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문제 정의
- 또한 Park과 Cha는 지질개선 효과와, 간장 내 항산화효소 및 항염증 활성에 효과를 나타내어 비만으로 인한 고지질 및 이와 관련된 대사성질환에 효능이 있을 것으로 보고했다 [14]. 그러나 자외선에 의한 산화적 스트레스 대한 피부세포의 보호효과에 대한 연구는 없어 본 연구자들은 말채나무잎 추출물을 이용하여 자외선에 조사된 피부세포에서 항산화 활성을 연구하게 되었다.
- 세포막을 구성하고 있는 지질성분은 ROS에 의해 과산화반응을 일으키며 8-isoprostane, 4-hydroxynonenal, malondialdehyde등의 물질을 생성하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 자외선에 의한 섬유아세포의 세포막 지질과산화 억제 활성을 8-Isoprostane의 변화를 통하여 살펴보았다. CWE를 이용한 지질 과산화 억제 활성의 결과는 Fig.
제안 방법
- 배양 후 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 확인하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않은 배양액으로 설정한 후 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존능력은 다음의 식에 따라 계산하였다.
- 따라서 50 µg/mL 농도 이하에서 항산화관련 실험을 진행하였다 (Fig. 1).
- 는 이후 Fenton reaction을 통해 매우 반응성이 강한 hydroxyl radical을 형성하게 된다 [23]. 따라서 CWE가 자외선 조사에 의해 일어나는 피부세포 내의 활성산소 생성 억제 효과를 알아보기 위해, 세포에 UVB를 조사한 후 CWE를 처리하여 12 h 배양하였다. UV만 조사한 군에서 세포 내 활성산소는 현저히 증가하였으며, CWE를 1, 20, 그리고 50 µg/mL의 농도로 처리하였을 때 20, 50 µg/mL에서 각각 유의성 있게 ROS가 감소하였다 (Fig.
- Table 1에서와 같이 in vitro DPPH radical 소거법에서 CWE의 항산화 활성을 확인하였고, 또한 자외선에 대한 세포 사멸도 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 CWE가 피부 섬유아세포에서 항산화 활성을 나타내는지를 확인하기 위하여 DCF 염색을 이용 하여 형광분석기로 측정하였다. H2O2로 산화적 스트레스를 유도한 결과 대조군 (100%) 대비 확연하게 활성산소가 증가하였으나, 500 µM의 H2O2를 처리한 뒤 CWE를 1, 20, 그리고 50 µg/mL의 농도로 처리하였을 때는 농도 의존적으로 ROS를 억제하였다 (Fig.
- 또한 UVB가 조사된 피부세포에서의 ROS를 측정하기 위해서 상기 방법과 동일한 방법으로, 250 mJ UVB로 조사한 후 CWE를 처리한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 12 h 동안 배양시켰으며, 10 µM DCF-DA가 첨가된 DMEM 배지를 가하고 30분 후 DCF를 측정하였다.
- HS 68 cells을 1×104 cells/well의 농도로 96-well plate에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 24 h 동안 부착시킨 후 혈청이 없는 배지로 갈아준 다음, CWE를 농도별로 처리하여 12 h 동안 더 배양하였다. 배양 후 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 확인하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않은 배양액으로 설정한 후 흡광도를 측정하였다.
- 본 실험에서 HS68 cells에 대한 시료의 처리농도를 결정하기위해 MTT [3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenytetrazolium bromide, Sigma] assay를 Mosmann의 방법 [15]을 변형하여 실시하였다. 이 분석법은 노란색의 수용성 기질인 MTT를 진청색의 비수용성 formazan으로 변환시키는 살아있는 세포의 mitochondria dehydrogenase의 능력을 이용한 방법이다.
- 자외선에 대한 피부세포 보호효능을 평가하기 위하여 MTT assay를 이용하여 살아있는 세포를 확인하였다. 본 실험에서는 UVB를 이용하여서 섬유아세포를 손상시킨 후 CWE 처리 농도에 따른 세포 생존 정도를 MTT 시약을 이용하여 측정하였다. 측정 결과, 자외선을 조사하지 않은 실험군을 기준으로 자외선만 조사한 군은 세포 생존율이 70%이나 CWE는 1, 20, 50 µg/mL로 각각 처리한 군의 세포 생존율은 77%, 87%, 93%로 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있었다 (Fig.
- 섬유아세포인 HS68 cells에서 CWE의 처리가 세포증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용한 세포생존율을 측정하였다. CWE 처리군은 세포생존율이 50 µg/mL까지 HS68 cells의 세포 독성에 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였다.
- 자외선 조사에 의한 피부세포에서의 항산화 효과를 인간섬유아세포에서 실시하였다. DPPH radical 소거활성이 우수하게 나타났으며 피부세포에서 자외선에 대한 CWE의 피부보호 효과 실험을 실시한 결과 자외선에 의한 세포사멸 억제와 세포내 ROS 저해 효과가 우수하게 나타났다.
대상 데이터
- 세포배양에 필요한 배지 및 시약은 Hyclone (Logan, USA), Sigma Aldrich(Louis, USA)로부터 구입하여 사용하였다. DCFH-DA, DPPH, L-ascorbic acid, 3-(4,5-diemthylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), H2O2는 Sigma (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader, 형광분석 및 흡광도 측정은 BIOTEK Instruments (Winooski, VT, USA)의 SynergyHT microplate reader를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 말채나무잎은 국내산으로 경기도 파주의 (주)지유본초로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양에 필요한 배지 및 시약은 Hyclone (Logan, USA), Sigma Aldrich(Louis, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 효소처리배양액을 여과하고 농축한 후, 고형분 대비 1:10의 비율로 물에 분산시킨 후, 동량의 에틸아세테이트를 가하고 분획, 농축하여 최종추출물 얻었다. 상기 추출물을 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 100 mg/mL로 용해시켜 스톡 용액을 제조하여 이용하였다.
- 세포 내 ROS 측정은 2',7'-dichlorofluoroescein diacetate (DC FH-DA)가 세포 내로 투과된 후 아세틸기가 유리된 2'7'-dichlorofluoroescin (DCFH)의 형태에서 ROS와 반응하여 형광물질을 생성하는 성질을 이용하였다 [17].
- 본 실험에 사용한 말채나무잎은 국내산으로 경기도 파주의 (주)지유본초로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양에 필요한 배지 및 시약은 Hyclone (Logan, USA), Sigma Aldrich(Louis, USA)로부터 구입하여 사용하였다. DCFH-DA, DPPH, L-ascorbic acid, 3-(4,5-diemthylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), H2O2는 Sigma (St.
- 세포주는 ATCC로부터 분양받은 HS68 cells을 사용하였으며, 세포배양에 사용된 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM)는 10% fetal bovine serum (HyClone Lab., Logan, USA), 1% antibiotic antmycotic (100 U/mL penicillin and 50 µg/mL streptomycin, Life Tech Inc., NY, USA)을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균±오차 (mean±SE)로 표기하였고 통계처리는 Student's t-test로 검정하였고 대조군과 비교하여, p<0.05인 경우 *, p<0.01인 경우 **로 유의성이 있다고 표시하였다.
이론/모형
- Cells were treated with indicated concentration of CWE for 12 h at 37℃. Cell viability was measured by MTT assay. Values are mean±S.
- Cell viability effect of CWE on UVB-induced cell damage in HS68 cells. The cell death ration were detected by MTT assay. Values are mean±S.
- 자외선에 대한 피부세포 보호효능을 평가하기 위하여 MTT assay를 이용하여 살아있는 세포를 확인하였다. 본 실험에서는 UVB를 이용하여서 섬유아세포를 손상시킨 후 CWE 처리 농도에 따른 세포 생존 정도를 MTT 시약을 이용하여 측정하였다.
- 지질의 과산화반응 (lipid peroxidation)은 250 mJ UVB로 조사한 후 CWE를 처리한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 12 h 동안 배양시킨 배양액으로부터 분비되는 8-Isoprostane의 양을 시판중인 효소 면역분석 키트 (enzyme immunoassay, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 제조사 설명서에 따른 비색정량법 (colorimetric determination)을 통해 측정하였다 [18].
성능/효과
- 따라서 본 연구에서는 자외선에 의한 섬유아세포의 세포막 지질과산화 억제 활성을 8-Isoprostane의 변화를 통하여 살펴보았다. CWE를 이용한 지질 과산화 억제 활성의 결과는 Fig. 5에서 보는 바와 같이 CWE 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 생성 저해효과가 나타났고, 50 µg/mL의 농도에서는 약 52%의 8-isoprostane 생성을 억제하였다. 이는 DPPH radical 소거 활성 및 세포내 활성산소 소거가 농도 의존성 있게 나타난 것과 관계가 있는 것으로 사료된다.
- 자외선 조사에 의한 피부세포에서의 항산화 효과를 인간섬유아세포에서 실시하였다. DPPH radical 소거활성이 우수하게 나타났으며 피부세포에서 자외선에 대한 CWE의 피부보호 효과 실험을 실시한 결과 자외선에 의한 세포사멸 억제와 세포내 ROS 저해 효과가 우수하게 나타났다. 또한 이러한 항산화 효과로 인하여 지질과산화 생성도 감소하게 나타났다.
- H2O2로 산화적 스트레스를 유도한 결과 대조군 (100%) 대비 확연하게 활성산소가 증가하였으나, 500 µM의 H2O2를 처리한 뒤 CWE를 1, 20, 그리고 50 µg/mL의 농도로 처리하였을 때는 농도 의존적으로 ROS를 억제하였다 (Fig. 3).
- Table 1에서와 같이 in vitro DPPH radical 소거법에서 CWE의 항산화 활성을 확인하였고, 또한 자외선에 대한 세포 사멸도 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 CWE가 피부 섬유아세포에서 항산화 활성을 나타내는지를 확인하기 위하여 DCF 염색을 이용 하여 형광분석기로 측정하였다.
- UV만 조사한 군에서 세포 내 활성산소는 현저히 증가하였으며, CWE를 1, 20, 그리고 50 µg/mL의 농도로 처리하였을 때 20, 50 µg/mL에서 각각 유의성 있게 ROS가 감소하였다 (Fig. 4).
- 측정 결과, 자외선을 조사하지 않은 실험군을 기준으로 자외선만 조사한 군은 세포 생존율이 70%이나 CWE는 1, 20, 50 µg/mL로 각각 처리한 군의 세포 생존율은 77%, 87%, 93%로 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있었다 (Fig. 2).
후속연구
- 또한 이러한 항산화 효과로 인하여 지질과산화 생성도 감소하게 나타났다. CWE의 항산화에 관련된 본 연구결과를 종합해 볼 때 다양한 페놀성 화합물을 함유한 CWE는 항산화 및 자외선에 의한 산화적 스트레스로 인한 세포손상을 회복시킬 수 있는 기능성 바이오 산업 소재로서의 활용 가치가 높다고 사료된다. 향후에는 UVB에 의한 세포자연사 (apoptosis) 및 DNA 손상에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- CWE의 항산화에 관련된 본 연구결과를 종합해 볼 때 다양한 페놀성 화합물을 함유한 CWE는 항산화 및 자외선에 의한 산화적 스트레스로 인한 세포손상을 회복시킬 수 있는 기능성 바이오 산업 소재로서의 활용 가치가 높다고 사료된다. 향후에는 UVB에 의한 세포자연사 (apoptosis) 및 DNA 손상에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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