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문제 정의
- oryzae로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 Tominaga 등[22]과 Ehrlich 등[23]의 방법에 따라 A. oryzae와 A. flavus를 분류하기 위해 아플라톡신 유전자 군 중 omtA와 norB-cypA의 multiplex PCR을 수행하여 확인하였다.
- 본 연구에서는 순창군에서 조제 및 시판되고 있는 메주 및 전통 장류 제품에서 황국균을 분리 및 선별하고자 하였다. 또한 선별된 황국균을 활용하여 코지를 제조하여 효소활성 측정하고 아플라톡신 생성 유무 확인하여 보다 안전하고 우수한 황국균을 확보하여 이를 메주 접종균으로 활용할 수 있는 자료를 확보하고자 하였다.
- 본 연구에서는 순창군에서 조제 및 시판되고 있는 메주 및 전통 장류 제품에서 황국균을 분리 및 선별하고자 하였다. 또한 선별된 황국균을 활용하여 코지를 제조하여 효소활성 측정하고 아플라톡신 생성 유무 확인하여 보다 안전하고 우수한 황국균을 확보하여 이를 메주 접종균으로 활용할 수 있는 자료를 확보하고자 하였다.
- 본 연구에서는 순창지역에서 만들어지는 장류에서 곰팡이를 분리하고 동정하여 보다 안전하고 기능성이 높은 발효제품을 위한 균주를 확보하고자 하였다. 순창지역에서 생산되는 장류 제품으로부터 곰팡이를 분리하여 βtubulin유전자 분석 통해 10개의 균주가 Aspergillus oryzae/flavus complex임을 알 수 있었다.
- oryzae로 추정되는 균주를 확인하는데 유용한 유전정보를 활용될 수 있다. 이에 본 연구에서도 norB-cypA 사이에 1.5 kb 정도가 결손되었는지를 확인하고자 PCR을 수행하였다.
제안 방법
- A. oryzae로 확인된 10균주를 활용하여 코지를 제조하고 α-amylase활성과 protease 활성을 측정하였다.
- Column을 acetonitrile 3 mL로 용출한 후 감압 농축하고 200 uL trifluoroacetic acid를 가하고 암소에서 15분간 방치한 후 20% acetonitrile 800 uL를 가하여 0.45 um 실린지 필터로 여과하여 10 uL 시료를 HPLC에 주입하고 Shiseido UG 120 (4.6×250 mm, 5 µm) 컬럼과 FLD (excitation: 360 nm, measurement: 450 nm) detector를 사용하여 분석하였다.
- 분자생물학적 동정을 위해 프라이머 Bt2a (5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTT-3')와 Bt2b (5'-A CCCTCAGTGTAG TGACCCTTGGC-3')를 사용하여 βtubulin 유전자의 염기서열을 증폭하였다. DNA 염기서열분석은 Sol Gent Co., Ltd. (Daejeon, Korea)에 의뢰하였다.
- 각각의 시료(메주, 된장, 고추장 등) 10 g을 멸균된 식염수(0.85%) 90 mL에 첨가하여 균질화하였다. 원심분리(4, 000 rpm, 5 min)를 하여 상등액만을 취하고, 10-7까지 연속 희석하여 potato dextrose agar (PDA; Difco, Detroit, MI, USA), malt extract agar (MEA; Difco), 그리고 yeast peptone dextrose agar (YPD; Difco)에 각각 도말하였다.
- 단백질분해효소 활성은 Sookkheo 등[17]에 의한 azoca-sein법을 변형하여 측정하였다. 시료추출액 0.
- oryzae는 곰팡이독소 비생성 곰팡이로서 일본의 경우 사케나 간장에 활용되어 왔다[20, 21]. 따라서, 현미경적 관찰을 통해 A. oryzae라고 추정되는 10 균주에 대해 분자생물학적 동정 및 계통 분류를 진행하였다. 형태학적 관찰을 통해 Aspergillus속으로 추정되는 SCF-6, 11, 13, 17, 27, 37, 38, 63, 65 그리고 66은 A.
- 또한, 곰팡이 독소가 생성되지 않아야 하므로 아플라톡신생성 유전자의 부분적 결손으로 아플라톡신이 생성되지 않을 것으로 예측되지만 다양한 요인에 의해 발생될 소지가 있어 코지에서 아플라톡신 생성 여부를 재차 확인하였다. 63번을 제외한 A.
- 메주를 비롯한 다양한 순창지역 발효제품에서 발효 곰팡이를 분리하고자 2014년 2월부터 4월까지 시중에서 유통 판매되고 있는 순창군 지역 메주 및 전통 장류 제품을 순창 장류제조업체로부터 수거하여 곰팡이를 분리하였다. 수집된 시료를 재료 및 방법에 표기한 방법에 따라 potato dextrose agar (PDA), malt extract agar (MEA), 그리고 yeast peptone dextrose agar (YPD)에 도말한 후 25~30℃에서 2일에서 5일간 배양하여 얻어진 집락 (colony)을 다시 새 배지에서 3-7일간 배양하였다.
- 분리한 곰팡이 균주의 특성을 규명하기 위해 이들을 PDA와 MEA 배지에 각각 1 또는 3점 점 접종(point inoculation)하여 25~30℃에서 7일간 배양하였다. 배양 후 콜로니의 배양특성과 색소형성 등을 기재하였고, 분생포자, 균사, 분생포자 머리, 분생포자경 등을 현미경으로 관찰하여 형태학적 동정을 시행하였다. 이를 통하여 총 67균주를 분리하였으며 분리순서대로 Sun ChangFungi (SCF)라는 균주 번호를 부여하였다.
- 분리 곰팡이를 동정하기 위해 PDA와 MEA 배지에 1점 또는 3점 접종하여 30℃에서 7일간 배양하였다. 배양 후, 집락의 배양특성과 색소형성 등을 기재하며, 분생포자, 균사, 분생포자경 등을 현미경으로 관찰하여 형태학적 동정을 시행하였다. 분자생물학적 동정을 위해 프라이머 Bt2a (5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTT-3')와 Bt2b (5'-A CCCTCAGTGTAG TGACCCTTGGC-3')를 사용하여 βtubulin 유전자의 염기서열을 증폭하였다.
- 이를 통하여 총 67균주를 분리하였으며 분리순서대로 Sun ChangFungi (SCF)라는 균주 번호를 부여하였다. 분리된 균주의 형태학적 관찰을 통해 Aspergillus만을 선별하여 이후실험을 진행하였다.
- 배양된 시료를 4℃에 단기보관하고, 장기보관으로는 포자 일정량이 들어 있는 카제인용액을 실리카젤이 들어 있는 멸균된 균주 보관용 바이알에 넣고 건조기에서 보관하였다. 분리한 곰팡이 균주의 특성을 규명하기 위해 이들을 PDA와 MEA 배지에 각각 1 또는 3점 점 접종(point inoculation)하여 25~30℃에서 7일간 배양하였다. 배양 후 콜로니의 배양특성과 색소형성 등을 기재하였고, 분생포자, 균사, 분생포자 머리, 분생포자경 등을 현미경으로 관찰하여 형태학적 동정을 시행하였다.
- 분자생물학적 동정을 위해 프라이머 Bt2a (5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTT-3')와 Bt2b (5'-A CCCTCAGTGTAG TGACCCTTGGC-3')를 사용하여 βtubulin 유전자의 염기서열을 증폭하였다.
- 메주를 비롯한 다양한 순창지역 발효제품에서 발효 곰팡이를 분리하고자 2014년 2월부터 4월까지 시중에서 유통 판매되고 있는 순창군 지역 메주 및 전통 장류 제품을 순창 장류제조업체로부터 수거하여 곰팡이를 분리하였다. 수집된 시료를 재료 및 방법에 표기한 방법에 따라 potato dextrose agar (PDA), malt extract agar (MEA), 그리고 yeast peptone dextrose agar (YPD)에 도말한 후 25~30℃에서 2일에서 5일간 배양하여 얻어진 집락 (colony)을 다시 새 배지에서 3-7일간 배양하였다. 배양된 시료를 4℃에 단기보관하고, 장기보관으로는 포자 일정량이 들어 있는 카제인용액을 실리카젤이 들어 있는 멸균된 균주 보관용 바이알에 넣고 건조기에서 보관하였다.
- 순창에서 분리한 A. oryzae를 산업적으로 활용하기 위해서는 protease 및 α-amylase 활성이 높을수록 메주 접종균으로의 활용가능성이 높아 koji의 효소활성을 측정하였다.
- 85%) 90 mL에 첨가하여 균질화하였다. 원심분리(4, 000 rpm, 5 min)를 하여 상등액만을 취하고, 10-7까지 연속 희석하여 potato dextrose agar (PDA; Difco, Detroit, MI, USA), malt extract agar (MEA; Difco), 그리고 yeast peptone dextrose agar (YPD; Difco)에 각각 도말하였다. 30℃에서 7일간 배양하고 포자를 백금이로 일정량 취하여 멸균된 식염수로 순차적으로 희석하고 희석수 100 µL을 PDA 배지에 도말하여 30℃에서 5일간 배양하였다.
- 배양 후 콜로니의 배양특성과 색소형성 등을 기재하였고, 분생포자, 균사, 분생포자 머리, 분생포자경 등을 현미경으로 관찰하여 형태학적 동정을 시행하였다. 이를 통하여 총 67균주를 분리하였으며 분리순서대로 Sun ChangFungi (SCF)라는 균주 번호를 부여하였다. 분리된 균주의 형태학적 관찰을 통해 Aspergillus만을 선별하여 이후실험을 진행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 시료는 2014년 2월부터 4월까지 순창군 지역에서 유통, 판매되고 있는 메주 56개와 전통 장류(된장, 고추장 등) 20개 제품을 수집하여 곰팡이 분리에 사용하였다. 또한 충무 발효에서 시판되고 있는 종국을 구입하여 곰팡이를 분리하여 대조구로 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 시료는 2014년 2월부터 4월까지 순창군 지역에서 유통, 판매되고 있는 메주 56개와 전통 장류(된장, 고추장 등) 20개 제품을 수집하여 곰팡이 분리에 사용하였다. 또한 충무 발효에서 시판되고 있는 종국을 구입하여 곰팡이를 분리하여 대조구로 사용하였다.
데이터처리
- Sequence data를 BioEdit v. 7.0 프로그램으로 최적화한 후, CLUSTAL-X v.1.81을 이용하여 alignment하였고, MEGA v.5.2.2 프로그램을 이용하여 neighbor-joining (NJ) tree를 작성하고, Kimura-2-parameter distance model을 사용하며, Confidence values는 1000 replication bootstrap 분석으로 도출하고, 분리 균주의 종 동정을 위하여 서열 결과를 BLAST 프로그램으로 분석하였다.
이론/모형
- [24]. The sequences were first analyzed using the Tamura-Nei parameter distance calculation model with gamma-distributed substitution rates, which were then used to construct the Neighbor-Joining tree with MEGA version 5.2.2. Numbers under nodes are bootstrap values (>0.
성능/효과
- α-amylase 활성은 257~320 U/mL로 측정되었으며 오염으로 추정되는 63번을 제외한 순창에서 분리한 A. oryzae는 현재 종균으로 시판되고 있는 균주와 비교했을 때 α-amylase 효소역가가 떨어지지 않는 것을 확인하였다(Fig. 4).
- oryzae RIB40의 아플라톡신 생합성 유전자군 구조를 분석하였다. A. oryzae RIB40의 아플라톡신 생합성 유전자 대부분이 A. flavus의 아플라톡신 생합성 유전자군과 97~99% 상동성을 나타내었으나, 세 개의 유전자에서는 93% 이하의 상동성을 보였다. 이 세 유전자는 각각 aflT, norA 그리고 verA으로써 aflT 유전자는 257 bp가 결손(deletion)되었으며, norA 유전자는 틀전환돌연변이(frameshift mutation) 그리고 verA 유전자는 염기치환 돌연변이(base pair substitution)를 가지고 있다.
- Protease 활성은 6, 13, 17, 27, 37, 그리고 38 균주로 제조된 코지는 대조구(시판되고 있는 종균으로 제작한 코지)보다 2배 정도 높은 protease 활성을 보였으며, α-amylase 활성은 257~320 U/mL로 측정되었다.
- oryzae를 산업적으로 활용하기 위해서는 protease 및 α-amylase 활성이 높을수록 메주 접종균으로의 활용가능성이 높아 koji의 효소활성을 측정하였다. Protease 활성은 순창에서 분리한 균주로 만든 코지에서 시판되고 있는 종균으로 만든 코지보다 비교적 우수하게 확인 되었는데 이중 SCF-6, 13, 17, 27, 37, 그리고 38로 제조된 코지는 대조구(시판되고 있는 종균으로 제작한 코지)보다 2배 정도 높은 protease 활성을 확인할 수 있었다. α-amylase 활성은 257~320 U/mL로 측정되었으며 오염으로 추정되는 63번을 제외한 순창에서 분리한 A.
- 2). 따라서 순창에서 분리한 균주는 1차적으로 A. oryzae임을 확인하였다.
- oryzae의 표준 균주와의 유연관계가 높음을 알 수 있었다. 또한 norB-cypA 사이의 염기서열을 증폭한 결과 500 bp이 증폭 산물이 확인되었는데 이는 표준 균주인 A. oryzae의 norB-cypA 사이의 염기서열증폭 산물과 동일한 크기임을 확인할 수 있었다. A.
- 순창지역에서 생산되는 장류 제품으로부터 곰팡이를 분리하여 βtubulin유전자 분석 통해 10개의 균주가 Aspergillus oryzae/flavus complex임을 알 수 있었다. 보다 정확한 동정을 위하여 아플라톡신 클러스터 유전자 중에 하나인 omtA의 염기서열을 증폭하여 A. oryzae와 A. flavus 표준 균주의 omtA 서열과 함께 계통 분류한 결과, A. oryzae의 표준 균주와의 유연관계가 높음을 알 수 있었다. 또한 norB-cypA 사이의 염기서열을 증폭한 결과 500 bp이 증폭 산물이 확인되었는데 이는 표준 균주인 A.
- 순창지역에서 생산되는 장류 제품으로부터 곰팡이를 분리하여 βtubulin유전자 분석 통해 10개의 균주가 Aspergillus oryzae/flavus complex임을 알 수 있었다.
- Protease 활성은 6, 13, 17, 27, 37, 그리고 38 균주로 제조된 코지는 대조구(시판되고 있는 종균으로 제작한 코지)보다 2배 정도 높은 protease 활성을 보였으며, α-amylase 활성은 257~320 U/mL로 측정되었다. 식품안전성을 위한 아플라톡신 분비 확인 결과, 63번 균주로 제조된 코지를 제외한 모든 코지에서 아플라톡신을 만들지 않는 것으로 확인되어, 순창에서 분리된 A. oryzae는 추후 메주 접종균으로 개발할 수 있음을 보여주었다.
- oryzae라고 추정되는 10 균주에 대해 분자생물학적 동정 및 계통 분류를 진행하였다. 형태학적 관찰을 통해 Aspergillus속으로 추정되는 SCF-6, 11, 13, 17, 27, 37, 38, 63, 65 그리고 66은 A. oryzae/flavus에 속하는 것을 확인하였다(결과 미제시).
- 이러한 결과는 자연계에서 분리한 곰팡이 균주의 동정에 적용할 수 있는 유전자로 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 형태학적으로 A. oryzae와 유사한 형태를 보이는 순창에서 분리한 10 균주에 대해 omtA유전자의 다형성을 조사한 결과, SCF-6, 11, 13, 17, 27, 37, 그리고 38은 A. oryzae SRRC 2103과 일치하였으며, SCF-63, 65, 그리고 66은 A. oryzae 493과 일치하였다(Fig. 2). 따라서 순창에서 분리한 균주는 1차적으로 A.
후속연구
- 이러한 전통된장의 단점을 보완하기 위해서는 접종균(starter)의 이용이 바람직하며 최근 접종균의 전통식품의 응용연구가 활발히 진행되고 있고, 장류 제조회사에서 장류 제품 품질의 균일성 위생학적 관리를 위해 접종균을 사용하여 메주를 포함한 장류를 제조하고 있으나 사용되고 있는 접종균은 한국형 균주가 아니라 일본에서 종균화 된 균주를 대부분 사용하고 있다[5]. 따라서 우수한 접종균의 개발을 위하여서는 우수 전통 발효식품 수집하고, 식품으로부터 유용 미생물의 분리 및 분리 미생물을 이용한 전통발효식품 품질고급화를 위한 기초적인 연구가 계속적으로 이루어져야 한다.
- flavus와 구별할 수 있는 다형성을 보이고 있다고 보고하였다. 이러한 결과는 자연계에서 분리한 곰팡이 균주의 동정에 적용할 수 있는 유전자로 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 형태학적으로 A.
- 5 kb가 결손되어 있다고 보고하였다. 이러한 결손은 A. oryzae를 A. flavus와 구별되는 특징으로 발효식품을 포함한 각종 장류에서 분류된 곰팡이 중 A. oryzae로 추정되는 균주를 확인하는데 유용한 유전정보를 활용될 수 있다. 이에 본 연구에서도 norB-cypA 사이에 1.
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