[논문]호장근(虎杖根)의 파골세포 분화 억제 효과와 기전 연구

장희재; 황덕상; 이진무; 이창훈; 이경섭; 장준복

doi:10.15204/jkobgy2014.27.1.017

[국내논문] 호장근(虎杖根)의 파골세포 분화 억제 효과와 기전 연구
Osteoclast Differentiation of Polygoni Cuspidati Radix Extracts Effects and Mechanism of Inhibition Studies 원문보기

大韓韓方婦人科學會誌 = The Journal of Korean obstetrics & gynecology, v.27 no.1, 2014년, pp.17 - 27

장희재 (경희대학교 한의과대학 부인과교실) , 황덕상 (경희대학교 한의과대학 부인과교실) , 이진무 (경희대학교 한의과대학 부인과교실) , 이창훈 (경희대학교 한의과대학 부인과교실) , 이경섭 (경희대학교 한의과대학 부인과교실) , 장준복 (경희대학교 한의과대학 부인과교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: This study was conducted to evaluate the inhibitory effect of polygoni cuspidati radix (PCR) extract on osteoclast differentiation. Methods: MTT-assay was performed to estimate cytotoxicity of PCR extract in BMMs stimulated with RANKL. Tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining, TRAP activity and RT-PCR were performed to know the inhibitory effect on osteoclast differentiation. actin ring formation were analysed to observe the effect of PCR extract. Results: PCR decreased the number of TRAP positive cells and TRAP activities in BMMs stimulated with RANKL and M-CSF. PCR restrained the formation of actin ring. PCR down regulated the induction of NFATc1, c-Fos, TRAP and OSCAR by RANKL. PCR inhibited NF-${\kappa}B$ activity by inducing degradation of $I{\kappa}B{\alpha}$. Conclusions: We suggest that PCR Extracts can be an effective therapeutic agent on osteoclast differentiation caused by diseases such as osteoporosis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이에 저자는 虎杖根 추출물이 파골세포 분화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위해 tartrate resistant acid phosphatase(TRAP) 활성과 정량적 평가, actin ring 형성, 파골세포 활성 유전자 및 신호 통로 발현 등을 연구하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
이에 저자는 虎杖根 추출물이 파골세포 분화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위해 농도별 세포독성 여부를 확인한 후 TRAP 활성과 정량적 평가, actin ring 형성 및 파골세포 활성 유전자와 신호통로 발현 등의 실험연구를 시행하였다.

가설 설정

A : Gene expression levels of each genes are measu red by Real-time PCR.
B) TRAP positive cells were counted as osteoclasts.
C) TRAP activity are expressed as the percentage relative to control group.

제안 방법

단백질을 정량하고, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis를 수행한 후, semi-dry transfer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 membrane에 단백질을 이동하였다. 5% skim milk(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 처리하여 비특이 단백질이 붙는 것을 방지한 후 단백질 각 사이즈 별로 항체를 처리하였다. 항체들을 차례로 반응시키고 ECL kit(Amersham Biosciences, NJ, USA)를 사용하여 chemiluminescence로 확인하였다.
7% formaldehyde에 10분간 고정하고 PBS로 세척 후 rhodamin-conjugated phalloidin을 처리하여 30분간 배양하였다. Actin ring 형성은 형광현미경 Olympus IX71-F32PH(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다.
BMMs를 48-well plate에 2×104cells/well로 분주하고 RANKL 100 ng/ml와 M-CSF 30 ng/ml로 처리한 배지에 虎杖根 추출물 1, 10 및 30 μg/ml를 첨가하고 배양하였다.
BMMs를 48-well plate에 2×104cells/well로 분주하고 RANKL 100 ng/ml와 M-CSF 30 ng/ml를 처리하고 동시에 虎杖根 추출물 1, 10 및 30 μg/ml를 첨가하여 파골 세포 분화를 5일간 유도시켰다.
BMMs를 48well plate에 2×104cells/well로 그룹별로 3개씩 분주하고 RANKL 100ng/ml와 M-CSF 30 ng/ml를 5일 동안 함께 배양 후 각각 3개의 well을 함께 수집하여 RNA RNeasy kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 cell에서 총 RNA를 분리하였다.
BMMs를 96-well plate에 1×104cells/well로 분주하고 M-CSF 30 ng/ml를 처리한 후 虎杖根 추출물 1, 10, 30 및 50 μg/ml를 첨가하여 24시간 및 48시간 배양하였다.
虎杖根 추출물의 파골세포 분화 억제효과와 기전을 알아보기 위해 TRAP 활성과 정량적 평가, actin ring 형성, 파골세포 활성 유전자와 신호 통로 발현 등을 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
Primer의 염기서열은 TRAP[(sense) 5’- CTG GAG TGC ACG ATG CCA GCG ACA -3’, (antisense) 5’- TCC GTG CTC GGC GAT GGA CCA GA -3’, OSCAR [(sense) 5'- CTG CTG GTA ACG GAT CAG CTC CCC AGA -3', (antisense) 5'- CCA AGG AGC CAG AAC CTT CGA AAC T -3', NFATc1 [(sense) 5’- CTC GAA AGA CAG CAC TGG AGC AT -3’, (antisense) 5'- CGG CTG CCT TCC GTC TCA TAG -3'], c-FOS [(sense) 5'- CTG GTG CAG CCC ACT CTG GTC -3', (antisense) 5'- CTT TCA GCA GAT TGG CAA TCT C -3'], GAPDH [(sense) 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TAC CC -3', (antisense) 5'-CCT CAG TGT AGC CCA AGA TGC CCT -3']이다. 각각의 annealing 온도는 TRAP 66℃, OSCAR 60.4℃, NFATc1 58.3℃, c-FOS 57℃이며 모두 시간은 30초로 시행하였으며, extension 온도는 모두 72℃에 30초로 이 사이클을 45회 반복시켰다. 결과로 나온 각각의 cycle threshold(CT)값을 GAPDH의 CT값과 비교하여 상대 비교 방법으로 계산하여 그래프를 그렸으며 RT-PCR에 사용된 기계는 iCycler mini opticon system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하였다.
cells/well로 분주하고 1일간 배양하였다. 그 후 RANKL를 처리하고 30분 동안 시간별로 파골세포 배양액을 걷어내고 DPBS로 세척 후 세포를 획득하였다. 그 후 lysis buffer를 첨가하여 30분간 유지하고 13,000 rpm으로 4℃에서 원심분리를 하여 상층액을 사용하였다.
3일 후 배양액을 교환하고 추가로 2일 더 배양하였다. 부착세포를 DPBS로 2회 세척한 후 3.7% formaldehyde에 10분간 고정하고 PBS로 세척 후 0.1% TritonX-100으로 용해시킨 후 TRAP 용액으로 염색하여 보라색의 TRAP positive cell을 파골세포로 인정하였다. 염색된 파골세포 중 핵이 3개 이상인 세포의 개수를 현미경에서 직접 관찰하였다.
1% TritonX-100으로 용해시킨 후 TRAP 용액으로 염색하여 보라색의 TRAP positive cell을 파골세포로 인정하였다. 염색된 파골세포 중 핵이 3개 이상인 세포의 개수를 현미경에서 직접 관찰하였다.
합성된 cDNA를 iQ SYBR Green supermix(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 중합효소연쇄반응에 사용된 primer는 파골세포 분화의 지표로 사용된 TRAP, OSCAR, NFATc1, c-FOS이고 control 유전자인 GAPDH와 비교하여 그 상대적 양을 비교하였다. Primer의 염기서열은 TRAP[(sense) 5’- CTG GAG TGC ACG ATG CCA GCG ACA -3’, (antisense) 5’- TCC GTG CTC GGC GAT GGA CCA GA -3’, OSCAR [(sense) 5'- CTG CTG GTA ACG GAT CAG CTC CCC AGA -3', (antisense) 5'- CCA AGG AGC CAG AAC CTT CGA AAC T -3', NFATc1 [(sense) 5’- CTC GAA AGA CAG CAC TGG AGC AT -3’, (antisense) 5'- CGG CTG CCT TCC GTC TCA TAG -3'], c-FOS [(sense) 5'- CTG GTG CAG CCC ACT CTG GTC -3', (antisense) 5'- CTT TCA GCA GAT TGG CAA TCT C -3'], GAPDH [(sense) 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TAC CC -3', (antisense) 5'-CCT CAG TGT AGC CCA AGA TGC CCT -3']이다.
채취한 골수세포에서 적혈구를 제거한 후 FBS과 M-CSF 30 ng/ml를 첨가한 α-MEM배지에서 5% CO2, 95% 습도 및 37℃를 유지하면서 3일간 배양하였다.
추출한 RNA의 1 μg을 oligo-dT(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 cDNA로 합성하였다.
하지만 24시간 및 48시간 배양한 군에서 虎杖根 50 μg/ml 첨가한 군의 살아 남은 세포 수가 虎杖根 1, 10 및 30 μg/ml 첨가한 군에 비하여 감소하여 虎杖根 50 μg/ml를 첨가한 군을 배제하였다.
추출한 RNA의 1 μg을 oligo-dT(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 iQ SYBR Green supermix(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 중합효소연쇄반응에 사용된 primer는 파골세포 분화의 지표로 사용된 TRAP, OSCAR, NFATc1, c-FOS이고 control 유전자인 GAPDH와 비교하여 그 상대적 양을 비교하였다.
5% skim milk(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 처리하여 비특이 단백질이 붙는 것을 방지한 후 단백질 각 사이즈 별로 항체를 처리하였다. 항체들을 차례로 반응시키고 ECL kit(Amersham Biosciences, NJ, USA)를 사용하여 chemiluminescence로 확인하였다. 실험에 사용한 항체는 p-IkBα, β-actin에 대한 항체를 사용하였다.

대상 데이터

Α-minimum essential medium(αMEM), 10% fetal bovine serum(FBS), antibiotic, Dulbecco’s posphate-buffered saline(DPBS)은 Gibco사(Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며 1% Triton X-100는 Sigma Chemical사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
6주령의 수컷 ICR 생쥐를 희생시킨 후 antibiotic을 첨가한 α-MEM을 1 cc 주사기에 충전하여 경골 및 대퇴골에서 골수를 채취하였다.
Human receptor activator of NF-κB ligand(RANKL)과 human macropgasecolony stimulating factor(M-CSF)는 Peprotech사(London, UK)에서 구입하였다.
Phospho-IkBα에 대한 항체는 Cell Signaling Technology사(Beverly, MA, USA)의 제품을 사용하였다.
TRAP staining solution은 Sigma Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
虎杖根은 한국식물추출물은행의 제품을 구매하여 DMSO에 녹인 후 0.22 μm 필터(Millopore Carrigtwohill, Ireland)에 여과하여 4℃에 보관하였으며 용액제조 후 15일 이내에 사용하였다.
또한 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate(DCFH), rhodamin-conjugated phalloidin은 Molecular Probes(Eugene, OR, USA)에서 제품을 구입하였다.
채취한 골수세포에서 적혈구를 제거한 후 FBS과 M-CSF 30 ng/ml를 첨가한 α-MEM배지에서 5% CO2, 95% 습도 및 37℃를 유지하면서 3일간 배양하였다. 배양 후 부착된 세포를 파골전구세포로서의 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)로 사용하였다.
실험에 사용한 항체는 p-IkBα, β-actin에 대한 항체를 사용하였다.

데이터처리

실험군과 대조군의 비교는 student's T-test를 분석하였고, p<0.05 이하인 경우를 통계적으로 유의한 차이가 있다고 판정하였다.

이론/모형

3℃, c-FOS 57℃이며 모두 시간은 30초로 시행하였으며, extension 온도는 모두 72℃에 30초로 이 사이클을 45회 반복시켰다. 결과로 나온 각각의 cycle threshold(CT)값을 GAPDH의 CT값과 비교하여 상대 비교 방법으로 계산하여 그래프를 그렸으며 RT-PCR에 사용된 기계는 iCycler mini opticon system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하였다.

성능/효과

1. TRAP positive cell과 TRAP activity는 虎杖根 추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소하였다.
2. Actin ring 형성은 虎杖根 추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 억제되었다.
3. NFATc1, c-FOS, TRAP 및 OSCAR등의 파골세포 활성유전자는 虎杖根 추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 억제되었다.
4. NF-κB의 주 신호인 인산화된 IkBα의 신호 강도는 虎杖根 추출물 50 μg/ml 첨가군에서 약하게 나타났다.
Actin ring 형성은 虎杖根 추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 3).
BMMs에 M-CSF 30 ng/ml를 처리한 후 虎杖根 추출물 1, 10, 30 및 50 μg/ml를 첨가하여 배양한 후 세포 독성을 관찰한 결과 24시간 배양 시 세포 독성은 나타나지 않았지만 48시간 배양 시 모든 군에서 경미하게 나타났다.
BMMs에 虎杖根 추출물 1, 10, 30 및 50 μg/ml를 첨가하여 배양한 후 세포독성을 관찰한 결과 24시간 배양 시 모든군에서 세포 독성은 나타나지 않았지만 48시간 배양 시 모든 군에서 경미하게 나타났다.
BMMs에 虎杖根 추출물을 처리하여 주요 신호 전달 경로인 IkBα 발현을 Western blot으로 확인한 결과, 虎杖根 추출물을 처리한 군에서 인산화된 IkBα의 신호 강도가 대조군에 비해 감소한 것을 확인하였다.
TRAP activity를 측정한 결과 대조군은 100±5.53%이었고 虎杖根 추출물 1 μg/ml에서 64.71±5.12(p<0.05), 10 μg/ml에서 34.01±4.07%(p<0.01) 및 30 μg/ml에서 11.34±0.58%(p<0.01)로 나타나 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 2C).
TRAP 염색 후 TRAP positive cell 수를 측정한 결과 대조군은 135.3±14.18개이었고 1 μg/ml에서 95.33±2.30개(p<0.05), 10 μg/ml에서 56.33±5.50개(p<0.01) 및 30 μg/ml에서 5.66±1.52개(p<0.01)로 나타나 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 2B).
TRAP 염색 후 TRAP positive cell를 현미경으로 관찰한 결과 虎杖根 추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 2A).
虎杖根 추출물의 파골세포 분화 억제효과를 확인하기 위해 TRAP positive cell을 염색하여 관찰한 결과, 모든 虎杖根 추출물을 처리한 군에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 TRAP positive cell수 및 activity가 감소하였다.
虎杖根 추출물을 처리한 실험군에서는 c-FOS, NFATc1의 발현을 농도 의존적으로 억제하였고 따라서 TRAP과 OSCAR의 발현도 농도의 의존적으로 억제하였다. 따라서 파골세포의 분화에 있어서 필수적 유전자를 억제함으로써 파골세포의 분화 단백질을 방해하여 파골세포 분화를 억제함을 관찰하였다.
이는 NF-κB 신호 활성의 억제와 c-FOS, NFATc1 유전자 발현의 억제가 이루어짐으로 TRAP, OSCAR 발현이 감소됨을 이 실험을 통하여 확인할 수 있었다.
이상의 연구결과를 종합해 보면 虎杖根 추출물은 RANKL로 유도된 파골세포의 분화에 특이적인 단백질 TRAP 및 골 흡수를 위한 파골 세포의 actin ring형성을 농도 의존적으로 억제하였다. 이는 NF-κB 신호 활성의 억제와 c-FOS, NFATc1 유전자 발현의 억제가 이루어짐으로 TRAP, OSCAR 발현이 감소됨을 이 실험을 통하여 확인할 수 있었다.
파골세포에 있어 actin ring의 형성은 세포가 뼈를 흡수할 수 있는 능력에 대한 중요한 표지가 되며 골다공증 치료에 actin ring의 형성을 방해하여 골 흡수를 저하시키는 약물³²⁾이 유용할 수 있다. 파골세포 분화 시 虎杖根 추출물을 농도별로 처리하여 actin ring 형성을 관찰한 결과 actin ring 형성이 대조군에 비해 농도 의존적으로 억제되는 것을 알 수 있었다.
파골세포 분화 시 지표로 사용되는 NFATc1, c-FOS, TRAP, OSCAR의 RT-PCR 결과 虎杖根 추출물 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 30 μg/ml에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 4A).
파골세포 분화의 대표적인 신호통로인 NF-κB에 대해서 Western blot으로 확인한 결과, 인산화된 IkBα 신호 강도는 虎杖根 추출물 30 μg/ml 첨가군에서 약하게 나타났다(Fig. 4B).

후속연구

이는 虎杖根 추출물이 골다공증과 같은 파골세포의 분화로 야기되는 질환에 효과적인 치료제가 될 수 있음을 시사한다. 향후 다른 약재와 配俉될 때 파골 세포 억제에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	한의학에서 골다공증의 특징은 무엇인가?	한의학에서 골다공증은 骨痿, 骨枯, 骨痺 및 骨痛 등의 범주에 속하고 腎의 盛衰와 骨의 代謝가 밀접한 관계가 있다고 보아5) 補腎,將筋骨, 生血하는 약재를 이용한 연구가 많이 보고6-8)되고 있지만關節痺痛과 跌樸損傷 등 관절 손상과 관련된 通經, 淸熱 , 化濕, 活血하는 紅花子 ,黃芩, 木瓜, 乳香 등9-12) 다양한 약제에 대한 효능 연구가 진행되고 있다.
	평균 수명이 연장됨에 따라 주요 문제로 대두되는 것은 무엇인가?	현대에는 평균 수명이 연장됨에 따라 노인 질환의 관리가 중요 문제로 대두되고 있다1). 우리나라 65세 이상 노인의 주요 만성질환 중 골다공증은 18.
	골다공증이 남성보다 여성에게 많이 발병하는 이유는 무엇인가?	6%에 해당한다2). 폐경기 이후 에스트로겐의 감소로 여성에서 호발하는 골다 공증은 골밀도가 감소하여 통증 및 골절이 초래된다3).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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