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문제 정의
- Clitocybin A가 모유두세포의 성장 증식을 유도하는 분자적 기전을 밝히기 위해 Wnt/β-catenin 신호 전달 경로에 관하여 조사하였다.
- 본 연구에서는 Clitocybin A이 모발의 성장에서 중요한 역할을 하는 모유두 세포에서 cell cycle proteins, Wnt/β-catenin 및 ERK 신호전달 경로의 활성화를 유도하여 모유두세포의 성장증식을 촉진함을 밝혔다. 이와 같은 연구결과는 Clitocybin A가 탈모치료 및 탈모예방에 이용될 수 있는 가능성을 가지고 있다는 근거를 제시하는 것이다.
- 본 연구에서는 육모효능에 중요한 역할을 하는 모유두 세포를 이용하여 우리나라에 서식하는 국내자생버섯에서 유래된 Clitocybin A의 육모 효능을 조사하여 이들을 탈모방지제 및 탈모 치료제로 이용할 수 있는 근거를 마련하고자 하였다.
제안 방법
- Cell cycle 의 진행은 cyclin E/CDK2 complex의 활성화, cyclin D1 증가 및 pRB의 인산화 증가등의 단백질 발현을 동반함이 알려져 있다.18-20) 이러한 cell cycle 진행과 관련된 단백질의 발현이 Fig. 2의 결과와 일치하게 변화화하는지 알아보기 위해, cyclin D1, cyclin E, phospho-CDK2, CDK2, phospho(ser780)-pRB의 발현을 조사하였다. Fig.
- 27) 모유두 세포(1.0×104cells/ml)를 1% FBS를 포함한 DMEM 배지에 혼탁하여 96 well plate에 넣고 24시간 배양 후 Clitocybin A(0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 및 50 µM)를 처리하였다.
- Clitocybin A가 모유두 세포의 성장증식 효능이 있는지 불멸화된 모유두 세포를 사용하여 조사하였다. 모유두 세포는 모낭의 기저에 위치하는 중배엽 유래 세포로써, 모기질 세포(matrix cells)와의 상호작용, hair germ을 통한 stem cell 활성화 및 모발의 재생에 중요한 작용을 한다고 알려져 있다.
- 이러한 결과를 통하여 Clitocybin A가 모유두 세포의 증식을 통해 육모 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다. G0/G1, S및 G2/M phase로의 cell cycle의 진행과정은 포유류 세포 증식의 주요과정이며,18-20) Clitocybin A가 cell cycle의 진행을 유도하는지 알아보기 위해 DNA에 결합하는 형광물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 조사하였다. 그 결과, Clitocybin A 처리군에서 대조군에 비해 sub G1 phase 세포가 감소하였고 G1 phase 세포 및 G2/M phase 세포가 증가함을 확인할 수 있었다(Fig.
- Immortalized DPCs were treated with Clitocybin A (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 and 50 µM).
- Membrane은 여러 단백질의 발현을 조사하기 위해 CyclinD1(1:1000), phospho-CDK2(1:1000), CDK2(1:1000), CyclinE(1:2000), phospho(ser780)-pRB(1:1000), phospho-ERK1/2(1:1000), phospho(ser552)-β-catenin(1:1000), phospho(ser675)-β-catenin(1:1000), β-catenin(1:2000), phospho(ser9)-GSK3β(1:1000), GSK3β(1:1000) and β-actin(1:5000)에 대한 primary antibody로 4℃에서 overnight 결합시켰다.
- RNase A(50 µg/ml) 처리하고, propidium iodide(PI)로 염색한 다음 FACScan flow cytometer(Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)로 세포주기를 분석하였다.
- Membrane은 여러 단백질의 발현을 조사하기 위해 CyclinD1(1:1000), phospho-CDK2(1:1000), CDK2(1:1000), CyclinE(1:2000), phospho(ser780)-pRB(1:1000), phospho-ERK1/2(1:1000), phospho(ser552)-β-catenin(1:1000), phospho(ser675)-β-catenin(1:1000), β-catenin(1:2000), phospho(ser9)-GSK3β(1:1000), GSK3β(1:1000) and β-actin(1:5000)에 대한 primary antibody로 4℃에서 overnight 결합시켰다. Secondary anti-body는 Horse Radish Peroxidase(HRP)가 결합된 anti-rabbitIgG, anti-mouse IgG를 1:5000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 반응을 진행하였다. 그 다음 T-TBS로 membane을 3회 세척한 후, ECL 기질(Intron, Seoul, Korea)로 1분 동안 반응시킨 다음 X-ray film(AGFA, Mortsel, Belgium)에 감광하였다.
- Western blot analysis − 모유두 세포를 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 24시간 동안 배양한 후에 Clitocybin A(0.001, 0.01, 0.1 µM) 또는 10 µM minoxidil을 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다.
- 상층액은 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO) 200 µl을 가하여 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Amersham Pharmacia Biotech,NY, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식정도를 조사하였다.
- 모유두 세포를 100 units/ml penicillin-100 µg/ml streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM (Hyclone Inc, UT, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양 하였다.
- 세포주기 분석 − 모유두 세포는 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 24시간 동안 배양한 후에 Clitocybin A(0.001, 0.01, 0.1 µM) 또는 10 µM minoxidil을 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다.
- 양성 대조군으로 minoxidil(Sigma, MO, USA)을 10 µM의 농도로 처리하였다.
대상 데이터
- Cell proliferation was measured using a MTT assay for 4 days. All experiments were performed in triplicate. Data are presented as the mean±the S.
- 모유두 세포의 배양 − 흰쥐 수염에서 분리된 모유두 세포를 불멸화한 세포(Rat vibrissa immortalized dermal papillacell)26)는 ㈜아모레퍼시픽 피부과학연구소로부터 제공받았다.
- 시료 − 실험재료인 Clitocybin A는 한국생명공학연구원 화학생물연구센터에서 공급받아 사용하였다.
- 시료 − 실험재료인 Clitocybin A는 한국생명공학연구원 화학생물연구센터에서 공급받아 사용하였다. 시료는 dimethylsulfoxide(DMSO)로 녹여 실험에 사용하였으며, DMSO의 최종 농도는 0.2%를 초과하지 않도록 하였다.
데이터처리
- 통계분석 − 모든 측정결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검정은 student's t-test으로 검정하였으며, p-value가 0.05 이하일 경우 유의성을 인정하였다.
- 05 이하일 경우 유의성을 인정하였다. 통계처리는 Sigma Stat software(Jandel Scientific Software,USA)를 사용하였다.
이론/모형
- MTT assay − 모유두 세포의 증식은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 이용하여 측정하였다.
- Cell lysate는 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었고 실험에 사용전까지 -20℃에 보관하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin(BSA)를 표준물질로 사용하여 Bradford method에 의하여 정량하였다.28) 20-30 µg의 lysate를 8-12% Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 변성 분리한 다음polyvinylidene fluoride(PVDF) membranes(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 200 mA에서 2시간 동안 transfer하였다.
성능/효과
- 34) 특히, minoxidil에 의한 ERK의 활성화는 모유두세포의 apoptosis 저해와 관련됨이 알려져 있다.9) Fig. 5에서 보이는 결과와 같이 모유두세포에 Clitocybin A를 처리하였을 때 phospho-ERK1/2의 레벨이 증가하는 것으로 ERK1/2의 신호전달을 활성화 시킴을 확인하였다. 위와 같은 연구결과로부터 Clitocybin A가 cyclin D1, phospho-CDK2, phospho-pRB 같은 세포주기 조절 단백질의 레벨을 증가시킬 뿐만 아니라 Wnt/β-catenin 신호전달 경로 및 ERK 신호전달 경로의 활성화를 유도하여 모유두 세포의 증식증가 효능을 나타냄을 알 수 있다.
- Fig. 3에서 보는 바와 같이, 모유두 세포에 24시간 동안 Clitocybin A(0.001, 0.01 및 0.1 µM)를 처리하였을 때, cyclin D1, phospho-CDK2 및 phospho(ser780)-pRB의 발현이 유의하게 증가함을 확인할 수 있었다.
- G0/G1, S및 G2/M phase로의 cell cycle의 진행과정은 포유류 세포 증식의 주요과정이며,18-20) Clitocybin A가 cell cycle의 진행을 유도하는지 알아보기 위해 DNA에 결합하는 형광물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 조사하였다. 그 결과, Clitocybin A 처리군에서 대조군에 비해 sub G1 phase 세포가 감소하였고 G1 phase 세포 및 G2/M phase 세포가 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 2). Cell cycle 의 진행은 cyclin E/CDK2 complex의 활성화, cyclin D1 증가 및 pRB의 인산화 증가등의 단백질 발현을 동반함이 알려져 있다.
- 또한 양성대조 물질인 minoxidil도 Kwack 등의 연구결과와 비슷하게 phospho(ser552)-β-catenin, phospho(ser675)-β-catenin, phospho(ser9)-GSK3β의 레벨을 증가시키는 것으로 β-catenin 신호전달 경로를 활성화함을 확인하였다.
- 반면 50 µM 이상의 농도에서 Clitocybin A는 세포성장을 억제함을 확인하였다(Fig. 1).
- 위와 같은 연구결과로부터 Clitocybin A가 cyclin D1, phospho-CDK2, phospho-pRB 같은 세포주기 조절 단백질의 레벨을 증가시킬 뿐만 아니라 Wnt/β-catenin 신호전달 경로 및 ERK 신호전달 경로의 활성화를 유도하여 모유두 세포의 증식증가 효능을 나타냄을 알 수 있다.
- 1). 이러한 결과를 통하여 Clitocybin A가 모유두 세포의 증식을 통해 육모 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다. G0/G1, S및 G2/M phase로의 cell cycle의 진행과정은 포유류 세포 증식의 주요과정이며,18-20) Clitocybin A가 cell cycle의 진행을 유도하는지 알아보기 위해 DNA에 결합하는 형광물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 조사하였다.
- 이런 결과로 Clitocybin A가 β-catenin 신호전달 경로를 활성화함을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 이전 연구에서 Clitocybin A는 5 µM 이상의 농도에서 platelet-derived growth factor(PDGF) 에 의해 유도된 혈관평활근 세포의 증식을 억제함이 밝혀졌다25). 즉, Clitocybin A는 세포성장을 억제하지 않는 낮은 농도에서 minoxidil 보다 높은 세포증식 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 이러한 결과를 통하여 Clitocybin A가 모유두 세포의 증식을 통해 육모 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
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