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문제 정의
- elegans의 HSF-1 또한 수명조절에 중요한 인자로 알려져 있으며 amyloid beta peptide에 의해 생성된 toxic oligomer를 rapid disaggregation 시키고, longevity의 transcription factor로서 역할이 보고되고 있다6). 본 연구에서는 한방에서 다빈도로 이용되고, 비위의 기를 보해주는 대조(大棗)의 예쁜꼬마선충의 수명연장효과와 그 기전을 실험적으로 살펴보았다.
- 본 연구에서는 약리활성을 가진 2차대사산물들의 인체 흡수를 증강시키기 위한 일환으로 대조추출물을 붉은 덕다리버섯(Laetiporus sulphureus)으로 발효시켜 발효액을 얻었다. 발효하지 않은 대조추출물과 대조추출물의 발효액의 수명연장효과를 예쁜꼬마선충(C.
- 그리고 HSF-1의 경우 뇌의 toxic oligomer인 amyloid beta를 효율적으로 분해시키며 proteostasis를 제어하여 생명연장에 기여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 발효대추액의 C. elegans 수명연장에 관한 연구를 실시하여 유의적 활성효과를 관찰하였다. 발효하지 않은 대조추출물의 경우 생명연장효과가 관찰되지 않았으며 발효 7일째의 대조추출물이 유의적 활성을 나타내었다.
제안 방법
- 배양은 5 L 발효조를 이용하여 7일, 14일간, 37℃, pH 5∼7로 유지하며 배양하였다.
- 본 연구에서는 약리활성을 가진 2차대사산물들의 인체 흡수를 증강시키기 위한 일환으로 대조추출물을 붉은 덕다리버섯(Laetiporus sulphureus)으로 발효시켜 발효액을 얻었다. 발효하지 않은 대조추출물과 대조추출물의 발효액의 수명연장효과를 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 이용하여 평가하였으며, 스트레스가 수명연장 효과에 영향을 미치는지를 열저항성 실험을 통하여 확인하였다.
- 분말 100 g을 정제수 1L에 섞어주고, 붉은 덕다리버섯(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494Ｐ) 균주를 배양액에 첨가하였다. 여기에 탄소원으로 포도당 4%와 펩톤 0.5%를 첨가하여 배양하였다. 배양은 5 L 발효조를 이용하여 7일, 14일간, 37℃, pH 5∼7로 유지하며 배양하였다.
- 배양 후 배양액을 원심 분리하여 배양균을 1차 제거하였다. 배양균을 제거한 대조 발효물을 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman, No. 10) 여과지로 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 0.
- elegans를 3∼4일 간격으로 옮겨주며 배양하였다. 동일한 연령의 개체를 확보하기 위하여 Syncronized L1 stage의 예쁜 꼬마선충 100마리 정도를 NGM agar plate 옮겨서 72시간 동안 배양하여 L4 stage Lavae가 되도록 하였다. 10마리의 adult worm을 약물이 처리된 6 cm plate와 약물이 처리되지 않은 plate에 각각 옮겨 3시간 정도 egg laying을 하고 plate에서 adult worm을 제거하였다.
- 동일한 연령의 개체를 확보하기 위하여 Syncronized L1 stage의 예쁜 꼬마선충 100마리 정도를 NGM agar plate 옮겨서 72시간 동안 배양하여 L4 stage Lavae가 되도록 하였다. 10마리의 adult worm을 약물이 처리된 6 cm plate와 약물이 처리되지 않은 plate에 각각 옮겨 3시간 정도 egg laying을 하고 plate에서 adult worm을 제거하였다. 이를 72시간 후 adult가 된 worm을 새로운 plate로 옮겨서 dead worm을 count 하였다.
- N2 strain에서 생명연장효과가 나타난 7일 발효 대조추출물군 (F7-ZJF-200 μg/mL with OP-50 E. coli)의 활성기전을 살펴보기 위해 열 스트레스 관련 유전자들의 발현 정도를 RT-PCR 기기 (Thermal Cycler Dice Real Time System, Takara)를 활용하여 Quantitative Real time PCR을 실시하였다.
- N2 strain에서 생명연장효과가 나타난 7일 발효한 대조추출물군(F7-ZJF-200 μg/mL with OP-50 E. coli)의 활성기전을 살펴보기 위해 transgenic C. elegans CL2070 strain(HSP-16-2/GFP)을 활용하여 heat shock protein발현 정도를 살펴보았다.
- 실험은 정상생육조건인 20℃와 thermal stress 생육조건인 25℃에서 실시하였으며 대조군(약물무처치군)과, 대조추출물군(ZJF-200 μg/mL with OP-50 E. coli), 7일 발효한 대조추출물군(F7-ZJF-200 μg/mL with OP-50 E. coli), 14일 발효한 대조추출물군(F14-ZJF-200 μg/mL with OP-50 E. coli)으로 나누어 실시하였으며 각 실험당 2회 실시하였다.
- 이를 72시간 후 adult가 된 worm을 새로운 plate로 옮겨서 dead worm을 count 하였다. Reproductive 기간 동안에는 매일 약물이 처리된 새로운 배지로 옮겨주고, 그 다음부터는 매 3일째 새로운 배지로옮기며 생존율을 측정하였다. 생존여부는 직접 백금이로 조심스럽게 접촉하여 반응이 없는 것을 죽은 것으로 간주하였다.
- 10마리의 adult worm을 약물이 처리된 6 cm plate와 약물이 처리되지 않은 plate에 각각 옮겨 3시간정도 egg laying을 하고 plate에서 adult worm을 제거하였다. 이를 62시간째에 heat shock 35℃에서 2시간 처리하고 다시 normal 환경인 20℃에서 4시간 안정화 시킨 후 형광현미경(BX 60-FL, Olympus, Tokyo, Japan)을 활용하여 발현 정도를 측정하였다.
- elegans의 actin homologue인 actin-3로 normalize하였으며, 실험에 사용한 primer 쌍은 Table 1과 같다. 야생형 N2 C. elegans 의 동일한연령의 개체를 확보하기 위하여 Syncronized L1 stage의 예쁜 꼬마선충 100 마리 정도를 NGM agar plate 옮겨서 72시간 동안배양하여 L4 stage Lavae가 되도록 하였다. 10마리의 adult worm 을 약물이 처리된 6 cm plate와 약물이 처리되지 않은 plate에각각 옮겨 3시간 정도 egg laying을 하고 plate에서 adult worm을제거하였다.
- 74134)를 활용하여 추출하였다. PCR을 위하여 primescript RT reagent kit(TaKaRa, Cat. RR037A)으로 cDNA 만든 후 SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa, Cat. RR820B)으로 qRT-PCR을 실시하였다.
- 야생형 N2 C. elegans(Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA)를 활용하여 생명연장효과를 실험을 실시하였다. 실험은 20℃와 25℃에서 약물처치한 그룹과 처치하지 않은 그룹으로 나누어 실시하였으며, egg에서 adult가 된 worm을 새로운 plate로 옮기면서 dead worm을 count 하였다.
- elegans(Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA)를 활용하여 생명연장효과를 실험을 실시하였다. 실험은 20℃와 25℃에서 약물처치한 그룹과 처치하지 않은 그룹으로 나누어 실시하였으며, egg에서 adult가 된 worm을 새로운 plate로 옮기면서 dead worm을 count 하였다. 실험결과 대조추출물(ZJF-200 μg/mL with OP-50 E.
- 붉은 덕다리버섯으로 발효한 대추의 노화억제와 생명연장효과를조절하는 특정 스트레스반응 유전자가 무엇인지 밝히기 위해, hsp-16.2 발현 유도 reporter로서 GFP tagging 되어있는 transgenic C. elegans(CL2070)를 활용하였다. Fig.
- elegans의 형광현미경으로 관찰한 것이다. Thermal stress 유도 후에 hsp16.2/GFP C. elegans의 anterior nerve와 pharynx를 포함한 머리부분에서 GFP 형광을 관찰하였다. Heat shock의 유도에 의한 hsp-16.
- 붉은 덕다리버섯으로 발효한 대추출물의 항노화 기전을 밝히기위하여 stress 저항성 관련 RNA를 Quantative RT PCR로 정량분석을 실시하였다. 약물이 처리된 plate와 처리되지 않은 plate에 egg에서 young adult가 될 때까지 72시간동안 배양한 후 RNA를 추출하여 분석하였다.
- 붉은 덕다리버섯으로 발효한 대추출물의 항노화 기전을 밝히기위하여 stress 저항성 관련 RNA를 Quantative RT PCR로 정량분석을 실시하였다. 약물이 처리된 plate와 처리되지 않은 plate에 egg에서 young adult가 될 때까지 72시간동안 배양한 후 RNA를 추출하여 분석하였다. 그 결과 heat shock protein인 hsp16_1과 hsp-70의 경우 스트레스를 제공하지 않은 20℃에서 약물이 처리된 군에서 유의적으로 감소하였으나, 스트레스를 제공한 25℃에서는 HSF-1, hsp16_1과 hsp-70 모두에서 증가하는 경향을 나타내었다(Fig.
- 충북보은 지역 특산물인 대조추출물(ZJF)과 대조추출물의 붉은덕다리버섯 발효산물(F7-ZJF-200 μg/mL)의 항노화 활성을 C. elegans를 활용하여 평가하였다.
- 항 노화와 생명연장에 기여하는 천연물의 연구가 다양하게 진행되고 있다. 본 연구에서는 충북보은 지역 특산물인 대조추출물과대조추출물의 붉은 덕다리버섯 발효산물의 항노화 활성을 C. elegans를 활용하여 평가하였다. 7일과 14일 발효산물에서 유의적활성이 나타났으나 발효하지 않은 대조추출물은 생명연장효과를 나타내지 않았다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 대조는 충북보은군의 지역특산물로서 지역재배농가로부터 직접 구입하여 실험에 사용하였다. 증거표본은(NBUHP-S-016) 남부대학교 한방제약개발학과에 보관 중 이다.
- 실험에 사용한 대조는 충북보은군의 지역특산물로서 지역재배농가로부터 직접 구입하여 실험에 사용하였다. 증거표본은(NBUHP-S-016) 남부대학교 한방제약개발학과에 보관 중 이다. 대조를 정제수로 세척하고 건조한 다음 분쇄한 후 분말을 100 mesh 체를 이용하여 통과한 것을 시료로 사용하였다.
- 증거표본은(NBUHP-S-016) 남부대학교 한방제약개발학과에 보관 중 이다. 대조를 정제수로 세척하고 건조한 다음 분쇄한 후 분말을 100 mesh 체를 이용하여 통과한 것을 시료로 사용하였다. 분말 100 g을 정제수 1L에 섞어주고, 붉은 덕다리버섯(Laetiporus sulphureus) CS0218 (KFCC 11494Ｐ) 균주를 배양액에 첨가하였다.
- 실험에 사용한 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 야생형으로(Bristol N2, Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA)조선대학교 조정훈 교수님으로 부터 분양받아 사용하였다. Brenner(1974)의 방법16)에 따라 고체배지에 OP50 균주를 배양하여 lawn을 만들고 그 위에 C.
데이터처리
- 통계처리는 생명연장실험은 약물처치군과 대조군의 차이를 Logrank test를 실시하여 Chi-square 검정으로 확인하였다. 통계분석용 프로그램은 SPSS 20.
이론/모형
- Brenner(1974)의 방법16)에 따라 고체배지에 OP50 균주를 배양하여 lawn을 만들고 그 위에 C. elegans를 3∼4일 간격으로 옮겨주며 배양하였다.
성능/효과
- 대조추출물 발효 7일액(F7-ZJF-200 μg/mL, agar plate with OP-50 E. coli)을 처리한 군은 20℃에서 배양한 군에서는 생명연장효과가 나타나지 않았으나, 25℃로 스트레스를 유도한 상황에서는 약물처리군이 대조군에 비해 통계적으로 유의한 수명연장 효과를 나타내었다.
- 실험결과 대조추출물(ZJF-200 μg/mL with OP-50 E. coli)에서는 20℃와 25℃에서 모두 생명연장효과가 나타나지 않았다.
- 약물이 처리된 plate와 처리되지 않은 plate에 egg에서 young adult가 될 때까지 72시간동안 배양한 후 RNA를 추출하여 분석하였다. 그 결과 heat shock protein인 hsp16_1과 hsp-70의 경우 스트레스를 제공하지 않은 20℃에서 약물이 처리된 군에서 유의적으로 감소하였으나, 스트레스를 제공한 25℃에서는 HSF-1, hsp16_1과 hsp-70 모두에서 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 3).
- elegans 수명연장에 관한 연구를 실시하여 유의적 활성효과를 관찰하였다. 발효하지 않은 대조추출물의 경우 생명연장효과가 관찰되지 않았으며 발효 7일째의 대조추출물이 유의적 활성을 나타내었다. 수명연장 효과의 활성기전을 알아보기 위해 온도에 따른 수명연장효과 실험을 실시하였으며, 25℃에서 활성이 증가되는 것을 확인하였다.
- 발효하지 않은 대조추출물의 경우 생명연장효과가 관찰되지 않았으며 발효 7일째의 대조추출물이 유의적 활성을 나타내었다. 수명연장 효과의 활성기전을 알아보기 위해 온도에 따른 수명연장효과 실험을 실시하였으며, 25℃에서 활성이 증가되는 것을 확인하였다. 열스트레스 저항성에 따른 HSP 관여여부를 확인하기 위하여, GFP가 도입되어 있는 CL-2070 strain의 저항성 시험을 실시한 결과 발효대추액처리군에서 HSP 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
- 수명연장 효과의 활성기전을 알아보기 위해 온도에 따른 수명연장효과 실험을 실시하였으며, 25℃에서 활성이 증가되는 것을 확인하였다. 열스트레스 저항성에 따른 HSP 관여여부를 확인하기 위하여, GFP가 도입되어 있는 CL-2070 strain의 저항성 시험을 실시한 결과 발효대추액처리군에서 HSP 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 열 스트레스 관련 유전자의 발현 변화를 살펴본 결과 heat shock protein 인 hsp16_1과 hsp-70의 경우 스트레스를 제공하지 않은 20℃에서 약물이 처리된 군에서 유의적으로 감소하였으나, 스트레스를 제공한 25℃에서는 HSF-1, hsp16_1과 hsp-70 모두에서 증가하는 경향을 나타내었다.
- 열스트레스 저항성에 따른 HSP 관여여부를 확인하기 위하여, GFP가 도입되어 있는 CL-2070 strain의 저항성 시험을 실시한 결과 발효대추액처리군에서 HSP 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 열 스트레스 관련 유전자의 발현 변화를 살펴본 결과 heat shock protein 인 hsp16_1과 hsp-70의 경우 스트레스를 제공하지 않은 20℃에서 약물이 처리된 군에서 유의적으로 감소하였으나, 스트레스를 제공한 25℃에서는 HSF-1, hsp16_1과 hsp-70 모두에서 증가하는 경향을 나타내었다. 따라서 발효대추산물이 HSF-1과 관련하여 관련하여 생명연장효과가 있는 것으로 추정되어 thermal stress에 대한 제어기전을 발휘하는 것으로 생각된다(Table 2).
- Thermal stress의 저항성을 기전을 sHSP-16-2/GFP transgenic C. elegans 로 실험하였으며 발효 7일 대추에서(F7-ZJF-200 μg/mL) 비투여군에 비해 HSP 발현의 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
- 7일과 14일 발효산물에서 유의적활성이 나타났으나 발효하지 않은 대조추출물은 생명연장효과를 나타내지 않았다. sHSP-16-2/GFP transgenic C. elegans를 활용한 assay에서는 약물투여군이 HSP 발현의 감소 경향을 나타내었으며, RNA 분석에서 hsp16.1과 hsp-70의 경우 thermal stress를제공하지 않은 20℃에서 약물이 처리된 군에서 감소하는 경향을 나타내었으나 thermal stress를 제공한 25℃에서는 증가하는 경향을 나타내었다. 따라서 발효한 충북보은 대추가 생명연장에 유의적활성을 나타내었으며, thermal stress 저항성과 관련이 있는 것으로 생각된다.
- 대조추출물 발효 14일액(F14-ZJF-200 μ g/mL with OP-50 E. coli)을 처리한 군은 20℃에서 배양한 군에서는 생명연장효과가 나타나지 않았으나, 25℃로 스트레스를 유도한 상황에서는 약물처리군이 대조군에 비해 통계적으로 유의한 수명연장 효과를 나타내었다(Fig. 1).
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