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문제 정의
- 본 연구는 목적은 단일 박테리오파지를 이용하여 볏짚으로부터 B. cereus가 제거된 스타터 컬쳐를 개발하는 것이다. 다양한 배지 가운데 5% 콩 갈은 물(GB)이 볏짚 미생물의 증식과 박테리오파지 BCP8-2의 활성에 적합한 배지로 선정되었다.
- , Yersinia enterocolitica 등)을 박테리오파지를 이용하여 제어하기 위한 연구가 보고되었다(10-14). 본 연구에서는 박테리오파지 BCP8-2(15,16)를 이용하여 볏짚 유래 미생물군들 중 B. cereus를 선택적으로 제거한 스타터 컬쳐를 개발하고 이의 특성을 분석하고자 한다. 본 연구의 성공은 안전하고 전통장류 고유의 특성을 유지한 전통장류제품의 개발에 기여할 것으로 사료된다.
가설 설정
- cereus JCM2152 in different starter cultures. (B) Total and B. cereus counts of cheonggukjang made with P6 cultures either BCP8-2 treated or no phage treated.
제안 방법
- 먼저 볏짚 배양(P1) 후 미생물군집 분석은 16S rDNA 염기서열 에 기반한 DGGE를 이용하였고, 총 세균 수를 측정하였으며, 다 양한 배지에서 host strain에 대한 BCP8-2의 활성을 분석하였다. DGGE 분석에서는 순창군의 서로 다른 5개의 행정구역에서 수거된 볏짚 샘플 미생물을 5종류의 배지를 이용하여 배양하였고, 미생물 군집 DNA 분리 후 이를 이용해 증폭한 16S rDNA를 이용하였다. 각각의 샘플에서 서로 다른 DGGE 패턴이 확인되었는데(data not shown), 전체적으로 TA와 TSB에서 상대적으로 많은 밴드를 형성하였고 DW와 RE의 밴드수가 상대적으로 적었으며, GB는 밴드수에서 중간 정도를 나타냈다(Fig.
- MoBio Soil DNA isolation kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 1 mL의 샘플로부터 total microbial community DNA를 분리하였다. 분리된 DNA의 농도는 Epoch MicroVolume Spectrophotometer (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 이때 338f-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG (밑줄은 5' end GC clamp)와 518r-ATTACCGCGGCTGCTGG (17)을 primer 로 이용하였고, PCR cycle은 hot start (94℃, 5 min), 30 PCR cycles (94℃, 1 min; 52℃, 1 min; 72℃, 1 min) 및 final exten sion (72℃, 10 min)으로 구성하였다. PCR product는 agarose를 이용한 전기영동법으로 확인하였고, Epoch Micro-Volume Spectrophotometer (BioTek)을 이용하여 정량하였다. 정량된 PCR product 는 10-60% gradient gel과 DGGE (Cipher DGGE Electrophoresis System, C.
- Starter culture의 B. cereus와 호기성 총 세균수는 각각 Brilliance Bacillus cereus Agar medium (Oxoid, Hampshire, UK)와 trypticase soy agar (TSA)를 이용하였다.
- 이렇게 배양된 culture를 다시 새로운 GB에 접종(1% 또 는 10% inoculum)하고 같은 조건에서 10시간 배양(P2)하였고, 이러한 과정을 P6까지 진행하였다. 각 passage 마다 샘플링을 통해 총 세균 수, B. cereus CFU 및 BCP8-2 PFU counting을 수행하였고, 16s rDNA 염기서열을 바탕으로 한 DGGE 및 pyrosequencing을 수행하였다(아래 참조). 이 때 박테리오파지를 넣지 않은 샘플을 control로 사용하였다.
- 또한 다양한 배지에서 BCP8-2의 활성을 측정하기 위해 B. cereus JCM2152을 107 CFU/mL 농도로 접종하고 107-109 PFU/mL의 농도로 BCP8-2를 첨가한 후 37℃에서 증식하면서 4시간 동안 OD600 및 CFU를 측정하였다.
- 볏짚유래 미생물과 박테리오파지 BCP8-2의 증식을 위한 최적 배지의 선정은 3가지 기준에 의해 결정하였다. 먼저 볏짚 배양(P1) 후 미생물군집 분석은 16S rDNA 염기서열 에 기반한 DGGE를 이용하였고, 총 세균 수를 측정하였으며, 다 양한 배지에서 host strain에 대한 BCP8-2의 활성을 분석하였다. DGGE 분석에서는 순창군의 서로 다른 5개의 행정구역에서 수거된 볏짚 샘플 미생물을 5종류의 배지를 이용하여 배양하였고, 미생물 군집 DNA 분리 후 이를 이용해 증폭한 16S rDNA를 이용하였다.
- Multiplex Identifier (MIDs, Roche, Mannheim, Germany)를 Genome sequence FLX system (Roche)에 적용하기 위한 16S rDNA 유전자들의 single-stranded DNA library를 준비하였다. 미생물 군집 분석을 위한 pyrosequencing은 Roche GS-FLX 454 pyrosequence (Roche)을 이용하여 수행하였다(ChunLab, Inc, Seoul, Korea). 이를 통해 얻어진 16S rDNA 유전자 염기서열 정보는 다 양한 변수들(minimum alignment length, 50 bp; E-value cutoffs, 0.
- 볏짚 유래 미생물 증식을 위한 최적 배지를 선정하기 위해 볏짚 10 g을 각각 100 mL의 증류수(distilled water, DW), rice straw extract (RE), 5% 콩 갈은 물(GB), TA broth(15) 및 nutrient broth (NB; Difco)에 첨가 후 37℃에서 10시간 배양하였다. Rice straw extract (RE)는 증류수에 10% 볏짚을 넣고 autoclave 후 상등액을 이용하였고, GB의 경우 상온에서 10시간 침지한 콩의 수분을 제거하고 필터가 있는 stomacher bag에 넣어 으깬 후(BagMixer, Intescience, Saint Nom, France), 상등액을 autoclave하여 이용하였다.
- 볏짚 유래 스타터 컬쳐의 미생물 군집을 분석하기 위해 16S rDNA 염기서열을 바탕으로한 DGGE와 pyrosequencing을 실시하였다. 16S rDNA 유전자를 기반으로 한 DGGE는 식품 및 식품 관련 생태계의 미생물군을 분석하는데 유용하게 이용되고 있다 (21).
- 에만 특이적으로 작용하는 것으로 보고되었다(15). 볏짚유래 미생물과 박테리오파지 BCP8-2의 증식을 위한 최적 배지의 선정은 3가지 기준에 의해 결정하였다. 먼저 볏짚 배양(P1) 후 미생물군집 분석은 16S rDNA 염기서열 에 기반한 DGGE를 이용하였고, 총 세균 수를 측정하였으며, 다 양한 배지에서 host strain에 대한 BCP8-2의 활성을 분석하였다.
- S Scientific, Del Mar, CA, USA)를 이용하여 분리하였다. 분리된 DNA는 ethidium bromide를 이용하여 염색했고, UV 를 이용하여 분석하였다.
- MoBio Soil DNA isolation kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 1 mL의 샘플로부터 total microbial community DNA를 분리하였다. 분리된 DNA의 농도는 Epoch MicroVolume Spectrophotometer (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 순수 분리된 DNA를 이용하여 16S rDNA 유전자의 V3 region을 PCR (MyCycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭하였다. 이때 338f-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG (밑줄은 5' end GC clamp)와 518r-ATTACCGCGGCTGCTGG (17)을 primer 로 이용하였고, PCR cycle은 hot start (94℃, 5 min), 30 PCR cycles (94℃, 1 min; 52℃, 1 min; 72℃, 1 min) 및 final exten sion (72℃, 10 min)으로 구성하였다.
- Rice straw extract (RE)는 증류수에 10% 볏짚을 넣고 autoclave 후 상등액을 이용하였고, GB의 경우 상온에서 10시간 침지한 콩의 수분을 제거하고 필터가 있는 stomacher bag에 넣어 으깬 후(BagMixer, Intescience, Saint Nom, France), 상등액을 autoclave하여 이용하였다. 이 때 TA를 제외한(TA 배지는 MgSO4 를 포함하고 있음) 모든 배지들에서 필요에 따라 MgSO4 를 첨가(0.8 mM)하여 이용하였다. 이렇게 준비된 볏짚 유래 미생물 군집은 아래 설명된 degenerating gradient gel electrophoresis (DGGE)를 이용하여 분석하였다.
- 이때 338f-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG (밑줄은 5' end GC clamp)와 518r-ATTACCGCGGCTGCTGG (17)을 primer 로 이용하였고, PCR cycle은 hot start (94℃, 5 min), 30 PCR cycles (94℃, 1 min; 52℃, 1 min; 72℃, 1 min) 및 final exten sion (72℃, 10 min)으로 구성하였다.
- 8 mM)하여 이용하였다. 이렇게 준비된 볏짚 유래 미생물 군집은 아래 설명된 degenerating gradient gel electrophoresis (DGGE)를 이용하여 분석하였다.
- PCR product는 agarose를 이용한 전기영동법으로 확인하였고, Epoch Micro-Volume Spectrophotometer (BioTek)을 이용하여 정량하였다. 정량된 PCR product 는 10-60% gradient gel과 DGGE (Cipher DGGE Electrophoresis System, C.B.S Scientific, Del Mar, CA, USA)를 이용하여 분리하였다. 분리된 DNA는 ethidium bromide를 이용하여 염색했고, UV 를 이용하여 분석하였다.
- subtilis KACC10113, 108 CFU/mL) 1 mL를 넣고 50℃에서 48시간 배양하였다. 총 균 수와 B. cereus CFU를 각각 TSA (Difco)와 Brillliance Bacillus cereus agar base (Oxoid)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- Multiplex Identifier (MIDs, Roche, Mannheim, Germany)를 Genome sequence FLX system (Roche)에 적용하기 위한 16S rDNA 유전자들의 single-stranded DNA library를 준비하였다. 미생물 군집 분석을 위한 pyrosequencing은 Roche GS-FLX 454 pyrosequence (Roche)을 이용하여 수행하였다(ChunLab, Inc, Seoul, Korea).
- 볏짚 샘플은 전라북도 순창 지역의 벼 수확 후 논에서 채취하였다. B.
- 순창군의 서로 다른 지역에서 수집된 8개의 볏짚 샘플들을 대상으로 연구를 진행하였다. 다양한 농도(107-109 PFU/mL)의 BCP8-2 처리와 상관없이 GB에서 배양된 8개의 볏짚 샘플들은 모두 109 CFU/mL 이상의 총 세균 수를 보였고, 이들 중 박테리오파지를 처리한 1개의 샘플에서 B.
데이터처리
- 미생물 군집 분석을 위한 pyrosequencing은 Roche GS-FLX 454 pyrosequence (Roche)을 이용하여 수행하였다(ChunLab, Inc, Seoul, Korea). 이를 통해 얻어진 16S rDNA 유전자 염기서열 정보는 다 양한 변수들(minimum alignment length, 50 bp; E-value cutoffs, 0.01)을 이용하여 Ribosomal Data Project II (RDP II) database (18)와 비교 분석하였다(ChunLab).
이론/모형
- cereus group species만을 특이 적으로 제어하는 박테리오파지이다(15,16). BCP8-2의 증식은 B. cereus reference strain인 JCM2152를 이용하였고, BCP8-2의 single plaque 분리, polyethylene glycol (PEG)을 이용한 박테리오파지의 침전, CsCl-gradient ultracentrifugation, SM buffer를 이용한 투석 및 soft agar overlay technique은 보고된 방법을 이용하였다(15,16)
성능/효과
- 16S rDNA 유전자를 기반으로 한 DGGE는 식품 및 식품 관련 생태계의 미생물군을 분석하는데 유용하게 이용되고 있다 (21). DGGE를 이용한 P1 샘플의 분석 결과 박테리오파지 처리군과 미처리군 사이에 유사한 banding pattern을 확인할 수 있었고(Fig. 4A), 또한 몇몇 밴드들에서 band intensity의 차이를 확인할 수 있었다. 이러한 banding pattern은 P1에서 P6까지 유사하게 유지되었는데 이는 계대 배양에 따른 미생물의 군집이 일정하게 유지됨을 암시한다.
- 다양한 배지 가운데 5% 콩 갈은 물(GB)이 볏짚 미생물의 증식과 박테리오파지 BCP8-2의 활성에 적합한 배지로 선정되었다. GB를 이용하여 다양한 볏짚 샘플과 BCP8-2를 함께 처리한 결과 모든 샘플들에서 총균수는 109 CFU/mL 수준으로 동일하였고, B. cereus의 경우 BCP8-2를 처리하지 않은 샘플에서 107 CFU/mL까지 증식하였고, 박테리오파지 처리군에서는 검출되지 않음을 확인하였다. 샘플에 존재하는 미생물 군집을 16S rDNA 염기서열을 바탕으로 한 DGGE와 pyrosequencing을 통해 분석한 결과 BCP8-2 처리군과 미처리군 사이에 매우 유사한 미생물 군집을 확인하였고, 더 나아가 계대 배양에 따른 미생물 군집이 안정적으로 유지됨을 확인했다.
- Pyrosequencing을 이용한 미생물 군집 분석 결과에서도 BCP8-2 처리군과 미처리군 사이의 유사한 군집을 확인할 수 있었다. 미처리군(P3)의 경우 전체 relative abundance의 91%를 Enterobacter spp.
- DGGE 분석에서는 순창군의 서로 다른 5개의 행정구역에서 수거된 볏짚 샘플 미생물을 5종류의 배지를 이용하여 배양하였고, 미생물 군집 DNA 분리 후 이를 이용해 증폭한 16S rDNA를 이용하였다. 각각의 샘플에서 서로 다른 DGGE 패턴이 확인되었는데(data not shown), 전체적으로 TA와 TSB에서 상대적으로 많은 밴드를 형성하였고 DW와 RE의 밴드수가 상대적으로 적었으며, GB는 밴드수에서 중간 정도를 나타냈다(Fig. 1A). 총 세균 수 또 한 일반적으로 TSB, TA, GB, RE, DW의 순서로 높았다(Fig.
- 본 연구에서는 DGGE의 각 밴드가 어떤 미생물인지를 확인하지 않았으므로 pyrosequencing의 결과와 직접 비교하는 것은 불가능하다. 그러나 적어도 박테리오파지 처리군과 비처리군 사이에서 DGGE banding pattern이나 pyrosequencing에서 미생물 profile이 비슷하며 이러한 결과들이 passage 증가에도 유지된다는 점은 본 연구주제에서 매우 중요한 결과라고 할 것이다.
- 순창군의 서로 다른 지역에서 수집된 8개의 볏짚 샘플들을 대상으로 연구를 진행하였다. 다양한 농도(107-109 PFU/mL)의 BCP8-2 처리와 상관없이 GB에서 배양된 8개의 볏짚 샘플들은 모두 109 CFU/mL 이상의 총 세균 수를 보였고, 이들 중 박테리오파지를 처리한 1개의 샘플에서 B. cereus가 검출되지 않음을 확인 하였다(Fig. 2). 이에 반해 박테리오파지를 처리하지 않은 샘플들 에서는 모두 약 107 CFU/mL 수준의 B.
- cereus가 제거된 스타터 컬쳐를 개발하는 것이다. 다양한 배지 가운데 5% 콩 갈은 물(GB)이 볏짚 미생물의 증식과 박테리오파지 BCP8-2의 활성에 적합한 배지로 선정되었다. GB를 이용하여 다양한 볏짚 샘플과 BCP8-2를 함께 처리한 결과 모든 샘플들에서 총균수는 109 CFU/mL 수준으로 동일하였고, B.
- 다양한 배지에서 박테리오파지 BCP8-2의 활성 분석은 BCP8-2의 host strain인 B. cereus JCM2152를 이용하였는데, DW를 제외한 4종류 배지들에서 모두 B. cereus를 효과적으로 제어할 수 있음을 확인하였다(Fig. 1C). 이 때 MgSO4가 첨가되지 않은 RE, GB, TSB의 경우 B.
- 2). 또한 PEG를 이용한 박테리오파지 침전 후 CsClgradient ultracentrifugation과 투석 처리를 거친 BCP8-2는 PEG 침전 후 이용된 BCP8-2와 B. cereus 제어에서 차이를 보이지 않았다(data not shown).
- 볏짚 유래 스타터 컬쳐에 사용할 최소 박테리오파지 농도를 결정하기 위해, 다양한 농도(107-109 PFU/mL)의 BCP8-2에 의한 B. cereus 제어능 시험을 MgSO4 가 첨가된 GB에서 실시하였는데, 가장 낮은 농도(107 PFU/mL)에서도 높은 제어능을 확인할 수 있었다(Fig. 1D). 이러한 결과는 GB를 이용한 볏짚 시험에서도 확인 되었다(Fig.
- 그럼에도 불구하고 Hong 등(3)은 볏짚과 이를 이용하여 생산된 청국장의 미생물 군집이 매우 유사하다는 결과를 DGGE를 이용하여 보고하였다. 본 연구에서는 DGGE의 각 밴드가 어떤 미생물인지를 확인하지 않았으므로 pyrosequencing의 결과와 직접 비교하는 것은 불가능하다. 그러나 적어도 박테리오파지 처리군과 비처리군 사이에서 DGGE banding pattern이나 pyrosequencing에서 미생물 profile이 비슷하며 이러한 결과들이 passage 증가에도 유지된다는 점은 본 연구주제에서 매우 중요한 결과라고 할 것이다.
- cereus의 경우 BCP8-2를 처리하지 않은 샘플에서 107 CFU/mL까지 증식하였고, 박테리오파지 처리군에서는 검출되지 않음을 확인하였다. 샘플에 존재하는 미생물 군집을 16S rDNA 염기서열을 바탕으로 한 DGGE와 pyrosequencing을 통해 분석한 결과 BCP8-2 처리군과 미처리군 사이에 매우 유사한 미생물 군집을 확인하였고, 더 나아가 계대 배양에 따른 미생물 군집이 안정적으로 유지됨을 확인했다. 이러한 결과들은 볏짚 등에서 특정 박테리오파지를 이용하여 특정 유해균을 제거한 컬쳐의 개발이 가능함을 보여주는 것이고, 안전한 전통장류의 생산에 기여할 것이다.
- cereus가 검출되었다(data not shown). 연구의 재연성을 확보하기 위해 같은 논에서 수거한 볏짚 샘플을 2반복 이상으로 실시하였는데 1개의 볏짚 샘플에서만 반복적으로 B. cereus가 제거된 스타터 컬쳐를 제작할 수 있었다. 이러한 결과들은 볏짚들이 매우 높은 빈도로 B.
- 1C), 이는 BCP8-2의 활성이 divalent cation에 의존한다 는 이전의 연구 결과와 일치한다(15). 이러한 결과들과 더불어 준비된 볏짚 유래 미생물이 증식한 culture와 이를 이용한 청국장 제조 후 이에 대한 약식 관능평가에서는 GB가 가장 좋은 것으로 확인되어(data not shown) 이 후 모든 연구에서 MgSO4가 첨가된 GB를 사용하였다.
- cereus가 제거된 스타터 컬쳐를 제작할 수 있었다. 이러한 결과들은 볏짚들이 매우 높은 빈도로 B. cereus에 오염되어 있음을 확인한 결과이며, 또한 박테리오파지를 이용하여 유해균만을 특이적으로 제어하는 것이 가능함을 보여준다.
- 2). 이에 반해 박테리오파지를 처리하지 않은 샘플들 에서는 모두 약 107 CFU/mL 수준의 B. cereus가 검출되었고(Fig. 2), 박테리오파지를 처리한 나머지 7개 샘플에서도 같은 수준의 B. cereus가 검출되었다(data not shown). 연구의 재연성을 확보하기 위해 같은 논에서 수거한 볏짚 샘플을 2반복 이상으로 실시하였는데 1개의 볏짚 샘플에서만 반복적으로 B.
- 1A). 총 세균 수 또 한 일반적으로 TSB, TA, GB, RE, DW의 순서로 높았다(Fig. 1B). 이러한 결과들은 모든 5개의 볏짚 샘플들에서 비슷하였는데 (data not shown) 이는 각 배지들의 영양성분 조성 및 농도 등에 기인한 것으로 사료된다.
- 3B). 현재 실험실에서는 BCP8-2를 처리한 스타터 컬쳐를 이용한 다양한 장류를 개발하고 이들 제품의 기능성을 포함한 특성분석을 진행하고 있는데, 청국장을 이용한 예비 결과들에 의하면 볏짚 청국장과 유사한 관능적 특성을 확인할 수 있었다(data not shown).
후속연구
- cereus를 선택적으로 제거한 스타터 컬쳐를 개발하고 이의 특성을 분석하고자 한다. 본 연구의 성공은 안전하고 전통장류 고유의 특성을 유지한 전통장류제품의 개발에 기여할 것으로 사료된다.
- 샘플에 존재하는 미생물 군집을 16S rDNA 염기서열을 바탕으로 한 DGGE와 pyrosequencing을 통해 분석한 결과 BCP8-2 처리군과 미처리군 사이에 매우 유사한 미생물 군집을 확인하였고, 더 나아가 계대 배양에 따른 미생물 군집이 안정적으로 유지됨을 확인했다. 이러한 결과들은 볏짚 등에서 특정 박테리오파지를 이용하여 특정 유해균을 제거한 컬쳐의 개발이 가능함을 보여주는 것이고, 안전한 전통장류의 생산에 기여할 것이다.
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