 평균 0.218 g, 100% 물 추출물에서 0.460−0.455 g과 평균 0.4575 g을 얻을 수 있었다.
이 결과 산업적 경제성을 고려한 고효율 고비용의 추출조건이 제조공정 특성에 맞게 제시 되어야 할 것이며 나아가 기초 데이터의 사용은 공학적 기반을 기초로 한 수학적 모델링을 통해 산업적 적용을 예측해야 될 것으로 사료된다. 뿐만 아니라 전 처리한 추출액에 포함된 청호로부터 on-line screening HPLC-ABTS⁺ assay를 이용한 항산화 활성을 빠르게 screening하여 탐색하고 최적의 추출조건을 실험적으로 모색 할 수 있었다.
Table 1에서는 청호 시료 3g에서 추출용매 선정에 따른 추출 효율을 확인하였다. 용매조성 변화에 따라 추출수율(yield)의 변화는 50% 수용성 메탄올 추출물에서 14.883%, 100% 메탄올 추출물에서 7.430%, 100% 물 추출물에서 15.250%의 추출 거동을 확인 할 수 있었다(선행 실험 Fig. 3). 또한 추출물 함량은 50% 수용성 메탄올 추출물에서 0.
이 결과 chlorogenic acid, queretin, caffeic acid에서 항산화 활성을 확인하였고 aremisinin, vitexin에서는 항산화 활성을 확인하지 못했다. 이때 queretin (Negative peak area (mAU) 77.
3%)이 함유되었다. 이 결과 최적의 추출 시간은 3h으로 선정하였고 4 h 이후부터는 완만한 추출 거동 및 미미한 수율(%) 변화를 보였다. 일반적으로 천연물 및 한약재에서의 추출은 물질이 가지고 있는 조직적 특성 및 성상에 따라 재배 특성에 따라 추출 시스템에 따라 추출 효율의 차이가 클 것으로 보인다(Hazra, 등 2004).

후속연구

또한 활성산소(free radical oxygen radical)에 기인하여 추출 과정 중 유용성분이 소멸되거나 유용성분의 함유되는 정도는 매우 큰 차이가 있을 것으로 사료된다(Ridder, 등 2008). 이 결과 산업적 경제성을 고려한 고효율 고비용의 추출조건이 제조공정 특성에 맞게 제시 되어야 할 것이며 나아가 기초 데이터의 사용은 공학적 기반을 기초로 한 수학적 모델링을 통해 산업적 적용을 예측해야 될 것으로 사료된다. 뿐만 아니라 전 처리한 추출액에 포함된 청호로부터 on-line screening HPLC-ABTS⁺ assay를 이용한 항산화 활성을 빠르게 screening하여 탐색하고 최적의 추출조건을 실험적으로 모색 할 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	청호의 약리 효과에는 무엇이 있는가?	청호의 성분으로는 abrotamine, vitamin A, βbourbonene, caryophyllene, α-pinene, β-pinene, 1,8-cineole, α-thujone 등이 함유되어있다(Kim, 등 1994). 약리작용으로서는 해열, 이담, 구충 및 피부진균, 황달, 악창, 탈모의 치료 등에 쓰여지고 있다(Kim, 등 1999; 2002). 본 연구는 상용공정의 기초 데이터를 제시하기 위한 방법으로 청호의 추출액 포함된 chlorogenic acid, caffeic acid, queretin, aremisinin, vitexin의 성분을(Jung 등, 2011), On-line screening high performance liquid chromatography (HPLC)-ABTS+ assay을 이용하여 항산화 활성을 온라인스크리닝 하였고, 각 추출물의 추출 효율을 확인 하였다(Lee 등, 2009).
	청호의 성분에는 무엇이 있는가?	국화과의 식물로서 일명 황화호(黃花蒿)의 전초를 말하며 1년생 또는 2년생 초본으로 높이는 30−150 cm, 줄기는 원통형이며 어릴적에는 청록색이다(Kim, 등 1999). 청호의 성분으로는 abrotamine, vitamin A, βbourbonene, caryophyllene, α-pinene, β-pinene, 1,8-cineole, α-thujone 등이 함유되어있다(Kim, 등 1994). 약리작용으로서는 해열, 이담, 구충 및 피부진균, 황달, 악창, 탈모의 치료 등에 쓰여지고 있다(Kim, 등 1999; 2002).
	온라인스크리닝 결과 청호의 어떤 성분이 가장 항산화 활성이 높았는가?	이때 침적방법을 적용한 추출시간과 추출용매 조성으로부터 추출효율을 확인하였다. 이 결과 100% 물 추출물에서 수율이 가장 좋왔고 chloroenic acid의 항산화 활성이 가장 높았다. 또한 on-line screening HPLC-ABTS+ assay 분석은 천연물에서 항산화 활성을 신속하게 탐색하는데 효율적이다.

참고문헌 (12)

Hazra B, Sarma MD, and Sanyal U (2004) Separation methods of quinonoid constituents of plants used in Oriental traditional medicines. J of Chroma B 812, 259-75.

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Inoue K, Kitade M, Hino T, and Oka H (2011) Screening assay of angiotensin-converting enzyme inhibitory activity from complex natural colourants and foods using high-throughput LC-MS/MS. F Chemistry 126, 1909-15.

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Jung HA, Nurul Islam MD, Kwon YS, Jin SE, Son YK, Park JJ et al. (2011) Extraction and identification of three major aldose reductase inhibitors from Artemisia montana. F and Chemical Toxi 49, 376-84.

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Kim KS, Lee SH, Lee YS, Jung SH, Park YM, Shin KH et al. (2003) Antioxidant activities of the extracts from the herbs of Artemisia apiacea. J of Ethnoph 85, 69-72.

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Kim KS, Lee SH, Shin JS, Shim SH, and Kim BK (2002) Arteminin, a new coumarin from Artemisia apiacea. Fitoterapia 73, 266-8.

상세보기
Kim KS, Shim SH, Jang JM, Cheong JH, and Kim BK (1999) A Study on Hair-growth Activity of Artemisia apiacea Hance. Yakhak Hoeji 43, 798-01.
Kim OC and Jang HJ (1994) Volatile components of Artemisia apiacea Herba. Agr Chemistry and Biot 37, 37-42.
Lee KJ and Um BH (2008) Extraction of Useful component from Natural plants using Ultrasound system. Korean J Biotechnol Bioeng 23, 101-8.
Lee KJ, Liang C, Yang HJ, and Ma JY (2012) Rapid Identification of Homoorientin from Phyllostachys bambusoides Leaves by HPLC On-line $ABTS^+$ Screening Method. Yakhak Hoeji 56, 217-21.
Lee KJ, Shin YK, and Kim YS (2009) Enhanced effect extraction of Antioxidant substance Homoorientin from Pseudosasa japonica and Phyllostachys bambusoides leaves using Ultrasonic wave system. Korean J Biotechnol Bioeng 24, 189-94.
Ridder SD, Kooy FVD, and Verpoorte R (2008) Artemisia annua as a self-reliant treatment for malaria in developing countries- Review. J of Ethnopharmacology 120, 302-14.

상세보기
Song XY, Li YD, Shi YP, Ling J, and Chen J (2013) Quality control of traditional Chinese medicines: a review. Chinese J of Nat Medi 11, 596-607.

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표제어: PCR

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용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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