말채나무는 한국의 민간요법으로 사용되던 약재이다. 자외선은 피부의 광손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 자외선에 의한 손상된 세포를 회복시키기 위해서 효소처리 된 말채나무잎추출물(CWE)을 사용하였다. 섬유아세포에 UVB를 조사한 후, CWE를 처리하여 세포의 회복을 조사하였다. UVB를 조사한 섬유아세포에는 caspase-3 활성, phospho-p53, ${\gamma}H2AX$, cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) formation, 그리고 DNA fragmentation이 증가하게 된다. 그러나 CWE를 UVB가 조사된 섬유아세포에 12 h 처리하였을 때 caspase-3 활성, phospho-p53, ${\gamma}H2AX$, CPDs formation, 그리고 DNA fragmentation이 감소하였다. 또한 CWE은 인체첩포시험을 통해 인체피부에 자극을 유발하지 않음을 확인하였다. 이러한 결과를 종합할 때 CWE는 자외선에 대한 광보호 효과가 있는 원료로서 가능성을 가지고 있다고 판단된다.
말채나무는 한국의 민간요법으로 사용되던 약재이다. 자외선은 피부의 광손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 자외선에 의한 손상된 세포를 회복시키기 위해서 효소처리 된 말채나무잎추출물(CWE)을 사용하였다. 섬유아세포에 UVB를 조사한 후, CWE를 처리하여 세포의 회복을 조사하였다. UVB를 조사한 섬유아세포에는 caspase-3 활성, phospho-p53, ${\gamma}H2AX$, cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) formation, 그리고 DNA fragmentation이 증가하게 된다. 그러나 CWE를 UVB가 조사된 섬유아세포에 12 h 처리하였을 때 caspase-3 활성, phospho-p53, ${\gamma}H2AX$, CPDs formation, 그리고 DNA fragmentation이 감소하였다. 또한 CWE은 인체첩포시험을 통해 인체피부에 자극을 유발하지 않음을 확인하였다. 이러한 결과를 종합할 때 CWE는 자외선에 대한 광보호 효과가 있는 원료로서 가능성을 가지고 있다고 판단된다.
Cornus walteri Wanger has been used in folk medicine in Korea. Ultraviolet (UV) irradiation has been known as a major cause of photo damage in skin. In the present study, research on how to cure damaged cells by UVB was conducted using an extract of Cornus walteri Wanger leaves (CWE), which was trea...
Cornus walteri Wanger has been used in folk medicine in Korea. Ultraviolet (UV) irradiation has been known as a major cause of photo damage in skin. In the present study, research on how to cure damaged cells by UVB was conducted using an extract of Cornus walteri Wanger leaves (CWE), which was treated with an enzyme. CWE was applied to human dermal fibroblasts (HDFs) affected by UVB. UVB-irradiated HS68 cells showed increased caspase-3 activity, phosphorylation of p53, ${\gamma}H2AX$, cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) formation, and DNA fragmentation compared with non-irradiated cells. However, all these effects were inhibited by treatment with CWE for 12 h after UVB irradiation. Furthermore, CWE has proved not to cause primary skin irritation through the human patch test. Collectively, these results suggest that CWE could be a new potential candidate as photoprotective agent against UVB-induced cellular damage in HDFs.
Cornus walteri Wanger has been used in folk medicine in Korea. Ultraviolet (UV) irradiation has been known as a major cause of photo damage in skin. In the present study, research on how to cure damaged cells by UVB was conducted using an extract of Cornus walteri Wanger leaves (CWE), which was treated with an enzyme. CWE was applied to human dermal fibroblasts (HDFs) affected by UVB. UVB-irradiated HS68 cells showed increased caspase-3 activity, phosphorylation of p53, ${\gamma}H2AX$, cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) formation, and DNA fragmentation compared with non-irradiated cells. However, all these effects were inhibited by treatment with CWE for 12 h after UVB irradiation. Furthermore, CWE has proved not to cause primary skin irritation through the human patch test. Collectively, these results suggest that CWE could be a new potential candidate as photoprotective agent against UVB-induced cellular damage in HDFs.
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문제 정의
또한 Park과 Cha는 지질개선 효과와 간장 내 항산화효소 및 항염증 활성에 효과를 나타내어, 비만으로 인한 고지질 및 이와 관련된 대사성질환에 효능이 있을 것으로 보고했다[10]. 그러나 자외선에 의한 피부세포의 보호효과에 대한 연구는 없어 본 연구자들은 말채나무잎추출물을 이용하여 자외선에 조사된 피부세포에서 광보호 효과를 연구하게 되었다.
제안 방법
CWE에 대한 피부 안전성, 즉 피부반응의 관찰을 통해서 자극 혹은 알레르기성 반응의 발생 여부를 알아보기 위하여 (주)더마프로에 의뢰하여 인체첩포시험을 실시하였다. 피험자로 18세 이상 60세 이하의 건강한 성인 남, 여 30명을 선정하였다.
In vitro에서 광보호 효과가 있는 CWE에 대해 인체 피부에서의 피부자극 정도를 평가하기 위하여 인체첩포시험을 실시하였다. 0.
Thymine이 연속된 DNA 서열에 자외선이 가해지면 CPD가 형성하게 된다[2]. 따라서 CWE가 DNA 상해 반응에 미치는 영향을 확인하기 위해서 CPD 잔여량을 측정하여 분석하였다. 그 결과, Figure 4에서 보는 바와 같이, 자외선을 조사한 후 CWE를 처리한 경우 농도 의존적으로 CPD 양이 유의적으로 감소하였다.
본 연구에서는 CWE가 섬유아세포에서 자외선에 대한 피부 광보호 효과 실험을 실시하였다. 먼저 UVB에 대한 세포자연사 정도를 측정하기 위해서 DNA fragmentation을 측정하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 말채나무잎은 국내산으로 경기도 파주의 (주)지유본초로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양에 필요한 배지 및 시약은 Hyclone (Logan,USA), Sigma Aldrich (USA)로부터 구입하여 사용하였다.
세포주는 ATCC로부터 분양받은 HS68 cells을 사용하였으며, 세포배양에 사용된 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium: DMEM)는 10% fetal bovine serum(Life Tech Inc., USA), 1% antibiotic antimycotic (100U/mL penicillin and 50 µg/mL streptomycin, Life TechInc., USA)을 혼합한 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
CWE에 대한 피부 안전성, 즉 피부반응의 관찰을 통해서 자극 혹은 알레르기성 반응의 발생 여부를 알아보기 위하여 (주)더마프로에 의뢰하여 인체첩포시험을 실시하였다. 피험자로 18세 이상 60세 이하의 건강한 성인 남, 여 30명을 선정하였다. 우선, 첩포부위인 등을 70% EtOH로 세척한 후, 준비된 시험물질을 Finn chamberⓇ내에 16 µL를 적하시켰다.
데이터처리
모든 실험 결과는 평균 ± 오차(mean ± SE)로 표기하였고 통계처리는 Student’s t-test로 검정하였고 대조군과 비교하여, p < 0.05인 경우 *, p < 0.01인 경우 **로 유의성이 있다고 표시하였다.
이론/모형
Figures 3, 4에서 CWE에 의한 DNA 손상이 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 CWE가 DNA 손상에 의한 세포자연사에 있어 p53의 인산화에 미치는 영향을 알아보기 위해서 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. Figure 5에서 보는 바와 같이, 자외선을 처리하지 않았을 때는 p53의 인산화가 미미하였지만 자외선을 조사하였을 때 p53의 인산화가 현저하게 증가하였다.
Barnes 등은 자외선에 의한 피부 세포손상으로 세포 자연사가 발생할 때 ɤ-H2AX가 증가하고 DNA ladder 형성에 있어서 ɤ-H2AX가 필요하다고 보고하였다[17-19]. 따라서 본 연구에서 CWE가 UVB에 의하여 손상된 세포의 자연사에서 DNA에 미치는 영향을 관찰하고자 In-cell ELISA assay를 시행하여 H2A.X의 생성량을 측정하였다. Figure 3에서 보는 바와 같이 본 연구에서도 UVB만 단독으로 처리한 군에서는 ɤ-H2AX이 확연하게 증가하였으며 UVB의 자극한 세포에 CWE 20, 50 µg/mL 처리한 군에서는ɤ-H2AX 형성이 각각 25%, 29%로 유의성 있게 감소하였다.
본 연구에서는 CWE가 섬유아세포인 HS68 cells의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용한 세포생존율을 측정하였다. CWE 처리군은 세포생존율이 50 µg/mL까지 HS68 cells의 세포 독성에 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였다(data not shown).
자외선에 의한 DNA 손상의 정도를 확인하기 위하여 시판 중인 OxiSelectTM Cellular UV Induced DNA Damage Staining Kit (CPD) (Cell Biolabs Inc, USA)를 이용하여 제조사 설명서에 따른 비색정량법(colorimetric determination)을 통해 측정하였다.
첩보는 48 h 동안 도포하며, 첩포를 제거한 후에는 skin marker로 시험부위를 표시하고 30 min, 24 h 후에 각 시험부위를 평가하였다. 평가기준은 Frosch & Kligman법과 The Cosmetic, Toiletry, and Frangrance Association (CTFA)guideline을 반영하여 평가하였다[11-13].
성능/효과
먼저 UVB에 대한 세포자연사 정도를 측정하기 위해서 DNA fragmentation을 측정하였다. 그 결과 CWE 농도 의존적으로 DNA fragmentation 형성이 감소되는 것을 확인하였다. 그리고 세포자연사와 관련성이 있는 H2A.
자외선에 의한 DNA 손상과 관련된 CPD 형성 억제의경우에는 1, 20, 50 µg/mL에서 농도 의존적으로 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 피부 자극성의 유무를 확인하기 위하여 인체첩포시험을 실시한결과 피험자 모두에서 음성반응으로 나왔다. CWE의광보호 및 안전성의 연구결과를 종합해 볼 때 자외선에 의한 세포자연사를 억제하고 또한 DNA 손상을 회복하여 광보호 효과에 활용할 수 있는 바이오산업 소재로서의 활용 가치가 높다고 사료된다.
X인산화와 p-p53은 1, 20, 50 µg/mL에서 농도 의존적으로 감소하였으며 caspase-3의 활성은 20, 50 µg/mL에서 UVB만 조사한 군보다 유의성 있게 감소하였다. 자외선에 의한 DNA 손상과 관련된 CPD 형성 억제의경우에는 1, 20, 50 µg/mL에서 농도 의존적으로 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 피부 자극성의 유무를 확인하기 위하여 인체첩포시험을 실시한결과 피험자 모두에서 음성반응으로 나왔다.
후속연구
또한 피부 자극성의 유무를 확인하기 위하여 인체첩포시험을 실시한결과 피험자 모두에서 음성반응으로 나왔다. CWE의광보호 및 안전성의 연구결과를 종합해 볼 때 자외선에 의한 세포자연사를 억제하고 또한 DNA 손상을 회복하여 광보호 효과에 활용할 수 있는 바이오산업 소재로서의 활용 가치가 높다고 사료된다. 향후에는 본연구 결과를 토대로 하여 CWE가 p53 경로와 관련이있는 GADD45, p21, MDM2 등의 발현 양상 변화에 대한 추가 연구를 하고자 한다.
CWE의광보호 및 안전성의 연구결과를 종합해 볼 때 자외선에 의한 세포자연사를 억제하고 또한 DNA 손상을 회복하여 광보호 효과에 활용할 수 있는 바이오산업 소재로서의 활용 가치가 높다고 사료된다. 향후에는 본연구 결과를 토대로 하여 CWE가 p53 경로와 관련이있는 GADD45, p21, MDM2 등의 발현 양상 변화에 대한 추가 연구를 하고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
자외선은 어떤 것들로 구분되는가?
최근에는 오존층 감소로 UV 조사량이 많아 UV의 유해성에 대한 관심이 날로 증가하고 있다. 자외선은 파장에 따라 UVA (320 ∼ 400 nm), UVB(280 ~ 320 nm), UVC (200 ~ 280 nm)로 구분되며, 이중 지표면에 도달하여 인체에 영향을 주는 자외선은 UVA와 UVB로 알려져 있으며 이 중에서 UVA의 약 20%, UVB의 10% 정도가 진피층에 도달하는 것으로 알려져 있다. 특히 UVB의 일부는 표피를 투과하여 진피의 유두층까지 도달하며 과도하게 조사되면 DNA 손상 및 돌연변이의 축적을 유발시킨다.
말채나무는 무엇인가?
말채나무(Cornus walteri Wanger)는 층층나무과에속하는 낙엽교목으로 잎은 호생하며 넓은 난형 또는 타원형이고 꽃은 6월에 피며 열매는 둥글고 9 ~ 10월에 흑색으로 익는다[6,7]. 한방에서는 말채나무의 가지와 잎을 모래지엽(毛棶枝葉)이라 하여 설사를 멈추거나 옻독을 치료하는데 사용하고 있으며, 민간에서는 말채나무 추출물을 살 빼는데 사용하였다.
UVB가 과도하게 진피의 유두층에 조사되었을 때, DNA 손상 및 돌연변이 축적 외에 또 어떤 문제를 일으키는가?
특히 UVB의 일부는 표피를 투과하여 진피의 유두층까지 도달하며 과도하게 조사되면 DNA 손상 및 돌연변이의 축적을 유발시킨다. 뿐만 아니라 홍반 반응, 일광화상(sunburn), 색소침착을 유발하여광손상, 피부암 등을 일으킨다[1].
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