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문제 정의
- 이와 같이 기능성 소재활용에 관한 연구를 통해 쇠비름의 우수성이 밝혀져 왔으나 쇠비름의 소비 확대는 크게 진전되지 않고 있으며 추출방법에 따른 항산화 및 생리활성에 관한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 쇠비름의 이용가치를 향상시키기 위하여 추출방법에 따른 항산화 및 생리활성을 조사함으로써 효과적인 추출방법을 제시하고, 산업화에 적용할 방법을 모색 및 기능성 소재로서의 개발 가능성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- Ellman 등의 방법(21)과 Sandahl과 Jenkins 방법(22)을 변형하여 측정하였다. AChE와 acetylthocholine iodine (ATC)은 100 mM phosphate buffer(pH 8.0)에 녹여 각각 0.25 U/mL와 75 mM을 제조하였으며, 발색시약은 39.6 mg의 DTNB[5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)]와 15mg의 sodium bicarbonate를 100 mM phosphate buffer(pH 8.0) 10 mL에 녹여 제조하였다. 추출물 30 μL에 phosphate buffer(100 mM, pH 8.
- Ellman 등의 방법(21)과 Sandahl과 Jenkins 방법(22)을 변형하여 측정하였다. AChE와 acetylthocholine iodine (ATC)은 100 mM phosphate buffer(pH 8.
- 추출 분말의 색도는 표준백색판으로 보정된 chromameter(CR-300 Minolta, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. Hunter scale에 의한 L(lightness), a(rednessgreenness), b(yellowness-blueness), Ho(hue angle) 및 chroma value를 측정하였다.
- TLC에 의한 AChE의 저해활성 효과는 Yang 등(23)의 방법을 참고하여 측정하였으며, 효소액은 acetylcholinesterase(E.C. 3.1.1.7, Sigma product No. C3389, Sigma-Aldrich Co.) 1,000 Unit을 50 mM tris-hydrochloric acid buffer(pH 7.8) 150mL에 녹인 다음 효소의 안정화를 위해 150 mg bovine serum albumin을 첨가하여 4°C를 유지하도록 하였다.
- TLC에 의한 정성분석은 추출물 동결건조 분말을 80% 메탄올에 녹여 0.45 μm syringe filter(Whatman, Rockland, MA, USA)로 여과 후 TLC 분석을 위한 시료로 사용하였으며, 각각의 시료는 silica plate(aluminum sheet silica gel 60 F254, Merck, Darmstadt, Germany)에 점적한 후 tol- uene/acetone/formic acid(6:6:1, v/v/v)의 혼합용매로 전개하였다.
- 가압가열추출은 autoclave(DF-100A, DOORI Scientific Co., Gyeonggi, Korea)를 이용하여 121°C에서 15분 동안 추출하였으며 저온고압추출은 rapid extractor(FT110, Benchtop rapid extractor, Armfield Ltd., Hampshire, UK)를 이용하여 실온에서 1시간 동안 8.0 bar의 압력 하에서 2회 반복 추출하였다.
- 다음 1-naphthyl acetate(1.5 mg/mL)를 분사하고 37°C에서 20분간 반응시킨 후 0.05% Fast Blue B Salt를 분사하여 발색시키고 밴드를 확인하였다.
- 다음 37° C에서 15분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응을 종결시킨 후, 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 292 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, xanthine oxidase inhibitory activity(%)=100－[(O.D of sample/ O.D of control)×100]에 의하여 산출하였다.
- 다음에 3 mM ρNPG(ρ-nitrophenyl α-Dglucopyranoside) 100 μL를 첨가하여 37° C에서 10분간 반응시킨 후 0.1 M Na2CO3 0.75 mL로 반응을 정지시켜 405nm에서 흡광도를 측정하였으며, 저해활성은 α-glucosidase inhibitory activity(%)=[1－(CAbs－SAbs)/ (CAbs－ BAbs)]×100: “CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도, BAbs:시료 무첨가구의 흡광도”에 의하여 산출하였다.
- 대조구는 Griess reagent 대신 증류수를 사용하였으며 계산식, nitrite scavenging activity(%)=100－[(O.D of sample/ O.D of control)×100]에 의하여 산출하였다.
- 대조구로서는 추출물 대신 100 mM phosphate buffer(pH 8.0) 30 μL를 가하여 측정하였으며, 저해활성은 계산식, acetylcholinesterase inhibitory activity(%)=[1－(CAbs－SAbs)/ (CAbs－BAbs)]×100, “CAbs: 대조구 흡광도, SAbs: 시료 흡광도, BAbs: 시료 무첨가구의 흡광도”에 의하여 산출하였다.
- 쇠비름의 추출방법은 분쇄시료 50 g에 10배의 70% 에탄올을 가한 후 환류냉각추출(reflux extraction, RE), 가압가열추출(autoclave extraction, AE), 저온고압추출(low temperature high pressure extraction, LTPE) 방법으로 추출물을 제조하였다. 환류냉각추출은 분쇄시료와 용매를 넣은 용기에 냉각관을 부착하여 80°C의 맨틀 상에서 3시간씩 3회 반복 추출하였다.
- 쇠비름의 활용 및 생리활성을 증가시킬 수 있는 적정 추출방법을 알아보고자 환류냉각, 가압가열 및 저온고압 추출법을 이용하여 추출한 쇠비름 70% 에탄올 추출물의 생리활성을 비교하였다. 추출수율은 환류냉각추출, 가압가열추출, 저온 고압추출 순으로 높은 수율을 나타내었다.
- 추출 분말의 색도는 표준백색판으로 보정된 chromameter(CR-300 Minolta, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. Hunter scale에 의한 L(lightness), a(rednessgreenness), b(yellowness-blueness), Ho(hue angle) 및 chroma value를 측정하였다.
- , Tokyo, Japan)로 여과한 다음 rotary vacuum evaporator(rotary vacuum evaporator N-N series, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축한 후에 동결건조(freeze dryer, FD SFDSM12, Samwon) 하여 분말 시료를 제조하였으며 -50° C에 보관하면서 실험에 사용하였다. 추출물 각각의 수율은 추출액을 동결건조 시켜 건물 중량을 구한 다음 추출액 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.
- 표준품(chlorogenic acid, rutin, tannin, β-carotene; Sigma-Aldrich Co.)으로 정성분석 하였으며, 성분 확인은 각 성분들의 Rf값과 자외선(UV-254 nm, UV-366 nm)을 이용한 띠의 색상으로 확인하였다.
- 환류냉각추출은 분쇄시료와 용매를 넣은 용기에 냉각관을 부착하여 80°C의 맨틀 상에서 3시간씩 3회 반복 추출하였다.
- 희석된 용액 950 μL에 추출물 50μL를 가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, ABTS radical scavenging ability(%)=100－[(O.D of sample/ O.D of control)×100]에 의하여 활성을 산출하였다.
대상 데이터
- 각각의 추출물은 Whatman No. 1 여과지(Toyo Ltd., Tokyo, Japan)로 여과한 다음 rotary vacuum evaporator(rotary vacuum evaporator N-N series, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축한 후에 동결건조(freeze dryer, FD SFDSM12, Samwon) 하여 분말 시료를 제조하였으며 -50° C에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 대조구는 대표적 chelating agent인 ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 사용하였으며 계산식, ferrous ion chelating effect(%)=100－[(O.D of sample/ O.D of control)×100] 에 의하여 산출하였다.
- 본 연구에서 사용한 쇠비름(Portulaca oleracea) 잎은 2012년 전북 남원시에서 수확한 것을 구입하였으며 세척한 후 동결건조(freeze dryer, FD SFDSM12, Samwon, Seoul, Korea) 한 다음 분쇄기(IKA® A11 basic, IKA® Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany)를 사용하여 40 mesh로 분쇄한 분말을 -50°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 유의성 검증은 version 12의 SPSS(12, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software를 이용하여 Duncan's multiple range test를 행하였다.
이론/모형
- Blois(14)의 방법에 따라 시료 0.2 mL에 0.4 mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)용액 0.8 mL를 가하여 10분간 방치한 다음 525 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, DPPH radical scavenging ability(%)=100－[(O.D of sample/ O.D of control)×100]에 의하여 활성도를 산출하였다.
- Kim 등(19)의 방법에 따라 시료 50 μL, 1 uint/mL αglucosidase 0.05 mL와 200 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 50 μL를 잘 혼합하여 37° C에서 10분간 전처리 하였다.
- 2. Screening of 70% ethanol extracts of Portulaca oleracea with different extraction methods using TLC assay method. The concentrations of 10 mg/mL samples were loaded on the TLC plate, and developed in toluene/acetone/formic acid (6:6:1, v/v/v).
- Vanillin-sulfuric acid법(13)에 따라 시료 200 μL에 1.2% vanillin 용액 500 μL와 20% sulfuric acid 500 μL를 혼합하여 20분간 방치한 후 500nm에서 흡광도를 측정하였으며 (+)-catechin(Sigma Aldrich Co.)의 검량선에 의하여 함량을 산출하였다.
- 폴리페놀 함량은 Dewanto 등(11)의 방법에 따라 추출물 100 μL에 2% sodium carbonate 2 mL와 50% Folin Ciocalteu reagent 100 μL를 가한 후 720 nm에서 흡광도를 측정하였으며 gallic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)의 검량선에 의하여 함량을 산출하였다.
- 플라보노이드 함량은 Abdel-Hameed(12)의 방법에 따라 추출물 100 mL에 5% sodium nitrite 0.15 mL를 가한 후 25°C에서 6분간 방치한 다음 10% aluminium chloride 0.3 mL를 가하여 25°C에서 5분간 방치하였다.
성능/효과
- 5 mg/mL 농도에서 α-glucosidase 저해활성은 RE, AE 및 LTPE가 각각 48.90%, 18.23% 및 46.04%로 환류냉각 및 저온고압추출에서 가장 높은 반면 가압가열추출에서는 낮은 활성을 나타내었다.
- 따라서 XO 저해활성은 free radical의 생성을 억제하므로 항산화, 항노화 및 항암 등의 효과를 기대할 수 있는 생물학적 중요한 효소라고 할 수 있다. 5 mg/mL 농도에서 XO 저해활성은 RE, AE 및 LTPE가 각각 71.81%, 77.87% 및 84.52%로 저온고압추출에서 가장 높은 활성을 나타내었으며 저온고압의 경우 대조구(86.45%)에 근접하는 저해활성을 나타내었다.
- 추출방법을 달리한 쇠비름의 전자공여능, 환원력 및 ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 500 mg%에서의 RE, AE 및 LTPE의 전자공여 활성은 각각 83.84%, 80.67% 및 88.87%로 저온고압추출이 환류냉각 및 가압가열추출에 비해 유의적으로 높은 활성을 나타내었다. 한편 양성 대조군으로 합성 산화방지제인 BHT(butylated hydroxytoluene, 95.
- RE, AE 및 LTPE 각각의 추출물에서 수종의 미세한 spot이 확인되었으며 각각의 표준품 chlorogenic acid(Rf 0.07), rutin(Rf 0.04), tannin(Rf 0.02), β-carotene(Rf 0.88)과 비교하여 동일한 위치에서 band가 확인되었다.
- 의 chelating 효과를 조사한 결과는 Table 4와 같다. RE, AE 및 LTPE의 아질산염 소거활성은 각각 35.67%, 33.48% 및 40.33%로 저온고압추출, 환류냉각추출, 가압가열추출 순으로 높은 활성을 나타내었으며, 모든 추출군이 대조군 BHT(32.12%)보다 높은 활성을 나타내어 향후 기능성 소재로서의 개발 가능성이 있을 것으로 여겨진다. Takashi 등(32)의 보고에 따르면 폴리페놀과 플라보노이드 화합물은 종류에 따라 차이는 있으나 phenol계 유도체들이 nitroso화합물의 생성을 억제한다고 하여 본 연구에서 추출방법에 따른 소거 활성의 차이는 페놀화합물의 함량 차이에 의한 결과라 판단되며, 저온고압추출의 경우 위장내의 낮은 pH 조건에서 nitrosamine 형성을 보다 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 여겨진다.
- 추출방법을 달리한 쇠비름의 폴리페놀, 플라보노이드 및 프로안토시아니딘의 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. RE, AE 및 LTPE의 폴리페놀 함량은 g당 18.62 mg, 17.11mg 및 22.16 mg으로 저온고압추출의 경우 환류냉각 및 가압가열추출에 비해 각각 19.01% 및 29.51% 높은 함량을 나타내었다. 이는 고압 하에서 막 투과성이 증가함에 따라 폴리페놀 화합물의 용출이 용이해짐에 따른 결과로 사료된다.
- Osawa(31)는 식물로부터 추출된 phenol 부류의 화합물은 항산화능을 포함한 다양한 생리적 효능을 나타내고 이 효능은 주로 산화･환원력에 의한 효과로 보고한 바 있으며, 페놀 함량이 높을수록 항산화능이 증가한다고 보고하였는데 이는 본 연구와 비슷한 결과를 나타내었다. 따라서 LTPE의 환원력이 높은 결과는 쇠비름 추출물에 함유된 페놀화합물에 의한 것이라고 사료된다.
- 추출수율은 환류냉각추출, 가압가열추출, 저온 고압추출 순으로 높은 수율을 나타내었다. 색도에서는 저온 고압추출에서 명도와 황색도가 높았고, 채도의 경우 가압가열 및 저온고압추출에서 높았다. 폴리페놀 및 프로안토시아니딘 함량은 저온고압추출이 환류냉각 및 가압가열추출에 비해 높은 함량을 나타내었으며, 플라보노이드 함량은 가압가열추출에서 높은 함량을 나타내었다.
- 신경세포가 손상된 치매 환자의 경우 생성되는 ACh의 양은 적고 AChE의 작용은 계속되어 신경전달에 이상이 생기게 되면서 결국 치매 환자는 학습능력 및 기억력 감퇴와 인지력 저하 등의 같은 병리 현상이 발생한다(34). 쇠비름 추출물의 AChE 저해활성은 5 mg/mL 농도에서 RE, AE 및 LTPE가 각각 22.19%, 24.79% 및 31.03%로 저온고압추출에서 가장 높았고 다음으로 가압가열추출, 환류냉각추출 순의 저해 활성을 나타내었으나 저해제인 tacrine(87.17%)에 비해서는 전반적으로 낮은 활성을 보였다. 반면 쇠비름 추출물의 경우 단일 성분이 아닌 추출물인 점으로 볼 때 치매 예방 및 개선제로서의 가능성도 기대된다.
- 수율은 RE(reflux extraction), AE(autoclave extraction) 및 LTPE(low temperature high pressure ex- traction)가 각각 33.78%, 30.80% 및 11.05%로 추출방법에 따라 유의적인 차이를 나타내었으며, RE>AE>LTPE 순으로 높은 수율을 나타내었다.
- 45% 높은 함량을 나타내었다. 이상의 결과 추출방법에 따른 페놀화합물 함량의 유의적인 차이를 나타내었으며 저온고압추출 시 페놀화합물 등의 유용성분의 추출함량 증대에 좋은 영향을 미칠 수 있을 것으로 판단된다.
- 쇠비름의 활용 및 생리활성을 증가시킬 수 있는 적정 추출방법을 알아보고자 환류냉각, 가압가열 및 저온고압 추출법을 이용하여 추출한 쇠비름 70% 에탄올 추출물의 생리활성을 비교하였다. 추출수율은 환류냉각추출, 가압가열추출, 저온 고압추출 순으로 높은 수율을 나타내었다. 색도에서는 저온 고압추출에서 명도와 황색도가 높았고, 채도의 경우 가압가열 및 저온고압추출에서 높았다.
- 색도에서는 저온 고압추출에서 명도와 황색도가 높았고, 채도의 경우 가압가열 및 저온고압추출에서 높았다. 폴리페놀 및 프로안토시아니딘 함량은 저온고압추출이 환류냉각 및 가압가열추출에 비해 높은 함량을 나타내었으며, 플라보노이드 함량은 가압가열추출에서 높은 함량을 나타내었다. 항산화 활성은 저온 고압추출이 환류냉각 및 가압가열 추출에 비해 유의적으로 높은 활성을 나타낸 반면 철 이온에 대한 제거효과의 경우 환류냉각추출 및 가압가열추출에서 높은 활성을 나타내었다.
- 00 mg으로 가압가열추출 및 저온고압추출의 경우 유사하였고 환류냉각추출에서는 유의적으로 높은 함량을 나타내었다. 프로안토시아니딘 함량에서는 RE, AE 및 LTPE가 g당 각각 3.38 mg, 3.35 mg 및 3.70 mg으로 저온 고압추출이 환류냉각 및 가압가열추출에 비해 각각 9.47%및 10.45% 높은 함량을 나타내었다. 이상의 결과 추출방법에 따른 페놀화합물 함량의 유의적인 차이를 나타내었으며 저온고압추출 시 페놀화합물 등의 유용성분의 추출함량 증대에 좋은 영향을 미칠 수 있을 것으로 판단된다.
- 한편 ABTS 라디칼 소거활성은 추출방법별로 LTPE(91.37%)> RE(86.70%)> AE(83.19%) 순으로 저온고압추출에서 높은 활성을 보였으나 농도대비 양성대조군에 비해 현저히 낮은 활성을 나타내었다.
- α-Glucosidase 및 XO 저해활성은 저온고압추출에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 한편 AChE 저해활성에서는 저온고압추출, 가압가열추출, 환류냉각추출 순으로 높은 활성을 나타내었고, TLC bioassay를 통하여 살펴본 결과 특정 compound들에 의해 AChE 저해 활성이 나타났으며 퇴행성 질환의 하나인 치매의 예방 가능성을 확인하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 저온고압추출물이 소재 활용가치가 높을 것으로 사료되며 천연항산화제 및 기능성 증진을 위한 소재로 이용 가능할 것으로 판단된다.
- 88)과 비교하여 동일한 위치에서 band가 확인되었다. 한편 Fast Blue B Salt를 분사하여 보라색을 발색시킨 plate(III)의 경우 AChE 억제 효능을 나타내는 white band(Rf 0.47)를 확인하였으며, UV-365 nm에서 관찰하였을 때 동일한 위치에서 blue zone(35)을 나타내 이 물질로 인해 AChE 저해활성이 나타나는 것을 확인하였다. TLC 방법에 의한 AChE의 저해 활성은 naphthyl acetate가 AChE에 의해 α-naphthol로 전환되고, α-naphthol은 2개의 active site form을 가지고 있는 Fast Blue B Salt와 반응하여 azo dye가 생성되어 보라색이 나타나게 되는 원리로 AChE 저해를 할 수 있는 성분이 존재할 시 α-naphthol의 생산은 멈추게 되고 azo dye의 생산이 억제됨에 따라 활성성분은 white band를 띠게 된다 (35).
후속연구
- 60%)의 순으로 환류 냉각추출 및 가압가열추출에서 높은 활성을 나타낸 반면 항산화 활성의 경향과는 상반되는 결과를 보였는데, 이는 금속이온을 제거할 수 있는 물질과 radical을 제거할 수 있는 물질의 차이에 따른 결과라 사료된다. 대표적인 금속이온 agent인 EDTA(98.74%)의 수준에는 미치지는 못하였으나 높은 활성을 나타내어 소재로서의 이용 가능성이 예견되었으며, 특히 쇠비름 추출물의 경우 단일 성분이 아닌 추출물임을 고려해 볼 때 추후 분리 및 구조 동정을 통하여 체내에 생성된 ferrous ion을 효과적으로 제거시킬 수 있는 천연물로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 한편 AChE 저해활성에서는 저온고압추출, 가압가열추출, 환류냉각추출 순으로 높은 활성을 나타내었고, TLC bioassay를 통하여 살펴본 결과 특정 compound들에 의해 AChE 저해 활성이 나타났으며 퇴행성 질환의 하나인 치매의 예방 가능성을 확인하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 저온고압추출물이 소재 활용가치가 높을 것으로 사료되며 천연항산화제 및 기능성 증진을 위한 소재로 이용 가능할 것으로 판단된다.
- 쇠비름의 경우 5가지 종류의 알칼로이드 성분인 oleracein A, B, C, D 및 E를 함유하는 것으로 알려진바 있으며(5), 본 연구에서 쇠비름 추출물에서 ACheE 저해 활성을 나타내는 것은 알칼로이드 성분에 따른 결과로 추정된다. 한편 쇠비름의 경우 퇴행성 질환의 하나인 치매의 예방 가능성을 보여주었으나 이에 대한 생리활성 성분 추적과 보다 구체적인 AChE 저해 메카니즘 연구와 효능검증이 수행되어야 할 것으로 판단된다.
- 04%로 환류냉각 및 저온고압추출에서 가장 높은 반면 가압가열추출에서는 낮은 활성을 나타내었다. 한편 양성 대조군인 acarbose(78.57%)에 비해 낮은 저해활성을 보였으나 환류냉각 및 저온고압추출의 경우 혈당의 급격한 증가를 예방할 수 있는 기능성 소재로서의 개발 가능성이 높을 것으로 판단된다.
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