유전자총을 이용한 팔레놉시스 형질전환 효율향상에 삼투압 조절제 및 발사횟수차이가 미치는 영향 Effects of osmoticum treatments and shooting chances on the improvement of particle gun-mediated transformation in Phalaenopsis원문보기
본 연구는 팔레놉시스의 원괴체유사체를 재료로 효율적인 형질전환 체계를 확립하기 위해 수행되었다. 이를 위해 PPT 제초제에 저항성을 가지는 bar 선발유전자와 노화지연 형질을 보이는 ORE 7 유전자를 함유하는 pCAMBIA 3301:ORE7 벡터를 이용하여 유전자총 형질전환 시 발사횟수 증가 그리고 유전자총 실험 전후에 삼투압조절제 처리를 하여 실험목적을 달성하고자 하였다. 실험결과, 2회 발사처리가 1회나 3회 발사횟수와 비교하여 1.5 ~ 2.5배 이상의 형질전환 효율을 보여 주었으나, 신초 재분화율이 낮고 갈변율은 높은 현상을 보여 주었다. 다양한 삼투압 조절제 처리에 의한 형질전환효율 향상 실험에선 0.2 M mannitol과 0.2 M sorbitol 이 2가지 조절제 혼합처리가 단용처리나 무처리구에 비해 형질전환 효율과 신초재 분화율에서 최소 1.5 ~ 3배 이상의 효율을 보여 주었고, 갈변율도 2배 이상 낮게 나타났다. PCR 분석을 통하여 bar 유전자와 ORE7 유전자가 도입되었음을 확인하였고, 임의로 선발한 형질전환 팔레놉시스 21개체를 대상으로 real-time PCR 분석을 통해 4개체가 1 copy의 목적유전자를 가지고 있으며, 나머지 17 개체들은 2 copy 이상의 유전자를 보유하고 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서 생산된 형질전환 팔레놉시스 개체들은 순화과정을 거쳐 화분으로 이식하여 생육과정을 거쳐 꽃이나 잎에 변이가 없는 개화과정을 보여 주었다.
본 연구는 팔레놉시스의 원괴체유사체를 재료로 효율적인 형질전환 체계를 확립하기 위해 수행되었다. 이를 위해 PPT 제초제에 저항성을 가지는 bar 선발유전자와 노화지연 형질을 보이는 ORE 7 유전자를 함유하는 pCAMBIA 3301:ORE7 벡터를 이용하여 유전자총 형질전환 시 발사횟수 증가 그리고 유전자총 실험 전후에 삼투압조절제 처리를 하여 실험목적을 달성하고자 하였다. 실험결과, 2회 발사처리가 1회나 3회 발사횟수와 비교하여 1.5 ~ 2.5배 이상의 형질전환 효율을 보여 주었으나, 신초 재분화율이 낮고 갈변율은 높은 현상을 보여 주었다. 다양한 삼투압 조절제 처리에 의한 형질전환효율 향상 실험에선 0.2 M mannitol과 0.2 M sorbitol 이 2가지 조절제 혼합처리가 단용처리나 무처리구에 비해 형질전환 효율과 신초재 분화율에서 최소 1.5 ~ 3배 이상의 효율을 보여 주었고, 갈변율도 2배 이상 낮게 나타났다. PCR 분석을 통하여 bar 유전자와 ORE7 유전자가 도입되었음을 확인하였고, 임의로 선발한 형질전환 팔레놉시스 21개체를 대상으로 real-time PCR 분석을 통해 4개체가 1 copy의 목적유전자를 가지고 있으며, 나머지 17 개체들은 2 copy 이상의 유전자를 보유하고 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서 생산된 형질전환 팔레놉시스 개체들은 순화과정을 거쳐 화분으로 이식하여 생육과정을 거쳐 꽃이나 잎에 변이가 없는 개화과정을 보여 주었다.
This study was carried out to develop an efficient transformation protocol via particle bombardment with PLBs (protocorm-like bodies) in Phalaenopsis. To achieve this aim, osmoticum treatment and an increasing shooting chances in particle bombardment process were applied for this study. In addition,...
This study was carried out to develop an efficient transformation protocol via particle bombardment with PLBs (protocorm-like bodies) in Phalaenopsis. To achieve this aim, osmoticum treatment and an increasing shooting chances in particle bombardment process were applied for this study. In addition, pCAMBIA3301: ORE7 vector which contains a herbicide-resistance bar gene as a selectable marker and ORE7 gene as a gene of interests were employed. With regard to the increasing chances of shooting in particle bombardment, double shooting was the best results with 1.5 ~ 2.5 times higher than those of a single or triple shooting treatment in the productioon of PPT (D-L-phosphinothricin)-resistant PLBs. However, regeneration rate of shoots in double shooting was not high as a single shooting. Further, double shooting showed 35 ~ 40% higher than that of a single shooting in the frequency of browning. Regarding effects of different osmotic treatments, combination of 0.2 M sorbitol with 0.2 M mannitol showed the best results in transformation efficiency, regeneration of transformants and reduction of browning. Putative transgenic Phalaenopsis plants were analyzed by PCR analysis and confirmed the presence of bar and ORE 7 gene. Also, real-time PCR was conducted by using 21 transgenic plants and showed only 4 plants had one copy of transgene; whereas, the other 17 plants had more than 2 copies of transgene. Transgenic phalaenopsis plants produced in this study were transferred to pots and flowered normally without morphological variations in flower and leaf.
This study was carried out to develop an efficient transformation protocol via particle bombardment with PLBs (protocorm-like bodies) in Phalaenopsis. To achieve this aim, osmoticum treatment and an increasing shooting chances in particle bombardment process were applied for this study. In addition, pCAMBIA3301: ORE7 vector which contains a herbicide-resistance bar gene as a selectable marker and ORE7 gene as a gene of interests were employed. With regard to the increasing chances of shooting in particle bombardment, double shooting was the best results with 1.5 ~ 2.5 times higher than those of a single or triple shooting treatment in the productioon of PPT (D-L-phosphinothricin)-resistant PLBs. However, regeneration rate of shoots in double shooting was not high as a single shooting. Further, double shooting showed 35 ~ 40% higher than that of a single shooting in the frequency of browning. Regarding effects of different osmotic treatments, combination of 0.2 M sorbitol with 0.2 M mannitol showed the best results in transformation efficiency, regeneration of transformants and reduction of browning. Putative transgenic Phalaenopsis plants were analyzed by PCR analysis and confirmed the presence of bar and ORE 7 gene. Also, real-time PCR was conducted by using 21 transgenic plants and showed only 4 plants had one copy of transgene; whereas, the other 17 plants had more than 2 copies of transgene. Transgenic phalaenopsis plants produced in this study were transferred to pots and flowered normally without morphological variations in flower and leaf.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 삼투압 조절제 전처리 및 유전자총 발사횟수 조절을 통하여 유용유전자인 ORE7 (노화지연유전자)을 팔레놉시스에 효율적으로 도입하는데 필요한 고효율의 유전자총 형질전환 체계를 확립하고자 본 실험을 진행하였다.
본 연구는 팔레놉시스의 원괴체유사체를 재료로 효율적인 형질전환 체계를 확립하기 위해 수행되었다. 이를 위해 PPT 제초제에 저항성을 가지는 bar 선발유전자와 노화지연 형질을 보이는 ORE 7 유전자를 함유하는 pCAMBIA 3301:ORE7 벡터를 이용하여 유전자총 형질전환 시 발사횟수 증가 그리고 유전자총 실험 전후에 삼투압조절제 처리를 하여 실험목적을 달성하고자 하였다.
2007). 이러한 형질이 발현되는 형질전환 팔레놉시스 식물체를 개발하기 위한 기초연구 성격으로 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
ORE7 유전자 (ORE7: 936 bp)의 PCR 분석을 위해서는 forward primer로서 5’-ATGGAAGGCGGTTACGAGCAAG-3’, 그리고 reverse primer로서 5’-TTAAAAAGGTGGTCTTGAAGGTG-3’를 사용하였다.
ORE7 유전자가 도입된 형질전환 팔레놉시스 식물체의 real-time PCR 분석을 위해서 qPCR 분석기기(CFX-96; Biorad, USA)를 사용하였는데 외가닥 cDNA합성은 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japan)의 매뉴얼에 따라 이루어졌고, 합성된 cDNA는 분광광도계(spectrophotometer; Biochrome, U.K)를 이용하여 정량하였다.
본 실험에 사용된 bar 유전자 (bar: 552 bp)의 도입을 확인하기 위해 forward primer로서 5’- TCAAATCTCGGTCGGGGACGGCA-3’, 그리고 reverse primer로서 5’-ATGAGCCCAGAACGCCC-3’를 사용하였다. PCR 조건은 pre-denaturation은 94℃에서 4분, denaturation은 94℃에서 30초, annealing은 58℃에서 30초, extension은 72℃에서 50초로 33 cycles 그리고 last extension은 72℃에서 10분간 반응시켜 증폭반응을 수행하였다. 증폭된 DNA는 0.
그리고 나서 real-time PCR분석을 수행하였다. PCR분석을 위해 형질전환 PLB를 채취 후, 막자사발 및 액체질소를 이용하여 분쇄한 뒤, genomic DNA extraction kit (Real Biotech Corporation, Taiwan)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 본 실험에 사용된 bar 유전자 (bar: 552 bp)의 도입을 확인하기 위해 forward primer로서 5’- TCAAATCTCGGTCGGGGACGGCA-3’, 그리고 reverse primer로서 5’-ATGAGCCCAGAACGCCC-3’를 사용하였다.
PCR조건은 95℃에서 3분간 denaturation 수행하고, 95℃에서 10초씩 그리고, 60℃에서 30초간 총 40 cycles로 annealing과 extension 과정을 수행하였다.
PLB 증식은 PLB를 가로×세로 약 5mm의 크기로 자른 후, VW (Vacin and Went 1949) 배지를 수정한 증식배지인 VWAB배지 (1.625 g VW, 30 g/l apple powder, 30 g/l banana powder, 30 g/l potato powder, 10 g/l sucrose, 1 g/l activated charcoal, 7.5 g/l agar, pH 5.2)에 치상하여 24 ± 1℃, 16시간 광주기 조건하에 배양하였으며, 4주마다 계대배양을 실시하였다.
PPT 20 mg/l에서 12주 이상 선발과정을 거친 형질전환 팔레놉시스 PLB 및 2 ~ 5 cm 크기의 잎이 달려있는 개체들을 PPT가 첨가되지 않는 일반 증식배지로 옮겨 발근을 유도 하였다.
PPT 20 mg/l에서 선발한 추정형질전환 팔레놉시스 PLB들은 다음과 같은 PCR 분석을 통해 선발유전자인 bar 유전자의 도입을 확인 후, 유용유전자인 ORE7 유전자의 도입 역시 확인하였다. 그리고 나서 real-time PCR분석을 수행하였다.
Primer는 NCBI (www.ncbl.nlm.nih.gov)에서 제공되는 온라인 프라이머 제작도구인 Primer 3를 이용해서 디자인하여 primer time qPCR assay (IDT: Integradted DNA technology, Coralville, IOWA, USA)를 이용해서 다음과 같이 프라이머 합성 하였다.
bar 유전자를 위해서 forward primer로 5’-ACAGCTTCAACCGCAGGGCG-3’ 그리고 reverse primer로 5’-CGTGGACGTTTTCCCGGTGCT-3’를 사용하였으며, 또한 probe 서열로 5Cy5/AGGGTCGACCCGATTCAGCCCGA/3lAbRQSp/를 사용하였다.
각 반응은 3µL의 DNA (3.3 ng/ul), 1µL의 10배 primetime assay (4 nm probe+8 nm primer) 그리고 7.5 µL의 Premix Ex Taq probe qPCR (Takara, Japan)으로 하여 총 15 µL 용량으로 맞춰 수행하였다.
그 결과 가장 효율적이었던 2회 발사 및 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol 처리와 기존 심비디움 형질전환 방법(Roh et al. 2011)을 팔레놉시스 PLB 형질전환에 적용하여 비교실험을 진행하였다.
PPT 20 mg/l에서 선발한 추정형질전환 팔레놉시스 PLB들은 다음과 같은 PCR 분석을 통해 선발유전자인 bar 유전자의 도입을 확인 후, 유용유전자인 ORE7 유전자의 도입 역시 확인하였다. 그리고 나서 real-time PCR분석을 수행하였다. PCR분석을 위해 형질전환 PLB를 채취 후, 막자사발 및 액체질소를 이용하여 분쇄한 뒤, genomic DNA extraction kit (Real Biotech Corporation, Taiwan)을 이용하여 DNA를 추출하였다.
또한 유전자총 처리 시 발사횟수가 팔레놉시스 형질전환에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 1회, 2회, 3회 발사처리를 통해 형질전환 효율 비교 실험을 수행하였다.
본 실험에 사용된 bar 유전자 (bar: 552 bp)의 도입을 확인하기 위해 forward primer로서 5’- TCAAATCTCGGTCGGGGACGGCA-3’, 그리고 reverse primer로서 5’-ATGAGCCCAGAACGCCC-3’를 사용하였다.
본 연구결과 확립된 조건인 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol 혼용 처리 그리고 2회 유전자총을 발사하는 조건을 기존의 심비디움 형질전환 연구(Roh et al. 2011)에서 보고한 방법을 팔레놉시스에 적용하여 형질전환효율을 비교하였다.
본 연구에서 생산된 형질전환 팔레놉시스 개체들은 PPT(phosphinothricin) 20 mg/l 첨가된 선발배지로 4주 간격으로 계대배양하며 약 8주에서 12주간의 선발과정을 거쳤다. 이 중 생육이 우수한 7 계통들을 임의로 선발하여 PPT에 저항성을 나타내는 bar 유전자가 도입되었는지를 PCR 분석으로 확인한 결과, 7 계통 중 6 계통에서 552 bp 크기의 bar 유전자 도입을 확인하였다(Fig.
PPT 20 mg/l에서 12주 이상 선발과정을 거친 형질전환 팔레놉시스 PLB 및 2 ~ 5 cm 크기의 잎이 달려있는 개체들을 PPT가 첨가되지 않는 일반 증식배지로 옮겨 발근을 유도 하였다. 생육이 우수하고 발근이 우수한 개체들을 기외상태에서 1~2주간 순화과정을 거쳐 바크가 들어있는 직경 10 cm 화분으로 이식하여 증식하였다.
유전자총 처리 시 삼투현상에 의한 흡수증진을 통해 팔레놉시스 형질전환 효율을 높이고자 기본배지에 0.2 M mannitol, 0.2 M sorbitol, 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol을 처리 하여 비교 실험을 진행하였다.
(2011)의 방법에 따라 수행하였으며 사출거리 6 cm, 1,350 psi rupture disk, 헬륨가스압력 28 psi (pound per square inch) 조건하에 PDS-1000/He (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장치를 이용하여 수행하였다. 유전자총 처리한 PLB는 PPT (DL-Phosphinothricin) 20 mg/l가 첨가된 기본배지에 옮겨 선발을 진행하였다.
2 M sorbitol을 처리 하여 비교 실험을 진행하였다. 이 삼투압처리제들을 유전자총 실험 수행하기 4시간 전에 배지에 첨가하여 4시간 동안 배양 후, 유전자총 실험을 수행한 후에도 동일한 배지에 8시간 정도 배양한 후, 삼투압 조절제가 들어있지 않은 일반 선발배지로 이식하였다. 또한 유전자총 처리 시 발사횟수가 팔레놉시스 형질전환에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 1회, 2회, 3회 발사처리를 통해 형질전환 효율 비교 실험을 수행하였다.
본 연구는 팔레놉시스의 원괴체유사체를 재료로 효율적인 형질전환 체계를 확립하기 위해 수행되었다. 이를 위해 PPT 제초제에 저항성을 가지는 bar 선발유전자와 노화지연 형질을 보이는 ORE 7 유전자를 함유하는 pCAMBIA 3301:ORE7 벡터를 이용하여 유전자총 형질전환 시 발사횟수 증가 그리고 유전자총 실험 전후에 삼투압조절제 처리를 하여 실험목적을 달성하고자 하였다. 실험결과, 2회 발사처리가 1회나 3회 발사횟수와 비교하여 1.
PCR 조건은 pre-denaturation은 94℃에서 4분, denaturation은 94℃에서 30초, annealing은 58℃에서 30초, extension은 72℃에서 50초로 33 cycles 그리고 last extension은 72℃에서 10분간 반응시켜 증폭반응을 수행하였다. 증폭된 DNA는 0.7% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 목표유전자의 도입여부를 확인하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 팔레놉시스는 부산 강산난원(서 재환 대표)에서 분양 받은 KN-02 계통을 이용하여 기내에서 PLB (Protocorm-like bodies)를 번식시킨 후, 형질전환 실험에 이용하였다. PLB 증식은 PLB를 가로×세로 약 5mm의 크기로 자른 후, VW (Vacin and Went 1949) 배지를 수정한 증식배지인 VWAB배지 (1.
유전자총 형질전환은 Roh et al. (2011)의 방법에 따라 수행하였으며, 유전자총 실험에 사용된 vector는 선발유전자로 bar 유전자와 목적유전자인 ORE7 (노화지연유전자) 유전자가 포함된 pCAMBIA3301 vector를 사용하였다. 유전자의 gold입자 코팅과정은 Roh et al.
이론/모형
(2011)의 방법에 따라 수행하였으며, 유전자총 실험에 사용된 vector는 선발유전자로 bar 유전자와 목적유전자인 ORE7 (노화지연유전자) 유전자가 포함된 pCAMBIA3301 vector를 사용하였다. 유전자의 gold입자 코팅과정은 Roh et al. (2011)의 방법에 따라 수행하였으며 사출거리 6 cm, 1,350 psi rupture disk, 헬륨가스압력 28 psi (pound per square inch) 조건하에 PDS-1000/He (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장치를 이용하여 수행하였다. 유전자총 처리한 PLB는 PPT (DL-Phosphinothricin) 20 mg/l가 첨가된 기본배지에 옮겨 선발을 진행하였다.
성능/효과
5 ~ 3배 이상의 효율을 보여 주었고, 갈변율도 2배 이상 낮게 나타났다. PCR 분석을 통하여 bar 유전자와 ORE7 유전자가 도입되었음을 확인하였고, 임의로 선발한 형질전환 팔레놉시스 21개체를 대상으로 real-time PCR 분석을 통해 4개체가 1 copy의 목적유전자를 가지고 있으며, 나머지 17 개체들은 2 copy 이상의 유전자를 보유하고 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서 생산된 형질전환 팔레놉시스 개체들은 순화과정을 거쳐 화분으로 이식하여 생육과정을 거쳐 꽃이나 잎에 변이가 없는 개화과정을 보여 주었다.
그 결과, 본 연구에서 제시된 방법이 기존방법에 비해 약 2.5배의 높은 형질전환 효율을 나타냈다(Fig. 1).
그리고 도입된 ORE7 유전자의 copy 수를 확인하기 위하여 형질전환 된 팔레놉시스 35개체 중 임의로 21개체를 선발하여 real-time PCR을 수행한 결과, 오직 4 개체가 1 copy를 가지고 있고, 11개체가 2 copies 그리고 6 개체가 3 copies를 가지고 있는 것을 보여 주었다(Fig. 2C).
다양한 삼투압 조절제 처리에 의한 형질전환효율 향상 실험에선 0.2 M mannitol과 0.2 M sorbitol 이 2가지 조절제 혼합처리가 단용처리나 무처리구에 비해 형질전환 효율과 신초재분화율에서 최소 1.5 ~ 3배 이상의 효율을 보여 주었고, 갈변율도 2배 이상 낮게 나타났다.
2A). 또한 목적유전자인 ORE7 유전자가 도입되었는지 5 계통을 임의로 선발해서 검정한 결과, 역시 5 계통 모두 936 bp 크기의 ORE7 유전자가 도입되었음을 확인하였다(Fig. 2B). Bar 유전자 검정에서 6 계통 중 1 계통에서 유전자 도입이 확인 안 된 경우는 이는 팔레놉시스 식물체로 bar 유전자가 온전하게 삽입이 안 되었거나 선발이나 재분화 과정에서 유전자가 소실된 것으로 추정된다.
PCR 분석을 통하여 bar 유전자와 ORE7 유전자가 도입되었음을 확인하였고, 임의로 선발한 형질전환 팔레놉시스 21개체를 대상으로 real-time PCR 분석을 통해 4개체가 1 copy의 목적유전자를 가지고 있으며, 나머지 17 개체들은 2 copy 이상의 유전자를 보유하고 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서 생산된 형질전환 팔레놉시스 개체들은 순화과정을 거쳐 화분으로 이식하여 생육과정을 거쳐 꽃이나 잎에 변이가 없는 개화과정을 보여 주었다.
본 연구에서도 기본배지에 0.2 M mannitol, 0.2 M sorbitol, 0.2 M mannitol + 0.2M sorbitol을 처리 후 최적의 조합을 알아본 결과, 0.2M mannitol + 0.2M sorbitol 처리 시 20.7%로 가장 높은 형질전환 효율을 보였을 뿐 아니라, 12%의 높은 재분화율과 1.8%의 낮은 갈변율을 보여 형질전환 팔레놉시스 식물체의 생장과 분화에도 긍정적인 효과가 있음을 보였다(Table 2).
이를 위해 PPT 제초제에 저항성을 가지는 bar 선발유전자와 노화지연 형질을 보이는 ORE 7 유전자를 함유하는 pCAMBIA 3301:ORE7 벡터를 이용하여 유전자총 형질전환 시 발사횟수 증가 그리고 유전자총 실험 전후에 삼투압조절제 처리를 하여 실험목적을 달성하고자 하였다. 실험결과, 2회 발사처리가 1회나 3회 발사횟수와 비교하여 1.5 ~ 2.5배 이상의 형질전환 효율을 보여 주었으나, 신초 재분화율이 낮고 갈변율은 높은 현상을 보여 주었다. 다양한 삼투압 조절제 처리에 의한 형질전환효율 향상 실험에선 0.
유전자총 발사횟수에 따른 형질전환 효율 증대효과에 대해 알아보고자, 1, 2, 3회 발사 시 선발율, 신초 발생율, 갈변율을 측정한 결과 2회 발사 시 가장 높은 10.3%의 형질전환 효율을 보였다(Table 1).
이 중 생육이 우수한 7 계통들을 임의로 선발하여 PPT에 저항성을 나타내는 bar 유전자가 도입되었는지를 PCR 분석으로 확인한 결과, 7 계통 중 6 계통에서 552 bp 크기의 bar 유전자 도입을 확인하였다(Fig. 2A).
후속연구
따라서 향후 이러한 스트레스를 감소시켜 형질전환 효율을 높이거나 유지하면서 갈변율을 감소시키는 항산화제 처리 같은 연구가 필요하다고 판단된다.
현재까지 약 60 여 개체의 형질전환 팔레놉시스 식물체가 증식 중에 있으며, 더 많은 개체들의 개화가 되면 생육조사 그리고 비형질전환 팔레놉시스 개체들과의 변이발생여부 등을 조사할 예정이다. 본 연구에서 유전자총을 이용한 팔레놉시스 식물체 생산에 적합한 프로토콜을 개선하였고, 이를 바탕으로 향기도입이나 바이러스 저항성 같은 다른 유용 유전자가 도입된 팔레놉시스 식물체 개발 및 대량증식이 향후 가능하리라 판단된다.
현재까지 약 60 여 개체의 형질전환 팔레놉시스 식물체가 증식 중에 있으며, 더 많은 개체들의 개화가 되면 생육조사 그리고 비형질전환 팔레놉시스 개체들과의 변이발생여부 등을 조사할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
형질전환 난 식물체 개발역사는 어떠한가?
형질전환 난 식물체 개발역사는 Kuehnle와 Sugii (1992)에 의해 처음 시작되어 팔레놉시스에서는 Anzai et al. (1996)이 유전자총을 이용하여 최초로 형질전환 팔레놉시스 식물체를 생산한 이래 2000년대 이후로 약 10여 편의 논문이 발표되었다(Roh et al. 2012).
팔레놉시스의 원괴체유사체를 재료로 효율적인 형질전환 체계를 확립하기 위한 실험결과는 어떠한가?
이를 위해 PPT 제초제에 저항성을 가지는 bar 선발유전자와 노화지연 형질을 보이는 ORE 7 유전자를 함유하는 pCAMBIA 3301:ORE7 벡터를 이용하여 유전자총 형질전환 시 발사횟수 증가 그리고 유전자총 실험 전후에 삼투압조절제 처리를 하여 실험목적을 달성하고자 하였다. 실험결과, 2회 발사처리가 1회나 3회 발사횟수와 비교하여 1.5 ~ 2.5배 이상의 형질전환 효율을 보여 주었으나, 신초 재분화율이 낮고 갈변율은 높은 현상을 보여 주었다. 다양한 삼투압 조절제 처리에 의한 형질전환효율 향상 실험에선 0.2 M mannitol과 0.2 M sorbitol 이 2가지 조절제 혼합처리가 단용처리나 무처리구에 비해 형질전환 효율과 신초재 분화율에서 최소 1.5 ~ 3배 이상의 효율을 보여 주었고, 갈변율도 2배 이상 낮게 나타났다. PCR 분석을 통하여 bar 유전자와 ORE7 유전자가 도입되었음을 확인하였고, 임의로 선발한 형질전환 팔레놉시스 21개체를 대상으로 real-time PCR 분석을 통해 4개체가 1 copy의 목적유전자를 가지고 있으며, 나머지 17 개체들은 2 copy 이상의 유전자를 보유하고 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서 생산된 형질전환 팔레놉시스 개체들은 순화과정을 거쳐 화분으로 이식하여 생육과정을 거쳐 꽃이나 잎에 변이가 없는 개화과정을 보여 주었다.
팔레놉시스의 육성현황은 어떠한가?
팔레놉시스는 대만이 국가주도적으로 산업을 육성하여 해마다 100여 품종 이상의 신품종을 육성하고 있으며(Park et al. 2013), 국내에서도 교배육종을 통하여 여러 품종을 개발하고 있다. 그러나, 10년 이상 소요되는 오랜 육종기간은 짧은 유행과 고품질에 대한 소비자의 요구도를 맞추기에 한계가 있다고 할 수 있다(Roh et al.
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