본 연구에서는 울금의 선호도 및 이용율을 높이기 위해 Aspergillus oryzae를 이용하여 발효시킨 후 용매별 추출을 통하여 얻은 발효 울금 추출물들을 사용하여 면역조절 효과를 살펴보았다. MTT assay를 이용하여 실온 추출물 $200{\mu}g/mL$, 열수 추출물 $400{\mu}g/mL$, 20% 주정 추출물 $200{\mu}g/mL$, 80% 주정 추출물 $100{\mu}g/mL$의 농도가 적정하다고 판단되어 추후 실험에 사용하도록 하였다. 면역조절 효과를 보고자 대식세포의 탐식작용 능력, nitric oxide(NO), TNF-${\alpha}$ 생성, NK 세포 활성, SC-1 세포에서 발현되는 LP-BM5 virus의 LP-BM5 eco 유전자 발현을 측정하였다. NK 세포의 활성을 측정한 결과 NK 세포는 YAC-1 세포에 대한 cytotoxity를 관찰했을 때 20% 주정 추출물이 가장 활성을 나타내는 것으로 확인하였다. 발효 울금 추출물 중 열수 추출물과 20% 주정 추출물은 대식세포를 활성화시킴으로써 탐식능력을 증가시켰다. NO 생성을 관찰했을 때 발효 울금처리에 의해 활성화된 대식세포는 효과를 나타내지 않았으나 80% 주정 추출물을 제외한 추출물에서 TNF-${\alpha}$ 생성을 정상군에 비해 유의적으로 증가시켰다. SC-1 세포에 있는 LP-BM5 eco 유전자 발현을 비교하여 바이러스 복제 억제능을 측정한 결과 모든 추출물이 유의적으로 억제되었으며, 특히 20% 주정 추출물이 가장 많이 억제하고 있는 것을 확인할 수 있다. 이러한 연구 결과로부터 발효 울금이 면역조절 효과를 가진 천연 기능성 소재로 개발에 있어 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
본 연구에서는 울금의 선호도 및 이용율을 높이기 위해 Aspergillus oryzae를 이용하여 발효시킨 후 용매별 추출을 통하여 얻은 발효 울금 추출물들을 사용하여 면역조절 효과를 살펴보았다. MTT assay를 이용하여 실온 추출물 $200{\mu}g/mL$, 열수 추출물 $400{\mu}g/mL$, 20% 주정 추출물 $200{\mu}g/mL$, 80% 주정 추출물 $100{\mu}g/mL$의 농도가 적정하다고 판단되어 추후 실험에 사용하도록 하였다. 면역조절 효과를 보고자 대식세포의 탐식작용 능력, nitric oxide(NO), TNF-${\alpha}$ 생성, NK 세포 활성, SC-1 세포에서 발현되는 LP-BM5 virus의 LP-BM5 eco 유전자 발현을 측정하였다. NK 세포의 활성을 측정한 결과 NK 세포는 YAC-1 세포에 대한 cytotoxity를 관찰했을 때 20% 주정 추출물이 가장 활성을 나타내는 것으로 확인하였다. 발효 울금 추출물 중 열수 추출물과 20% 주정 추출물은 대식세포를 활성화시킴으로써 탐식능력을 증가시켰다. NO 생성을 관찰했을 때 발효 울금처리에 의해 활성화된 대식세포는 효과를 나타내지 않았으나 80% 주정 추출물을 제외한 추출물에서 TNF-${\alpha}$ 생성을 정상군에 비해 유의적으로 증가시켰다. SC-1 세포에 있는 LP-BM5 eco 유전자 발현을 비교하여 바이러스 복제 억제능을 측정한 결과 모든 추출물이 유의적으로 억제되었으며, 특히 20% 주정 추출물이 가장 많이 억제하고 있는 것을 확인할 수 있다. 이러한 연구 결과로부터 발효 울금이 면역조절 효과를 가진 천연 기능성 소재로 개발에 있어 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
Curcuma longa L. (CL) is a well known traditional medicinal plant that is also used in curries and mustards as a coloring and flavoring agent. However, CL is not usually used as a food source due to its bitter taste. We investigated the immunomodulatory effect of CL fermented by Aspergillus oryzae (...
Curcuma longa L. (CL) is a well known traditional medicinal plant that is also used in curries and mustards as a coloring and flavoring agent. However, CL is not usually used as a food source due to its bitter taste. We investigated the immunomodulatory effect of CL fermented by Aspergillus oryzae (FCL) on RAW 264.7 cells. FCL was extracted with cold water (CW), hot water (HW), 20% ethanol (20% EtOH) and 80% ethanol (80% EtOH), after which its effects on phagocytic activity, tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$), nitric oxide (NO) production, natural killer (NK) cell activity and mRNA expression of LP-BM5 eco were investigated. Phagocytic activity was increased in HW and 20% EtOH when compared to the control. The secretion of nitric oxide (NO) from RAW 264.7 cells did not change significantly relative to the control. However, TNF-${\alpha}$ was significantly increased by the addition of FCL extracts. Moreover, FCL 20% ethanol extract showed a four fold increase in NK cell cytotoxity relative to the control group. Finally, we observed suppressed mRNA expression of LP-BM5 eco in FCL extracts, especially in the 20% ethanol extracts group. These results indicate that the FCL extracts can be used as a functional material due to their effective immunomodulating activities.
Curcuma longa L. (CL) is a well known traditional medicinal plant that is also used in curries and mustards as a coloring and flavoring agent. However, CL is not usually used as a food source due to its bitter taste. We investigated the immunomodulatory effect of CL fermented by Aspergillus oryzae (FCL) on RAW 264.7 cells. FCL was extracted with cold water (CW), hot water (HW), 20% ethanol (20% EtOH) and 80% ethanol (80% EtOH), after which its effects on phagocytic activity, tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$), nitric oxide (NO) production, natural killer (NK) cell activity and mRNA expression of LP-BM5 eco were investigated. Phagocytic activity was increased in HW and 20% EtOH when compared to the control. The secretion of nitric oxide (NO) from RAW 264.7 cells did not change significantly relative to the control. However, TNF-${\alpha}$ was significantly increased by the addition of FCL extracts. Moreover, FCL 20% ethanol extract showed a four fold increase in NK cell cytotoxity relative to the control group. Finally, we observed suppressed mRNA expression of LP-BM5 eco in FCL extracts, especially in the 20% ethanol extracts group. These results indicate that the FCL extracts can be used as a functional material due to their effective immunomodulating activities.
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문제 정의
주로 울금의 커큐민 성분에 대해 많은 기능성 연구가 보고되어져 왔으나 발효 울금에 대한 연구로는 간독성에 대한 보호 효과(15), 항비만(24), 피부 관련 생리활성 효과(25) 등으로 미비하게 진행되었으며 면역조절에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이 다. 따라서 본 연구에서는 발효 울금의 용매별 추출물을 이용하여 면역 조절에 효능을 확인하고 기능성 소재로서의 가능성을 제시하고자 한다.
본 연구에서는 발효 울금 추출물의 처리만으로 대식세포 활성에 미치는 영향과 NO와 TNF-α의 분비량을 측정함으 로써 면역 조절에 미치는 영향을 확인하였다.
NK 세포는 interferon이나 대식세포 유래 cytokines에 의하여 활성화 되며 MHC class І 발현의 변화를 인식하여 비 감염세포에 대한 활성화를 막음으로써 감염세포만 선택적으로 세포사 멸을 유도시킨다(32). 본 연구에서는 암세포인 YAC-1 세포를 사용하여 NK 세포의 YAC-1 세포 사멸 효능을 측정함으 로써 NK 세포의 활성을 살펴보았다. 그 결과 열수 추출물과 20% 주정 추출물에서 각각 2배, 4배 가까운 유의적 활성을 관찰할 수 있었다.
본 연구에서는 울금의 선호도 및 이용율을 높이기 위해 Aspergillus oryzae를 이용하여 발효시킨 후 용매별 추출을 통하여 얻은 발효 울금 추출물들을 사용하여 면역조절 효과를 살펴보았다. MTT assay를 이용하여 실온 추출물 200 μg/mL, 열수 추출물 400 μg/mL, 20% 주정 추출물 200 μg/mL, 80% 주정 추출물 100 μg/mL의 농도가 적정하다고 판단되어 추후 실험에 사용하도록 하였다.
이러한 뛰어난 생리적 활성을 지닌 울금은 특유의 맛과 향으로 인해 이용률이 낮아 산업적으로 문제점을 지니고 있다. 이러한 문제점을 보완하기 위해 이번 연구에서 A. oryzae를 이용하여 발효시킨 후 각 용매별로 추출하여 사용하였으며, 이러한 발효 울금 추출물에서도 면역 조절 효능이 있는지 확인하고자 하였 다. 따라서 RAW 264.
울금의 뿌리 에서 추출된 커큐민(curcumin)은 가장 대표적인 성분으로 항균활성과 항산화효과(17,19), 항염증(20), 항암(21), 면역조절(14,22,23) 등이 보고되고 있다. 이러한 울금의 여러 기능성에도 불구하고 쓴맛, 강한 향으로 인해 소비자 선호와 이용률이 낮아지고 있어 이러한 문제점을 해결하고자 본 연구는 Aspergillus oryzae를 이용하여 맛과 향을 개선한 발효 울금 추출물의 기능성을 확인하고자 한다. 주로 울금의 커큐민 성분에 대해 많은 기능성 연구가 보고되어져 왔으나 발효 울금에 대한 연구로는 간독성에 대한 보호 효과(15), 항비만(24), 피부 관련 생리활성 효과(25) 등으로 미비하게 진행되었으며 면역조절에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이 다.
제안 방법
3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 시약을 20 μL 처리하여 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 3시간 배양한 후 상층액을 제거하고, DMSO(SigmaAldrich Co.) 200 μL를 가하여 560 nm에서 ELISA reader(VERSAMAXSL-20, Molecular Devices, Seoul, Korea) 를 이용하여 측정하였다.
37°C, 5% CO2에 4시간 동안 배양한 후 유리된 lactate dehydrogenase(LDH)를 cytotox 96 non radioactive cytotoxicity assay kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 사용하였 다.
cells/well의 농도로 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 분주하여 12시간 동안 안정화시킨 후 CW 200 μg/mL, HW 400 μg/mL, 20% EtOH 200 μg/mL, 80% EtOH 100 μg/mL를 세포에 분주하였다. 4시간 후 trypsin 0.25% solution(Hyclone Laboratories) 으로 세포를 수집하여 RNeasy extraction kit(Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)로 제조사의 protocol에 따라 RNA 추출을 실시하였다. iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Inc.
37°C, 5% CO2에 4시간 동안 배양한 후 유리된 lactate dehydrogenase(LDH)를 cytotox 96 non radioactive cytotoxicity assay kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 사용하였 다. ELISA reader를 이용하여 흡광도 490 nm에서 측정하여 계산하고 YAC-1세포의 사멸정도를 NK cell activity (%)로 나타내었다.
실험에 사용된 LP-BM5 virus는 비장비대증, 림프비대증, T 세포와 B 세포의 면역기능장애 등에 의해 특징지어진 murine leukemia retro virus이다(33). LP-BM5 virus에 노출시킨 SC-1 세포에서 바이러스의 복제 정도를 측정하기 위해 LP-BM5 eco의 발현을 측정하는 방법을 사용하였다. 그 결과 정상군에 비해 발효 울금 추출물의 처리가 유의적으로 LP-BM5 eco 발현을 억제한 것을 알 수 있었으며, 특히 20% 주정 추출물이 가장 많이 억제시켰음을 확인할 수 있었다.
LP-BM5 바이러스에 감염된 SC-1 세포를 이용하여 발효 울금 추출물이 LP-BM5 eco 발현 억제에 영향을 미쳤는지 관찰하였다. 발효 울금 추출물을 처리하지 않은 LP-BM5 바이러스에 감염된 SC-1 세포(control)의 LP-BM5 eco 발현과 비교하여 발효 울금을 처리한 군에서 CW는 0.
MTT assay를 이용하여 실온 추출물 200 μg/mL, 열수 추출물 400 μg/mL, 20% 주정 추출물 200 μg/mL, 80% 주정 추출물 100 μg/mL의 농도가 적정하다고 판단되어 추후 실험에 사용하도록 하였다.
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1×106 cells/well씩 분주한 후 24시간 동안 배양시켜 Cytoselect 96 well phagocytosis assay kit(Cell biolabs Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 대식세포의 탐식능을 측정하였다.
Real-time PCR 반응은 총 20 μL 내에 cDNA 2 μL와 2X SYBR mix 10 μL, forward, reverse primer는 각각 100 pmol/μL를 1 μL씩 첨가하였고, 나머지는 H2O로 채워 주었다.
Target 세포는 YAC-1 세포를 이용하였으며 effector 세포와 target 세포의 비율을 5:1로 조정하고 CW 200 μg/mL, HW 400 μg/mL, 20% EtOH 200 μg/mL, 80% EtOH 100 μg/mL로 처리하였다.
YAC-1 세포의 사멸 정도를 측정함으로써 NK 세포의 활성을 평가하였다. 대조군과 CW, 80% EtOH는 군간 유의적인 차이를 보이지 않았다.
25% solution(Hyclone Laboratories) 으로 세포를 수집하여 RNeasy extraction kit(Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)로 제조사의 protocol에 따라 RNA 추출을 실시하였다. iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용 하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위 하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories Inc.
그 결과 열수 추출물과 20% 주정 추출물에서 각각 2배, 4배 가까운 유의적 활성을 관찰할 수 있었다. 결과적으로 바이러스 복제가 억제되었는지 살펴보기 위해 murine leukemia virus(MuLV) 혼합체중 하나인 LP-BM5 eco의 발현을 측정하였다. 실험에 사용된 LP-BM5 virus는 비장비대증, 림프비대증, T 세포와 B 세포의 면역기능장애 등에 의해 특징지어진 murine leukemia retro virus이다(33).
따라서 RAW 264.7 세포를 이용하여 대식세포의 탐식작용 활성, NO 분비량, TNF-α 분비량, NK 세포 활성능, LP-BM5 바이러스에 감염된 SC-1 세포를 이용한 바이러스 억제능을 측정함으로써 발효 울금 추출물의 면역조절 효능을 평가하였다.
11%의 생존율을 보였다. 따라서 이러한 각 용매별 추출물의 오차 범위를 감안하여 80~100% 이상 생존율을 보인 농도를 선택하여 추후 실험에 사용하였다(Fig. 1).
면역조절 효과를 보고자 대식세포의 탐식작용 능력, nitric oxide(NO), TNFα 생성, NK 세포 활성, SC-1 세포에서 발현되는 LP-BM5 virus의 LP-BM5 eco 유전자 발현을 측정하였다.
Hot start를 위해 95°C에서 8분, 증폭 단계의 denaturation을 95°C에서 15초, annealing을 60°C에서 45초, extension을 72°C에서 45초간 반복하며, 각 cycle의 extension 후에 값이 기록되 었다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Applied Biosystems에서 제공하는 One step system software v2.
발효 울금 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 독성을 측정 하기 위해 96 well plate에 1×104 cells/well이 되도록 분주한 후 발효 울금 추출물을 농도별로 처리하고 24시간 배양 하였다.
발효 울금 추출물의 적정농도를 결정하기 위해 발효 울금 80% 주정 추출물(80% EtOH)은 0∼200 μg/mL, 나머지 추출물은 0∼1,000 μg/mL 농도로 RAW 264.7 세포에 처리한후 세포의 생존율을 측정하였다.
, Hercules, CA, USA)를 사용 하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위 하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였 고, 기기는 Real-Time PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR primer의 염기서열은 다음과 같다: GAPDH forward primer 5’ CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA 3’, reverse primer 5’ GCG GCA CGT CAG ATC CA 3’, LP-BM5 eco forward primer 5’ CCA ATG TGT CCA TGT CAT TT 3’, reverse primer 5’ GCG ATG AGC AGA GAG AGA AAG 3’.
oryzae를 접종한 후 발효조를 20분 회전하여 혼합하고 25±2℃, 습도 50±5%에서 36시간 동안 발효시켰다. 추출물 제조는 분말상태인 시료에 용매(정제수, 20% 에탄올, 80% 에탄올)를 첨가하고 실온 추출물(CW) 제조는 실온에서 5시간 추출, 열수 추출물(HW) 제조는 100℃에서 4시간 추출, 20% 주정 추출물(20% EtOH) 제조는 95℃에서 4시간 추출, 80% 주정 추출물(80% EtOH) 제조는 75℃에서 4시간 추출 후, 감압여과 장치에서 뜨거운 상태로 여과한후 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결 건조 하여 실험에 사용하였다.
하지만 적정량의 NO와 TNF-α 의 생성은 오히려 선천성 면역의 중요한 인자로 여겨지기 때문에, 본 연구에서는 LPS를 처리한 군과 비교하여 LPS를 처리하지 않은 정상세포에 발효 울금을 처리할 때 선천성 면역을 활성화시킬 정도의 NO와 TNF-α가 생성되는지 RAW 264.7 세포를 사용하여 관찰하였다.
대상 데이터
7 세포와 SC-1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였고 YAC-1 세포는 경기대학교(Suwon, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포와 SC-1 세포는 10% fetal bovine serum(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mmol/L glutamine, 100 mg/L penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM(Hyclone Laboratories)을 이용하였고, YAC-1 세포는 10% fetal bovine serum(Hyclone Laboratories), 2 mmol/L glutamine, 100 mg/L penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI 1640 (Hyclone Laboratories)을 이용하여 37℃, 5% CO2로 조절된 incubator(Heraeus BB15, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.
, San Diego, CA, USA)를 이용하여 대식세포의 탐식능을 측정하였다. 본 실험에서 대식세포를 활성화시켜 탐식능을 증가시키기 위해 kit에 포함된 zymosan 입자를 사용하였다. Zymosan을 첨가하고 CW 200 μg/mL, HW 400 μg/mL, 20% EtOH 200 μg/mL, 80% EtOH 100 μg/mL로 처리하여 15분 동안 배양 하였다.
본 연구에 사용된 울금은 한국인스팜(주)(Hwasun, Korea) 에서 제공받았으며, A.oryzae는 충무발효(주)(Ulsan, Korea)에서 구입하였다. 발효에 사용할 원료는 정밀히 칭량해 121℃에서 20분간 가압 멸균하였다.
결과적으로 바이러스 복제가 억제되었는지 살펴보기 위해 murine leukemia virus(MuLV) 혼합체중 하나인 LP-BM5 eco의 발현을 측정하였다. 실험에 사용된 LP-BM5 virus는 비장비대증, 림프비대증, T 세포와 B 세포의 면역기능장애 등에 의해 특징지어진 murine leukemia retro virus이다(33). LP-BM5 virus에 노출시킨 SC-1 세포에서 바이러스의 복제 정도를 측정하기 위해 LP-BM5 eco의 발현을 측정하는 방법을 사용하였다.
실험에 사용한 RAW 264.7 세포와 SC-1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였고 YAC-1 세포는 경기대학교(Suwon, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.
데이터처리
Statistical analyses were performed by Duncan's multiple range tests after one-way ANOVA using SPSS software.
모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Applied Biosystems에서 제공하는 One step system software v2.1로 분석하였다.
두 그룹 간의 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였으며 각 실험군 간에 유의성을 P<0.05 수준에서 검정하였다.
본 연구에서는 SPSS(Statistical Package for Social Science, version 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 이용하여 각 실험군의 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였고, 그룹 간의 통계적 유의성을 Duncan's multiple range test로 실시하였다.
성능/효과
HW와 20% EtOH에서는 zymosan만 처리한 군에 비해 각각 유의적으로 약 123.79±4.71%, 118.41±11.21% 증가하였음을 알 수 있었다(P<0.05).
면역조절 효과를 보고자 대식세포의 탐식작용 능력, nitric oxide(NO), TNFα 생성, NK 세포 활성, SC-1 세포에서 발현되는 LP-BM5 virus의 LP-BM5 eco 유전자 발현을 측정하였다. NK 세포의 활성을 측정한 결과 NK 세포는 YAC-1 세포에 대한 cytotoxity를 관찰했을 때 20% 주정 추출물이 가장 활성을 나타내는 것으로 확인하였다. 발효 울금 추출물 중 열수 추출물과 20% 주정 추출물은 대식세포를 활성화시킴으로써 탐식능력을 증가시켰다.
NO 생성을 관찰했을 때 발효 울금 처리에 의해 활성화된 대식세포는 효과를 나타내지 않았으나 80% 주정 추출물을 제외한 추출물에서 TNF-α 생성을 정상군에 비해 유의적으로 증가시켰다.
NO 생성을 관찰했을 때 발효 울금 처리에 의해 활성화된 대식세포는 효과를 나타내지 않았으나 80% 주정 추출물을 제외한 추출물에서 TNF-α 생성을 정상군에 비해 유의적으로 증가시켰다. SC-1 세포에 있는 LP-BM5 eco 유전자 발현을 비교하여 바이러스 복제 억제 능을 측정한 결과 모든 추출물이 유의적으로 억제되었으며, 특히 20% 주정 추출물이 가장 많이 억제하고 있는 것을 확인할 수 있다. 이러한 연구 결과로부터 발효 울금이 면역조절 효과를 가진 천연 기능성 소재로 개발에 있어 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
그 결과 대식 세포의 탐식작용과 TNF-α의 분비가 추출 용매별로 차이를 보였지만 증가되었음을 확인하였다.
본 연구에서는 암세포인 YAC-1 세포를 사용하여 NK 세포의 YAC-1 세포 사멸 효능을 측정함으 로써 NK 세포의 활성을 살펴보았다. 그 결과 열수 추출물과 20% 주정 추출물에서 각각 2배, 4배 가까운 유의적 활성을 관찰할 수 있었다. 결과적으로 바이러스 복제가 억제되었는지 살펴보기 위해 murine leukemia virus(MuLV) 혼합체중 하나인 LP-BM5 eco의 발현을 측정하였다.
LP-BM5 virus에 노출시킨 SC-1 세포에서 바이러스의 복제 정도를 측정하기 위해 LP-BM5 eco의 발현을 측정하는 방법을 사용하였다. 그 결과 정상군에 비해 발효 울금 추출물의 처리가 유의적으로 LP-BM5 eco 발현을 억제한 것을 알 수 있었으며, 특히 20% 주정 추출물이 가장 많이 억제시켰음을 확인할 수 있었다.
따라서 발효 울금 추출물의 TNF-α 분비 증가의 결과는 발효 울금에 포함된 커큐민의 효능이라고 예상할수 있다.
또한 대식세포의 활성화에 의한 TNF-α 분비량의 증가로 볼 수 있으며 이러한 결과는 발효 울금 추출물이 면역반응을 증가시켰음을 알 수 있게 하였다.
반면 정상군과 비교하여 HW는약 2배, 20% EtOH는 약 4배 높은 활성을 보이면서 통계적 으로 유의적인 차이를 보였다(P<0.05)(Fig. 5).
NK 세포의 활성을 측정한 결과 NK 세포는 YAC-1 세포에 대한 cytotoxity를 관찰했을 때 20% 주정 추출물이 가장 활성을 나타내는 것으로 확인하였다. 발효 울금 추출물 중 열수 추출물과 20% 주정 추출물은 대식세포를 활성화시킴으로써 탐식능력을 증가시켰다. NO 생성을 관찰했을 때 발효 울금 처리에 의해 활성화된 대식세포는 효과를 나타내지 않았으나 80% 주정 추출물을 제외한 추출물에서 TNF-α 생성을 정상군에 비해 유의적으로 증가시켰다.
발효 울금 추출물을 처리하지 않은 LP-BM5 바이러스에 감염된 SC-1 세포(control)의 LP-BM5 eco 발현과 비교하여 발효 울금을 처리한 군에서 CW는 0.599± 0.099, HW는 0.607±0.134, 20% EtOH 0.321±0.079, 80% EtOH 0.598±0.073으로 모든 군에서 유의적으로 발현이 감소되었다(P<0.05).
본 연구에서는 발효 울금 추출물이 면역관련 세포의 활성 인자로 작용하며 결과적으로 바이러스의 복제를 억제시켰 음을 확인하였다. 이러한 효능을 통하여 발효 울금은 억제된 면역을 증가시켜 염증성 질환을 예방하고 면역과민 반응을 감소시켜 면역 조절 및 항상성을 유지하여 자가 면역 질환및 알레르기를 억제시킬 수 있을 것이라고 사료된다.
실험 결과 Fig. 1에서 나타난 바와 같이 CW와 20% EtOH는 200 μg/mL 농도에서 각각 81.81±4.20%와 88.38±2.85%, HW는 400 μg/mL 농도 에서 80.17±7.70%, 80% EtOH는 100 μg/mL 농도에서 86.68±3.11%의 생존율을 보였다.
탐식작용을 자극시키는 zymosan을 처리한 군(positive control)에서의 탐식작용 활성을 100%로 비교하였을 때 정상군의 37.23±3.21%보다 유의적으로 63% 증가된 것으로 보아 zymosan이 정상적으로 작용하였음을 확인할 수 있었 다(P<0.05).
특히 20% EtOH이 가장 유의적으로 발현이 억제되었음을 관찰할 수 있었다(P<0.05)(Fig. 6).
후속연구
이러한 효능을 통하여 발효 울금은 억제된 면역을 증가시켜 염증성 질환을 예방하고 면역과민 반응을 감소시켜 면역 조절 및 항상성을 유지하여 자가 면역 질환및 알레르기를 억제시킬 수 있을 것이라고 사료된다. 따라서 추후 면역 조절 기능성 식품의 상업화에 기초 자료가 되어 국내 기능성 소재로서의 활용을 기대할 수 있다.
SC-1 세포에 있는 LP-BM5 eco 유전자 발현을 비교하여 바이러스 복제 억제 능을 측정한 결과 모든 추출물이 유의적으로 억제되었으며, 특히 20% 주정 추출물이 가장 많이 억제하고 있는 것을 확인할 수 있다. 이러한 연구 결과로부터 발효 울금이 면역조절 효과를 가진 천연 기능성 소재로 개발에 있어 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
본 연구에서는 발효 울금 추출물이 면역관련 세포의 활성 인자로 작용하며 결과적으로 바이러스의 복제를 억제시켰 음을 확인하였다. 이러한 효능을 통하여 발효 울금은 억제된 면역을 증가시켜 염증성 질환을 예방하고 면역과민 반응을 감소시켜 면역 조절 및 항상성을 유지하여 자가 면역 질환및 알레르기를 억제시킬 수 있을 것이라고 사료된다. 따라서 추후 면역 조절 기능성 식품의 상업화에 기초 자료가 되어 국내 기능성 소재로서의 활용을 기대할 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
울금은 무엇인가?
이러한 천연물 중 하나인 울금(Curcuma longa L., tumeric)은 생강과에 속하는 다년생 초본식물로 노란색 향신료로 사용될 뿐만 아니라 염료와 식품의 착색제로 사용되고 있으며 중국, 인도, 일본 등 다른 아시아 국가에서 널리 재배되고 있다(14-18). 울금의 뿌리 에서 추출된 커큐민(curcumin)은 가장 대표적인 성분으로 항균활성과 항산화효과(17,19), 항염증(20), 항암(21), 면역조절(14,22,23) 등이 보고되고 있다.
면역작용은 어떻게 나눌 수있는가?
인체는 외부 병원체 등의 각종 외부 물질의 침입을 식별하고 이를 제거함으로써 몸을 보호하며 항상성을 유지하는 자기방어체계인 면역작용을 한다(1). 이러한 면역작용은 면역을 억제 조절하는 면역 관용과 면역을 증진하는 면역반응으로 나눌 수 있다. 이 두 가지의 면역작용에 의하여 면역조절, 즉 항상성이 이루어진다.
울금 추출물 제조 방법은 어떻게 진행되는가?
oryzae를 접종한 후 발효조를 20분 회전하여 혼합하고 25±2°C, 습도 50±5%에서 36시간 동안 발효시켰다. 추출물 제조는 분말상태인 시료에 용매(정제수, 20% 에탄올, 80% 에탄올)를 첨가하고 실온 추출물(CW) 제조는 실온에서 5시간 추출, 열수 추출물(HW) 제조는 100°C에서 4시간 추출, 20% 주정 추출물(20% EtOH) 제조는 95°C에서 4시간 추출, 80% 주정 추출물(80% EtOH) 제조는 75°C에서 4시간 추출 후, 감압여과 장치에서 뜨거운 상태로 여과한후 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결 건조 하여 실험에 사용하였다.
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