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문제 정의
- 이러한 초미세 분쇄 기술은 1차 가공처리 기술을 넘어서 한약재 추출물의 용해도를 증진시켜 체내 흡수율 증가시킴으로 기능성 식품 소재나 식의약 소재 등 고부가 가치소재로 전환을 기대할 수 있다(24,25). 따라서 삼백초잎으로 부터 생리활성에 관여하는 phenolic compounds를 추출하기 위하여 일반분쇄, 미세분쇄 및 초미세분쇄 추출 등 추출방법을 달리하여 phenolic compounds의 용출량을 알아보았다. 그 결과 Table 1에서와 같이 물보다 ethanol을 이용하는 것이 효과적이며, 초미세 분쇄를 하였을 때 추출 수율이 증가하여 입자 크기에 대한 추출수율이 입자가 작아질수록 추출수율이 높아져 약2.
- 따라서, 본 연구에서는 초미세 분쇄가 삼백초잎으로 부터 생리활성물질의 용출에 미치는 영향과 이들 추출물이 나타내는 다양한 생리활성의 변화를 살펴보았다.
제안 방법
- Disc diffusion method 에 의한 항균활성 검색은 최적배지 agar plate에 준비한 균배양액 100 μL를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 지름 8 mm 크기의 disc paper를 올려놓고 0.45 μm membrane filter로 제균한 시료용액 100 μL에 phenolics 농도가 50 μg/100 μL, 100 μg/100 μL, 150 μg/100 μL 및 200μg/100 μL가 되도록 각각 분주하였다.
- 25 mL 첨가로 반응을 중지시킨 뒤 3 mL의 ethylacetate를 첨가하였다. Ethylacetate 층으로부터 용매를 증류시킨 잔사에 2 mL의 증류수를 첨가하여 추출된 hippuric acid를 spectrophotometer를 사용하여 흡광도 280 nm에서 측정한 후 다음 식에 따라 저해율(%)을 구하였다.
- 대조구로는 멸균수 100 μL를 흡수시켜 24시간 동안 배양하여, disc 주위의 clear zone 생성 유무와 직경을 측정함으로써 항균활성을 계산하였다(22).
- 식물이 2차대사산물로 생산하는 phenolic compound들은 종류에 따라서 이 효소의 작용을 저해함으로써 고혈압의 치료가 가능하다고 알려져 있다 (31,32). 본 연구에서는 삼백초 잎 추출물의 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 그 결과 Table 4에서와 같이 일반추출의 경우 물추출물에서는 활성이 나타나지 않았고 50% ethanol 추출물에서 24%의 억제율이 확인되었고, ethanol 추출물의 억제효과가 물추출물에 비해 상대적으로 우수한 억제 효과를 나타내었다.
- 7%의 전자공여능 억제효과를 나타낸다고 보고한 것과 비교하면 삼백초의 초미세분쇄 추출물과 유사한 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 추출물들의 hydrogen-donating antioxidant와 chain breacking antioxidant 모두를 측정할 수 있으며, 표준물질의 사용으로 추출물의 상대 비교가 가능하도록 ABTS+ free radical이 추출물속의 항산화 물질에 의해 radical 특유의 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물의 항산화효과를 측정하였다(16). 그 결과 Table 2에서와 같이 일반추출물과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물 모두 97%이상의 높은 항산화효과를 나타내어 분쇄 방법에 따른 차이는 거의 없었다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 시료는 건조 시킨 삼백초잎을 mixer를 사용하여 분쇄하여 40 mesh를 통과한 분말을 일반분쇄시료로 하였다. 초미세분쇄 시료는 삼백초잎을 한국생명공학연구원 정읍 분원에 있는 10 L 용량의 초미세 분쇄 장치(MKFS10-1, Koen 21 Co.
- 식중독의 원인균인 Staphylococcus aureus 표준균주인 KCTC 1039와 병원성 대장균인 Escherichia coli로서 표준 균주인 KCTC 1039, 충치원인균인 Streptococcus mutans로서 표준균주인 KCTC 7965 및 위, 십이지장궤양 원인균인 Helicobacter pylori로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였고, St. mutans 및 H. pylori 배양은 미호기성 조건을 유지시켜주기 위해서 10% CO2 incubator를 이용하였고, incubator의 습도는 항상 95% 이상으로 유지하였으며, agar plate상에서 배양은 37℃로 48∼72시간 동안 실시하였다 (21
- 초미세분쇄 시료는 삼백초잎을 한국생명공학연구원 정읍 분원에 있는 10 L 용량의 초미세 분쇄 장치(MKFS10-1, Koen 21 Co., Ansan, Korea)를 이용하여 시간당 20 kg의 grinding 속도로 fine grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 140 mesh : 미통과 사이즈)와 ultrafine grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 140 mesh : 통과 사이즈)으로 나누어 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 3번 이상 반복하여 측정한 후 평균값으로 나타내었으며, 실험결과의 통계분석은 SAS(Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 Duncan’s multiple range test를 이용하여 평균값간의 유의성 검정(p<0.05)을 하였다.
이론/모형
- ABTS〔2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)〕radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등의 방법(16)으로 측정하였다.
- ACE 저해효과 측정은 Cushman 등의 방법(19)으로 행하였다. 즉, 반응구는 0.
- DPPH(2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical에 대한 소거활성은 Blois의 방법(15)에 준하여 측정하였다.
- PF는 Andarwulan과 Shetty의 방법(17)으로 측정하였다. 10 mg의 β-carotene/50 mL chloroform 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣고 40℃ water bath에서 chloroform을 증발시킨 후, 20 μL linoleic acid, 184 μL Tween 40과 50 mL H2O2를 가하여 emulsion을 만들고, 5 mL의 emulsion을 시료용액 100 μL에 혼합하여 잘 섞어준 뒤 50℃에서 30분간 반응시켜 냉각시킨 다음, 470 nm에서 흡광도를 측정하였고 PF는 다음의 식으로 계산하였다.
- Phenol성 화합물의 정량은 Kim 등의 방법(14)으로 측정하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, 5% Na2CO3 1 mL를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
- TBARS는 Burge와 Aust의 방법(18)에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들고 emulsion 0.
- Xanthin oxidase(XOase) 활성저해 측정법은 Stirpe와 Corte의 방법(20)에 준하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.
- 8 PF로 높은 항산화력을 나타내어, 삼백초 추출물의 지용성물질에 대한 항산화력도 비교적 우수하다고 판단되었다. 지질과산화물인 malondialdehyde의 함량은 Burge와 Aust의 방법(18)을 이용하여 측정하였다. 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리하여 제조한 추출물의 thiobarbituric acid reactive substance를 측정한 결과 Table 2에서와 같이 일반분쇄한 시료 추출물에서 74.
- 항균력 측정은 paper disc법을 이용하여 측정하였다. 즉, 평판배지에 배양된 각 균주를 1 백금이 취해서 액체배지 10 mL에서 18∼24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10 mL에 균액을 0.
성능/효과
- 또한, ethanol 추출물의 억제효과가 물 추출물에 비해 상대적으로 우수하였다. 50% ethanol 초미세분쇄 추출물에서 Staphylococcus aureus, Escherichia coli에 대해서 아주 약한 항균효과를 나타내었을 뿐 나머지 추출물에서의 항균 효과는 거의 관찰되지 않았다.
- Xanthin oxidase 저해의 경우 초미세분쇄 후 효소억제 증대 효과를 확인할 수 있었다. Angiotensin converting enzyme 억제활성은 일반 분쇄 추출의 경우 물 추출물에서는 억제활성이 나타나지 않았고, 50% ethanol 추출물에서 24%의 억제율이 확인되었다. 또한, ethanol 추출물의 억제효과가 물 추출물에 비해 상대적으로 우수하였다.
- 따라서 삼백초잎으로 부터 생리활성에 관여하는 phenolic compounds를 추출하기 위하여 일반분쇄, 미세분쇄 및 초미세분쇄 추출 등 추출방법을 달리하여 phenolic compounds의 용출량을 알아보았다. 그 결과 Table 1에서와 같이 물보다 ethanol을 이용하는 것이 효과적이며, 초미세 분쇄를 하였을 때 추출 수율이 증가하여 입자 크기에 대한 추출수율이 입자가 작아질수록 추출수율이 높아져 약2.5배 높은 추출수율을 나타내었다. 유기용매로 추출하는 것이 물을 용매로 하여 추출하였을 때 보다 높은 추출율을 나타내어 삼백초 잎의 phenolic compounds가 극성용매에서 용해도가 높은 것으로 확인되어 유기용매에서 phenolic compounds의 추출수율이 높다는 Shin의 결과(26) 와 유사하였다.
- 추출물들의 hydrogen-donating antioxidant와 chain breacking antioxidant 모두를 측정할 수 있으며, 표준물질의 사용으로 추출물의 상대 비교가 가능하도록 ABTS+ free radical이 추출물속의 항산화 물질에 의해 radical 특유의 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물의 항산화효과를 측정하였다(16). 그 결과 Table 2에서와 같이 일반추출물과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물 모두 97%이상의 높은 항산화효과를 나타내어 분쇄 방법에 따른 차이는 거의 없었다. 이러한 결과로 보아 삼백초 물과 ethanol 추출물은 친수성 및 lipophilic 물질에 대한 항산화력이 우수한 것을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 삼백초 잎 추출물의 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 그 결과 Table 4에서와 같이 일반추출의 경우 물추출물에서는 활성이 나타나지 않았고 50% ethanol 추출물에서 24%의 억제율이 확인되었고, ethanol 추출물의 억제효과가 물추출물에 비해 상대적으로 우수한 억제 효과를 나타내었다. 또한 미세 분쇄보다 초미세 분쇄 추출물이 우수한 고혈압 억제효과를 나타내어 초미세 분쇄를 통한 ethanol 추출이 생리활성의 활용 측면에서 매우 유리할 것이라 판단되었다.
- 그 결과 Table 4에서와 같이 일반추출의 경우 물추출물에서는 활성이 나타나지 않았고 50% ethanol 추출물에서 24%의 억제율이 확인되었고, ethanol 추출물의 억제효과가 물추출물에 비해 상대적으로 우수한 억제 효과를 나타내었다. 또한 미세 분쇄보다 초미세 분쇄 추출물이 우수한 고혈압 억제효과를 나타내어 초미세 분쇄를 통한 ethanol 추출이 생리활성의 활용 측면에서 매우 유리할 것이라 판단되었다. 일반적으로 phenol 유래 화합물의 페놀성 수산기에 의해 단백질과 복합체의 침전물을 형성하여 비경쟁적으로 효소를 저해함으로서 효소 불활성화를 일으키는 것으로 보고되었다(31).
- Angiotensin converting enzyme 억제활성은 일반 분쇄 추출의 경우 물 추출물에서는 억제활성이 나타나지 않았고, 50% ethanol 추출물에서 24%의 억제율이 확인되었다. 또한, ethanol 추출물의 억제효과가 물 추출물에 비해 상대적으로 우수하였다. 50% ethanol 초미세분쇄 추출물에서 Staphylococcus aureus, Escherichia coli에 대해서 아주 약한 항균효과를 나타내었을 뿐 나머지 추출물에서의 항균 효과는 거의 관찰되지 않았다.
- 8 PF로 가장 높은 항산화력을 나타내었다. 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서는 일반분쇄 추출물에 비해 입자크기가 작아질수록 TBARS 억제율이 높아지며, 물 추출물보다 ethanol 추출물의 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. Xanthin oxidase 저해의 경우 초미세분쇄 후 효소억제 증대 효과를 확인할 수 있었다.
- 삼백초 잎 추출물을 이용하여 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리하여 추출한 추출물들에 대하여 전자공여능을 측정한 결과 Table 2에서와 같이 일반분쇄한 시료추출물에서 69.8%의 전자공여능 억제효과가 관찰되었고, 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서는 각각 70.7과 83.8%의 억제효과를 나타내어 입자크기가 작아질수록 추출수율이 높아진다는 앞에서의 결과에 따라 분쇄 방법에 따른 추출수율의 증가에 기인하여 전자공여능 억제 효과가 높아진 것으로 판단하였다. Cho 등(28)이 진달래 추출물의 항산화 측정 결과, 열수 추출물과 ethanol 추출물에서 각각 83.
- 삼백초 잎의 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리하여 추출물의 항균활성을 측정하기 위하여 식중독균인 S. aureus, E. coli와 충치균인 St. mutnas, 위염균인 H. pylori를 사용하여, agar plate상에서 37℃의 incubator로 24∼48시간 동안 배양한 결과 일반추출과 미세분쇄 추출물에서는 항균활성이 전혀 검출되지 않았고, 초미세분쇄 추출물에서는 Table 5에서와 같이 50% ethanol 추출물에서 S. aureus, E. coli에 대해서 아주 약한 항균효과를 나타내었을 뿐 항균효과는 거의 관찰되지 않았다.
- 그 결과 Table 2에서와 같이 일반추출물과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물 모두 97%이상의 높은 항산화효과를 나타내어 분쇄 방법에 따른 차이는 거의 없었다. 이러한 결과로 보아 삼백초 물과 ethanol 추출물은 친수성 및 lipophilic 물질에 대한 항산화력이 우수한 것을 알 수 있었다. 지용성 물질에 대한 antioxidant protection factor 측정을 위하여 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법에 따른 antioxidant protection factor를 측정한 결과 Table 2에서와 같이 일반분쇄한 시료 추출물 보다 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서 더 높은 PF값을 확인하였으며 50% ethanol 초미세분쇄 추출물에서 1.
- 일반분쇄 추출물과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물 모두 97% 이상의 높은 ABTS 억제효과를 나타내어 분쇄 방법에 따른 항산화력의 차이는 거의 없었다. 일반 분쇄한 시료 추출물 보다 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서 더 높은 PF값을 확인하였으며, 50% ethanol 초미세분쇄 추출물에서 1.8 PF로 가장 높은 항산화력을 나타내었다. 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서는 일반분쇄 추출물에 비해 입자크기가 작아질수록 TBARS 억제율이 높아지며, 물 추출물보다 ethanol 추출물의 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다.
- 5배 높은 추출수율을 나타내었다. 일반 분쇄한 시료 추출물에서 69.8%의 전자공여능 억제효과가 관찰되었고, 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서는 각각 70.7과 83.8%의 억제효과를 나타내었다. 일반분쇄 추출물과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물 모두 97% 이상의 높은 ABTS 억제효과를 나타내어 분쇄 방법에 따른 항산화력의 차이는 거의 없었다.
- 8%의 억제효과를 나타내었다. 일반분쇄 추출물과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물 모두 97% 이상의 높은 ABTS 억제효과를 나타내어 분쇄 방법에 따른 항산화력의 차이는 거의 없었다. 일반 분쇄한 시료 추출물 보다 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서 더 높은 PF값을 확인하였으며, 50% ethanol 초미세분쇄 추출물에서 1.
- 지질과산화물인 malondialdehyde의 함량은 Burge와 Aust의 방법(18)을 이용하여 측정하였다. 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리하여 제조한 추출물의 thiobarbituric acid reactive substance를 측정한 결과 Table 2에서와 같이 일반분쇄한 시료 추출물에서 74.5%(water extracts)와 79.2%(ethanol extracts)의 TBARS 억제효과가 관찰되었고, 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서는 각각 81.2%, 88.7%와 86.7%, 91.3%의 억제효과를 나타내어 입자크기가 작아질수록 추출수율이 높아지며, 물추출물보다 ethanol 추출물의 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다.
- 이러한 결과로 보아 삼백초 물과 ethanol 추출물은 친수성 및 lipophilic 물질에 대한 항산화력이 우수한 것을 알 수 있었다. 지용성 물질에 대한 antioxidant protection factor 측정을 위하여 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법에 따른 antioxidant protection factor를 측정한 결과 Table 2에서와 같이 일반분쇄한 시료 추출물 보다 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서 더 높은 PF값을 확인하였으며 50% ethanol 초미세분쇄 추출물에서 1.8 PF로 높은 항산화력을 나타내어, 삼백초 추출물의 지용성물질에 대한 항산화력도 비교적 우수하다고 판단되었다. 지질과산화물인 malondialdehyde의 함량은 Burge와 Aust의 방법(18)을 이용하여 측정하였다.
- 초미세 분쇄를 하였을 때 입자가 작아질수록 추출수율이 높아져 약 2.5배 높은 추출수율을 나타내었다. 일반 분쇄한 시료 추출물에서 69.
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