시스타틴(cystatin: CST)은 C1A류 시스테인단백질분해효소에 대한 경쟁적 가역억제자로서 동식물류에서 파파인과 같은 캐셉신을 억제대상으로 작용하게 된다. 바이러스 유래 CST (CpBV-CST1)이 폴리드나바이러스의 일종인 CpBV (Cotesia plutellae bracovirus)에서 동정되었다. 기존 연구는 이 유전자의 과발현이 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충의 면역 및 발육을 교란한다는 것을 보여 주었다. 본 연구는 이 유전자의 단백질 기능을 분석하기 위해 세균발현시스템을 이용하여 재조합단백질(rCpBV-CST1)을 형성하여 단백질분해효소에 대한 활성억제효과를 결정하고, 곤충의 면역과 발육에 대한 생리적 억제효과를 분석했다. 이 유전자 번역부위는 138 개 아미노산으로 약 15 kDa 크기의 단백질로 추정되었다. CpBV-CST1이 먼저 pGEX 발현벡터에 재조합되고, BL21STAR (DE3) competent cells에 형질전환된 후 0.5 mM IPTG로 4 시간동안 과발현되었다. 분리된 재조합단백질은 파파인에 대한 뚜렷한 억제효과를 나타냈다. 이 재조합단백질은 파밤나방(Spodoptera exigua)에 대해서 혈구소낭형성의 세포성 면역반응을 억제하고, 경구로 처리할 때 배추좀나방의 유충발육을 처리 농도에 비례하여 제한시켰다. 이상의 결과는 CpBV-CST1이 해충 밀도 억제에 응용될 수 있음을 제시하고 있다.
시스타틴(cystatin: CST)은 C1A류 시스테인 단백질분해효소에 대한 경쟁적 가역억제자로서 동식물류에서 파파인과 같은 캐셉신을 억제대상으로 작용하게 된다. 바이러스 유래 CST (CpBV-CST1)이 폴리드나바이러스의 일종인 CpBV (Cotesia plutellae bracovirus)에서 동정되었다. 기존 연구는 이 유전자의 과발현이 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충의 면역 및 발육을 교란한다는 것을 보여 주었다. 본 연구는 이 유전자의 단백질 기능을 분석하기 위해 세균발현시스템을 이용하여 재조합단백질(rCpBV-CST1)을 형성하여 단백질분해효소에 대한 활성억제효과를 결정하고, 곤충의 면역과 발육에 대한 생리적 억제효과를 분석했다. 이 유전자 번역부위는 138 개 아미노산으로 약 15 kDa 크기의 단백질로 추정되었다. CpBV-CST1이 먼저 pGEX 발현벡터에 재조합되고, BL21 STAR (DE3) competent cells에 형질전환된 후 0.5 mM IPTG로 4 시간동안 과발현되었다. 분리된 재조합단백질은 파파인에 대한 뚜렷한 억제효과를 나타냈다. 이 재조합단백질은 파밤나방(Spodoptera exigua)에 대해서 혈구소낭형성의 세포성 면역반응을 억제하고, 경구로 처리할 때 배추좀나방의 유충발육을 처리 농도에 비례하여 제한시켰다. 이상의 결과는 CpBV-CST1이 해충 밀도 억제에 응용될 수 있음을 제시하고 있다.
Cystatins (CSTs) are reversible and competitive inhibitors of C1A cysteine proteases, corresponding to papain-like cathepsins in plants and animals. A viral CST (CpBV-CST1) was identified from a polydnavirus, Cotesia plutellae bracovirus (CpBV). Our previous study indicated that a transient expressi...
Cystatins (CSTs) are reversible and competitive inhibitors of C1A cysteine proteases, corresponding to papain-like cathepsins in plants and animals. A viral CST (CpBV-CST1) was identified from a polydnavirus, Cotesia plutellae bracovirus (CpBV). Our previous study indicated that a transient expression of CpBV-CST1 interfered with immune response and development of Plutella xylostella larvae. To directly demonstrate the protein function, this study produced a recombinant CpBV-CST1 protein (rCpBV-CST1) using bacterial expression system to determine its inhibitory activity against cysteine protease and to assess its physiological alteration in insect immune and development. The open reading frame of CpBV-CST1 encodes a polypeptide of 138 amino acids (${\approx}15kDa$). rCpBV-cystatin protein in BL21 STAR (DE3) competent cells containing a recombinant pGEX4T-3:CpBV-CST1 was over-expressed by 0.5 mM IPTG for 4 h. In biological activity assay, the purified rCpBV-CST1 showed a significant inhibition against papain activity. It inhibited a cellular immune response of hemocyte nodule formation in the beet armyworm, Spodoptera exigua. Moreover, its oral administration retarded larval development of the diamondback moth, Plutella xylostella in a dose-dependent manner. These results suggest that CpBV-CST1 may be applied to control insect pest populations.
Cystatins (CSTs) are reversible and competitive inhibitors of C1A cysteine proteases, corresponding to papain-like cathepsins in plants and animals. A viral CST (CpBV-CST1) was identified from a polydnavirus, Cotesia plutellae bracovirus (CpBV). Our previous study indicated that a transient expression of CpBV-CST1 interfered with immune response and development of Plutella xylostella larvae. To directly demonstrate the protein function, this study produced a recombinant CpBV-CST1 protein (rCpBV-CST1) using bacterial expression system to determine its inhibitory activity against cysteine protease and to assess its physiological alteration in insect immune and development. The open reading frame of CpBV-CST1 encodes a polypeptide of 138 amino acids (${\approx}15kDa$). rCpBV-cystatin protein in BL21 STAR (DE3) competent cells containing a recombinant pGEX4T-3:CpBV-CST1 was over-expressed by 0.5 mM IPTG for 4 h. In biological activity assay, the purified rCpBV-CST1 showed a significant inhibition against papain activity. It inhibited a cellular immune response of hemocyte nodule formation in the beet armyworm, Spodoptera exigua. Moreover, its oral administration retarded larval development of the diamondback moth, Plutella xylostella in a dose-dependent manner. These results suggest that CpBV-CST1 may be applied to control insect pest populations.
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문제 정의
, 2013). 이러한 결과는 CpBV-CST1을 이용하여 해충 방제에 이용할 수 있는 가능성을 제기하였다.
본 연구는 CpBV-CST1을 섭식으로 처리할 경우 해충에 대한 발육 억제를 유도할 수 있는 지를 분석하기 위해 이 유전자의 재조합단백질을 형성하였다. 이 재조합단백질이 시스타틴의 활성을 보이는 지를 조사하기 위해 파파인을 대상으로 단백질분해활성 억제를 측정하였다.
본 연구는 CpBV-CST1을 섭식으로 처리할 경우 해충에 대한 발육 억제를 유도할 수 있는 지를 분석하기 위해 이 유전자의 재조합단백질을 형성하였다. 이 재조합단백질이 시스타틴의 활성을 보이는 지를 조사하기 위해 파파인을 대상으로 단백질분해활성 억제를 측정하였다. 이를 바탕으로 해충의 면역 및 발육 억제를 단백질 수준에서 분석하여 궁극적으로 해충 방제의 수단으로 응용하는 데 기초자료를 얻기 위해 진행되었다.
이 재조합단백질이 시스타틴의 활성을 보이는 지를 조사하기 위해 파파인을 대상으로 단백질분해활성 억제를 측정하였다. 이를 바탕으로 해충의 면역 및 발육 억제를 단백질 수준에서 분석하여 궁극적으로 해충 방제의 수단으로 응용하는 데 기초자료를 얻기 위해 진행되었다.
제안 방법
기존에 클로닝된 CpBV-CST1 cDNA (Kim et al., 2013)를 이용하여 특이적 프라이머(5’-GGAATTCATGTGCAAGGA ATATCGAGTA–3’와 5’-CCGCTCGAGTTAATTTGAATC ATCAATTT-3’: 여기서 밑줄은 EcoRI과 XhoI 인식서열)를 통해 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 1분 조건으로 35회 PCR을 수행하여 open reading frame (ORF) 영역을 증폭하였다.
1 클로닝벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 삽입하고 대장균에 형질전환시킨 후, CpBV-CST1의 삽입이 확인된 균총을 선발하였다. 이후 이 선발 균총을 LB-ampicillin 액체배지에서 배양하고 플라즈미드를 분리하여 제한효소 EcoRI 과 XhoI로 절단하였다. 절단된 ORF cDNA를 동일한 제한효소로 절단시킨 pGEX4T-3 벡터(Invitrogen)에 재조합시키고, 대장균 BL21 (DE3) 균주에 형질전환하였다.
이후 이 선발 균총을 LB-ampicillin 액체배지에서 배양하고 플라즈미드를 분리하여 제한효소 EcoRI 과 XhoI로 절단하였다. 절단된 ORF cDNA를 동일한 제한효소로 절단시킨 pGEX4T-3 벡터(Invitrogen)에 재조합시키고, 대장균 BL21 (DE3) 균주에 형질전환하였다. 이후 유전자 서열 분석으로 삽이 부위를 결정한 후 재조합단백질을 형성하는 균주(BL21/pGEX4T-3-CpBV-CST1)로 사용하였다.
이후 12,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 증식된 세균을 얻고 여기에 10 mM EDTA와 1% Triton X-100가 포함된 20 mM Tris–HCl (pH 7.5) 완충용액으로 현탁시키고 열변성 처리 후 SDS-PAGE를 실시하여 재조합 단백질의 발현 유무를 대조구와 비교 확인하였다.
응결체(inclusion body)로 형성된 재조합단백질의 refolding을 위해 protein refolding kit (Novagen, Damstadt, Germany, USA)를 이용하였다. 이에 따라 용해된 단백질을 rCpBV-CST1으로 명명하고 효소 활성 분석 및 생물검정 시료로 사용하였다.
SDS-PAGE 상에서 분석 대상 단백질 밴드를 절취하여 trypsin으로 가수분해하여 단편화하고, MALDI-TOF (Microflex LRF20, Bruker Daltonics Korea, Seongnam, Korea)에 의한 질량분석과 PMF (peptide mass fingerprinting) 기반으로 Mascot database (www.matrixscience.com)를 이용하여 단백질을 동정하였다. MALDI-TOF 분석은 안동대학교 공동실험실습실에서 이뤄졌다.
이후 30% 빙초산 용액으로 반응을 중지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정했다. 대조구로 GST (glutathione-S-transferase)를 rCpBV-CST1과 동일한 농도로 처리하였다.
세포성 면역반응의 일환으로 세균 침입에 따른 혈구의 소낭 형성 반응을 네 종류의 곤충에 대해서 분석했다. 대장균(E.
coli Top10)을 LB 배지에서 증식시키고 5 × 104 세균 세포수를 대상 곤충의 혈강으로 주입하였다. 혈강 주입은 유리 모세관을 이용하여 초미량펌프가 장착된 미세조정장치(SYS-microcontroller, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 주입하였다. 유리 모세관은 micropipette puller (PN-30, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 제조하였다.
이후 4℃로 옮긴 후 소낭형성 반응을 정지시켰다. 이후 각 처리 곤충을 해부하여 형성된 소낭을 해부현미경 50 배 배율에서 관찰했다. 형성된 소낭 수는 먼저 소화관 주변 및 기관지에 붙어 있는 것들을 계수하고, 이후 소화관을 적출하고 가려진 몸 부위에 존재했던 소낭을 추가로 계수하여 산출하였다.
이후 각 처리 곤충을 해부하여 형성된 소낭을 해부현미경 50 배 배율에서 관찰했다. 형성된 소낭 수는 먼저 소화관 주변 및 기관지에 붙어 있는 것들을 계수하고, 이후 소화관을 적출하고 가려진 몸 부위에 존재했던 소낭을 추가로 계수하여 산출하였다. 각 소낭 분석은 처리 개체를 반복으로 각 처리는 5 마리로 구성되었다.
희석액에 배춧잎(1 cm2)을 10 분간 침지시킨 후 여과지가 깔려진 용기(직경 9 cm)에서 5 분간 건조시켰다. 각 배추 잎에 갓 부화한 배추좀나방을 10 마리씩 3 반복으로 처리하였으며, 24 시간 주기로 용화될 때까지 처리 배추잎을 제공하였다. 이후 형성된 용수와 용화 직후 용무게를 각각 측정하였다.
각 배추 잎에 갓 부화한 배추좀나방을 10 마리씩 3 반복으로 처리하였으며, 24 시간 주기로 용화될 때까지 처리 배추잎을 제공하였다. 이후 형성된 용수와 용화 직후 용무게를 각각 측정하였다. 대조구는 PBS로 상기와 동일하게 처리하였다.
1A). 재조합된 발현벡터를 단백질 발현전용 BL21 대장균 균주를 이용하여 과발현시켰다(Fig. 1B). 형성된 재조합단백질은 응결체로 구성되어 변성 및 재결합 방식을 이용하여 용해된 순수 단백질을 얻었다.
1B). 형성된 재조합단백질은 응결체로 구성되어 변성 및 재결합 방식을 이용하여 용해된 순수 단백질을 얻었다. SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질은p37로 추정되었으며, 이를 MALDI-TOF로 분석한 결과 CpBV-CST1과 일치하였다(Table 1).
파파인 단백질 분해효소를 대상으로 rCpBV-CST1의 억제 효과를 분석했다(Fig. 2). 대조구로서 재조합단백질 생성 때 연결된 GST를 이용하였다.
시스타틴 활성을 지니는 rCpBV-CST1 단백질을 이용하여 곤충 면역반응에 대한 영향을 분석했다(Fig. 3). 비교적 면역반응 연구에 널리 이용되었던 파밤나방을 본 면역반응 연구에 이용하였다.
4). 배추좀나방 유충 발육 전체 시기에 대해서 섭식이 이뤄졌으며, 이때 발육된 용화율 및 용무게가 분석에 이용되었다. 이때 대조구로서는 과발현 직전의 세균배양액으로부터 추출된 단백질을 이용하였다.
대상 데이터
배추좀나방(P. xylostella)은 안동시 송천동에 소재한 배추 포장에서 채집한 유충을 약제 처리하지 않고 실내에서 누대 사육한 것을 사용하였다. 유충은 온도 25±1℃, 광주기 16:8 h (L:D), 상대습도 40 ~ 60%의 조건에서 배추를 먹이로 사육하였다.
CpBV-CST1의 발현을 위해 약 26 kDa 크기의 glutathione-Stransferase (GST)와 결합된 재조합단백질을 형성하는 pGEX 발현 벡터를 이용하였다(Fig. 1A). 재조합된 발현벡터를 단백질 발현전용 BL21 대장균 균주를 이용하여 과발현시켰다(Fig.
2). 대조구로서 재조합단백질 생성 때 연결된 GST를 이용하였다. rCpBV-CST1은 대조구에 대비 파파인 단백질분해능력을 약 75% 이상 억제하는 것으로 나타났다.
3). 비교적 면역반응 연구에 널리 이용되었던 파밤나방을 본 면역반응 연구에 이용하였다. 세균 주입에 대해서 파밤나방은 8 시간 이내에 체내에 평균 약 37 개의 소낭을 형성하였다.
데이터처리
대조구는 PBS로 상기와 동일하게 처리하였다. 용화율 결과는 백분율 자료로서 arsine 변환 후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석및 처리 평균간 비교를 실시하였다.
이론/모형
성충은 10% 설탕물을 먹이로 공급하고 배추 잎을 이용하여 산란을 유도하였다. 파밤나방(Spodoptera exigua)은 배추좀나방과 같은 조건에서 인공사료(Goh et al., 1990)를 이용하여 Seo et al. (2011)의 방법으로 사육하였다.
성능/효과
형성된 재조합단백질은 응결체로 구성되어 변성 및 재결합 방식을 이용하여 용해된 순수 단백질을 얻었다. SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질은p37로 추정되었으며, 이를 MALDI-TOF로 분석한 결과 CpBV-CST1과 일치하였다(Table 1). 그러나 분리된 단백질에 p30 영역에서 부가적으로 과발현된 단백질이약 5% 정도(단백질 염색 세기 면에서)로 포함되었다.
그러나 분리된 단백질에 p30 영역에서 부가적으로 과발현된 단백질이약 5% 정도(단백질 염색 세기 면에서)로 포함되었다. 이 단백질을 분석하기 위해 MALDI-TOF로 조사한 결과 GST 단백질 서열을 포함하고 있어, 아마도 과발현된 CpBV-CST1의 분해물 또는 미완성 단백질로 추정된다. 즉, 분리된 rCpBV-CST1은 95%가 완전한 형태의 재조합단백질을 포함하고 있다는 것을 의미했다.
대조구로서 재조합단백질 생성 때 연결된 GST를 이용하였다. rCpBV-CST1은 대조구에 대비 파파인 단백질분해능력을 약 75% 이상 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 세균에서 발현한 rCpBV-CST1이 시스타틴의 활성을 지니는 것을 의미했다.
rCpBV-CST1은 대조구에 대비 파파인 단백질분해능력을 약 75% 이상 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 세균에서 발현한 rCpBV-CST1이 시스타틴의 활성을 지니는 것을 의미했다.
그러나 rCpBV-CST1을 함께 주입하는 경우 소낭형성 반응은 급격하게 줄었다. 특별히 이 억제 반응은 주입되는 rCpBV-CST1 농도에 따라 증가하였으며, 조사된 최저 농도 보다 낮은 농도에서 억제를 보일 수 있을 나타냈다.
이때 대조구로서는 과발현 직전의 세균배양액으로부터 추출된 단백질을 이용하였다. rCpBV-CST1의 처리 농도가 높아짐에 따라 배추좀나방의 용화율 억제가 나타났다. 처리구에 비해 용화율이 높지만, 대조구에서도 처리 농도가 높아짐에 따라 다소 용화율이 감소하였다(Fig.
rCpBV-CST1의 처리 농도가 높아짐에 따라 배추좀나방의 용화율 억제가 나타났다. 처리구에 비해 용화율이 높지만, 대조구에서도 처리 농도가 높아짐에 따라 다소 용화율이 감소하였다(Fig. 4A). 본 실험 조건에서 번데기로 발육한 개체들은 rCpBV-CST1의 처리에 따라 용무게의 감소를 보였다(Fig.
4A). 본 실험 조건에서 번데기로 발육한 개체들은 rCpBV-CST1의 처리에 따라 용무게의 감소를 보였다(Fig. 4B).
둘째로, rCpBV-CST1 단백질은 파밤나방의 소낭형성 면역반응을 억제하였다. 혈구 소낭형성 반응은 세포성 면역반응의 일환으로 비교적 다수로 침입한 소형의 병원체에 대해서 혈구들이 연합하여 병원체의 증식을 막는 반응이다(Lavine and Strand, 2002).
셋째로, rCpBV-CST1 단백질의 섭식 처리는 배추좀나방의 유충 발육 및 용화로의 변태를 억제하였다. 일부 높은 농도 처리의 대조구에서 나타난 억제효과는 본 연구에서 사용된 대조구가 IPTG로 가발현하지 않은 동일한 세균 추출액으로 일부 rCpBV-CST1의 발현이 진행된 것으로 해석된다.
셋째로, rCpBV-CST1 단백질의 섭식 처리는 배추좀나방의 유충 발육 및 용화로의 변태를 억제하였다. 일부 높은 농도 처리의 대조구에서 나타난 억제효과는 본 연구에서 사용된 대조구가 IPTG로 가발현하지 않은 동일한 세균 추출액으로 일부 rCpBV-CST1의 발현이 진행된 것으로 해석된다. 이러한 rCpBV-CST1의 억제효과 이 단백질이 소화관 내에 존재하는 캐셉신 소화효소에 대한 직접적 억제 작용으로 해석해 볼 수 있다.
이상의 결과는 재조합단백질 rCpBV-CST1이 시스타틴 활성을 보이며 곤충의 면역 및 발육을 억제하는 기능을 가지고 있다는 것을 보여주었다. 특별히 이 단백질의 섭식 처리에 의해 대상 곤충의 발육 억제 효과는 이 단백질을 이용한 해충 방제의 응용 가능성을 제시하고 있다.
첫째로, 재조합단백질인 rCpBV-CST1은 시스타틴 활성을 보였다. 즉, rCpBV-CST1을 첨가할 경우 파파인 효소의 단백질분해 능력을 약 75% 이상 억제하는 효과를 나타냈다.
첫째로, 재조합단백질인 rCpBV-CST1은 시스타틴 활성을 보였다. 즉, rCpBV-CST1을 첨가할 경우 파파인 효소의 단백질분해 능력을 약 75% 이상 억제하는 효과를 나타냈다. 그러나 다른 종류의 캐셉신에 대한 억제 능력은 본 연구에서 밝혀지지 않았다.
후속연구
따라서 처리된 rCpBV-CST1은 세포외에서 작용하는 캐셉신에 억제 작용을 통해 유충 기간 탈피와 용화 과정동안 조직 재구성을 막아 발육을 억제하는 것으로 해석된다. 그러나 이 후자의 설명은 rCpBV-CST1이 소화관 벽을 통과하여 혈강으로 흡수되었다는 가정 하에서 일어나는 것으로 이에 대한 후속 연구가 필요하다.
특별히 이 단백질의 섭식 처리에 의해 대상 곤충의 발육 억제 효과는 이 단백질을 이용한 해충 방제의 응용 가능성을 제시하고 있다. 즉, 이 단백질을 발현하는 재조합 벡큘로바이러스 또는 형질전환작물로 응용이 가능할 것으로 예상된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
시스테인 단백질분해효소 억제자는 무엇이며 적어도 몇 개의 분류군으로 구별되는가?
시스테인 단백질분해효소 억제자(cysteine protease inhibitor: CSI)는 활성부위에 시스테인 아미노산을 보유하는 단백질분해효소에 대한 억제자로서 적어도 10 개 이상의 분류군으로 구별된다(Rawlings et al., 2004).
시스타틴은 어떤 분류군에 속하게 되는가?
, 2004). 이 가운데 시스타틴(cystatin: CST)은 파파인과 같은 캐셉신(cathepsin) 단백질분해효소에 대한 경쟁적 가역억제자이며 I25의 CSI 분류군에 속하게 된다 (Rawlings et al., 2004).
시스타틴은 단독으로도 항생제 역할을 담당할 수 있음을 보인 연구는?
더욱이 시스타틴은 단독으로도 항생제 역할을 담당할 수 있다. 투구게(Tachypleus tridentatus)에서는 이 시스타틴이 그람음성세균에 대해서 항생 능력을 보였다(Agarwala et al., 1996). 중증열성혈소판감소증후군 병원 바이러스를 매개하는 작은소참진드기(Haemaphysalis longicornis)에서는 이 시스타틴이 원생동물 병원체의 증식을 억제하는 항생 효과를 나타냈다(Zhou et al., 2006).
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