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문제 정의
- 현삼에서 항염 효과에 대한 연구는 LPS로 유발된 대식세포의 염증인자에 미치는 영향31)이 보고되어 있으나, RBL-2H3 비만세포에 대한 탈과립 및 다양한 염증매개인자들에 대한 연구는 부족한 것으로 판단되었다. 본연구에서는 비만세포(RBL-2H3 basophilic mast cell)에서현삼의 알레르기 반응조절에 미치는 영향을 확인 하였다. 현삼에탄올추출물(SRE)이 RBL-2H3 세포에서 500 ㎍/㎖ 농도까지 처리하였을 때 세포 생존 및 증식에 영향을 미치지 않는 것으로 확인 되어 SRE 500 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 각 실험을 진행하였다.
- 이에 본 연구는 현삼 에탄올추출물의 비만세포(RBL-2H3basophilic mast cell)에서 β-hexosaminidase 분비억제 및 Type2 cytokine IL-4, TNF-α생성억제를 조사하여 현삼에탄올추출물이 알레르기 반응 조절에 미치는 영향을 확인 하였다.
제안 방법
- DNP-IgE 자극으로 활성화된 비만세포로부터 합성, 분비되는 IL-4와 TNF-α를SRE 10, 50, 100 ㎍/㎖을 첨가한 세포에서 각 20.6 ± 1.89pg/㎖, 18.5 ± 2.36 pg/㎖, 12.7 ± 2.88 pg/㎖의 IL-4분비 억제능을 확인 하였으며 SRE를 첨가하지 않은 대조군에 비해 유의한 억제 효과를 확인 하였다.
- RBL2H3 cells (1×106 cells/well)을 96 well culture plate에 180 ㎕ 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 다음, 시료를 농도별 (1, 5, 10, 50, 100, 500 ㎍/㎖)로20 ㎕ 처리한 후 24시간동안 반응시켰다.
- SRE의 RBL-2H3 비만세포의 탈과립에 미치는 효과를 확인하기 위해 IgE로 부터 감작된 비만세포에서 유리된 히스타민의 양을 측정하는 것이 일반적이나 비만세포에서 분비되는 히스타민의 농도가 낮고 측정과정이 복잡하여 항원-항체 반응에 의한 β-hexosaminidase 농도를 측정 하였다.
- RBL-2H3 cells을10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 24 well plate에 2×105 cells/㎖의 세포수가 되도록 분주한 후 dinitrophenylImmunoglobulinE (DNP IgE)(20 ng/㎖)로 감작하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 각 세포들을Siraganian buffer(159 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6mMglucose, 0.4 mM MgCl2, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH,1mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)로 2번 세척한 다음 37℃ 5% CO2 incubator에서 10분간 반응시킨 후 SRE를 농도별(10, 50, 100, 500 ㎍/㎖)로 처리하여 30분 동안 반응시켰다.
- 대조군은 시료와 동량의 멸균수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 무혈청배지로 교체한 후 MTT(5 ㎎/㎖) 용액 20㎕를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO : Ethanol(1 : 1) 150 ㎕를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로나타내었다.
- incubator에서 24시간 배양하였다. 배지교환 후 SRE를 농도별(10, 50, 100 ㎍/㎖)를 처리하여 1시간동안 37℃ 5% CO2incubator에서 배양한 후 DNP-BSA (25 ng/㎖)를 처리하여 4시간동안 자극시키고 ice bath에서 반응을 종결시켰다. 배양이 끝난 상층액을 1,000 rpm에서 10분간 원심분리한 상층 액을 96-well plate에 옮기고 IL-4, TNF-αELISA kit(R&Dsystems, USA)를 사용하였으며 microplater reader(BioRad, USA), 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 22256)에서 분양받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heatinactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM (GibcoBRL, USA)에서 배양하였다 세포는37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.05% trypsin-EDTA solution(GibcoBRL, USA)을 처리하여세포를 부유시킨 다음 계대배양 하였다.
- 알레르기 즉시반응의 지표인 탈과립 억제효과를 확인하기 위해 β-hexosaminidase를 측정 하였다.
- 이후 항원 DNP-BSA(25 ng/㎖)을 가하여 10분 반응시키고 ice bath에서 5분 방치한 후 반응을 종결시켰다. 상층액 40 ㎕ 를96 well plate에 옮기고 substrate buffer(4-p-NitrophenylN-acetyl-b-D-glucosaminide 2 mM, sodium citrate 0.
- 현삼 에탄올추출물(SRE)의 항알레르기 효과를 확인하기 위해 DNP-IgE 자극으로 활성화된 RBL-2H3 비만세포에서의 알레르기 염증반응에 대한 억제효과를 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본연구에서는 비만세포(RBL-2H3 basophilic mast cell)에서현삼의 알레르기 반응조절에 미치는 영향을 확인 하였다. 현삼에탄올추출물(SRE)이 RBL-2H3 세포에서 500 ㎍/㎖ 농도까지 처리하였을 때 세포 생존 및 증식에 영향을 미치지 않는 것으로 확인 되어 SRE 500 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 각 실험을 진행하였다. RBL-2H3 비만세포에서 알레르기 반응에 의해 세포밖으로 분비되어 탈과립의 지표로 이용되는 β-hexosaminidase 억제 효과에서 SRE 500, 100, 50, 10, ㎍/㎖ 농도에서 41.
- 활성화된 비만세포로부터 분비되는 염증사이토카인인 IL-4와TNF-α에 대한 SRE의 효과를 확인하기 위해 세포배양액으로부터 IL-4, TNF-α의 농도를 ELISA kit을 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 현삼은 대구약령시에서 구입하여 실험재료로 사용하였다. Fig. 1과 같이 현삼 300g을 70% 에탄올을 시료 중량의 10배를 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출 하였고, 얻어진 여액은 여과 (Whatman NO. 5) 및 감압 농축(Rotary vaccum evaporatory)하여 동결건조기를 이용하여 건조한 분말을 시료로 사용 하였다. 동결건조 추출물은 96g을 얻었으며, 수율은 32%였다.
- RBL-2H3 (rat basophilic leukemia cell line)은 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB No. 22256)에서 분양받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heatinactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM (GibcoBRL, USA)에서 배양하였다 세포는37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.
- 본 실험에 사용한 현삼은 대구약령시에서 구입하여 실험재료로 사용하였다. Fig.
- IL-4는 IgE 합성과 즉시형 과민반응을 유발할 수 있으며, IgE 생산을 위한 B세포를 전환시키고, 내피세포의 vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 발현, Th2 세포와 호산구 분화에 필수적인 IL-5의 분화를 유도한다26). 본 연구에서 사용한 RBL-2H3 세포는 흰쥐의 중성구에서 유래한 비만세포이며 세포 표면에 IgE 수용체가 있어 IgE 자극에 의한 사이토카인의 발현, 히스타민의 방출, 염증물질 분비 등사람의 비만세포와 유사한 특징을 나타내기 때문에 알레르기 질환에서의 항염증, 항알러지 소재 개발연구에 많이 사용하고 있다27). 알레르기 질환의 약물치료는 주로 비만세포 안정화, 비만세포 탈과립 억제, 비만세포로 부터 히스타민 유리 억제 등 주로 비만세포 조절과 관련된 약물들로 항히스타민제, 항알레르기제, 항염증제, 화학매체에 대한 길항제 등 다양하게 사용하고 있다, 그러나 현재까지도 일시적인 증상개선은 가능하나 근본적인 치료가 되지 않고 있는 실정이며 부작용도 다양하게 보고되고 있다28).
- Louis, MO, USA), DNP IgE (Sigma-Aldrich), DNP-bovine serum albumin(Alpha Diagnostic International, San Antonio, TX, USA),IL-4, TNF-αELISA kit(R&D Systems Inc), p-nitrophenylN-acetyl-beta-D-glucosamine(Sigma-Aldrich) 그 외 각종 시약은 특급 시약을 사용하였다. 실험에 사용되어진 기기는 microplater reader(Bio-Rad, USA), rotary evaporator(Eyela, Tokyo, Japan), vaccuo freeze-dryer(Eyela, Tokyo,Japan) 등이다.
- 실험에 사용되어진 전 배양 및 본 배양을 위한 액체배지는Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) fetal bovine serum (FBS), trypsin 250, 0.4% trypan blue stain은 Gibco(New York, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Dunett test 검정을 실시하였다
- 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 SPSS 17.0K for Windows 통계프로그램 패키지를 사용하여 평균치±표준편차로 나타내었고 유의수준은 p＜0.05로 하였다.
이론/모형
- RBL-2H3 cells(1×106 cells/㎖) were treated with the indicated concentrations(10, 50, 100, 500 ㎍/㎖) of SRE for 1h. Cell viability was evaluated using a colorimetric assay based on MTT assay. The absorbance was measured at 550 mn using ELISA reader.
- SRE의 RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Camichael 등23)에 따라 측정하였다. RBL2H3 cells (1×106 cells/well)을 96 well culture plate에 180 ㎕ 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 다음, 시료를 농도별 (1, 5, 10, 50, 100, 500 ㎍/㎖)로20 ㎕ 처리한 후 24시간동안 반응시켰다.
성능/효과
- 1. SRE은 RBL-2H3 비만세포에서 500 ㎍/㎖ 농도까지 세포 독성이 나타나지 않았다.
- 2. DNP-IgE-BSA 자극에 의해 활성화된 비만세포로부터 분비되는 beta-hexosaminidase를 측정 한 결과, SRE500 ㎍/㎖ 농도 첨가된 세포에서 41.01 ± 0.05 % 의 저해효과를 확인 하였으며 시료의 농도가 증가함에 따라 beta-hexosaminidase의 양이 감소하는 것을 확인 하였다.
- 3. SRE가 첨가된 활성화된 비만세포에서 cytokine IL-4,TNF-α분비를 농도 의존적으로 감소시킴으로써 이결과는 비만세포에서 후기 염증반응을 억제에도 관여하는 것으로 판단된다.
- 5.에서와 같이 RBL-2H3에서 분비된 IL-4의 양은 DNP-IgE와 SRE 모두 처리하지 않은 세포에서 5.42 ± 1.13 pg/㎖이 였으며, DNP-IgE으로 자극한 세포는 29.9 ± 0.89 pg/㎖로 분비된 IL-4의 양에 유의한 차이가 있음을 확인 하였다.
- DNP-IgE 자극 및 SRE 10, 50, 100㎍/㎖을 첨가한 세포에서는 각 20.6 ± 1.89 pg/㎖, 18.5 ±2.36 pg/㎖, 12.7 ± 2.88 pg/㎖의 IL-4 분비 억제능을 확인하였으며, SRE를 첨가하지 않은 대조군에서 29.9 ± 0.89pg/㎖의 IL-4 농도에 비해 낮은 억제 효과를 확인 하였다.
- RBL-2H3 비만세포에서 알레르기 반응에 의해 세포밖으로 분비되어 탈과립의 지표로 이용되는 β-hexosaminidase 억제 효과에서 SRE 500, 100, 50, 10, ㎍/㎖ 농도에서 41.01± 0.05, 40.28 ± 0.05, 34.62 ± 0.04 및 31.2 ± 0.03의 억제효과를 확인 하였다.
- RBL-2H3 세포에서 SRE의 생존 및 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay 측정 결과, Fig. 2 에서와 같이SRE를 첨가하지 않은 대조군의 경우 세포 생존율은 109.3%였으며, SR을 10, 50, 100, 500 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 각각 101.3%, 101.1%, 98.8%, 97.8% 으로 현삼 에탄올추출물은 RBL-2H3 세포에서 500 ㎍/㎖ 농도까지 처리하였을 때 독성이 미미한 것으로 확인 되었다. 따라서 이후 실험에서는 세포 생존 및 증식에 영향을 미치지 않는 농도범위인 500 ㎍/㎖ 이하 농도에서 수행하였다.
- SRE 첨가량의 농도가 증가하면서 β-hexosaminidase 분비량이 감소하는 양상을 나타내었다.
- 과 같이 DNP-IgE와DNP-BSA에 의해 활성화된 control군 세포에서 분비된 탈과립의 억제능을 0%로 볼 때 SRE 500, 100, 50, 10, ㎍/㎖ 농도에서 41.01 ± 0.05, 40.28 ± 0.05, 34.62 ± 0.04 및 31.2 ± 0.03의 억제효과를 확인하였다.
- 따라서 SRE은 활성화된 비만세포로부터 탈과립 현상을 막아 히스타민, beta-hexosaminidase, IL-TNF-α등의 화학매개물질의 분비를 유의적으로 억제함으로써 알레르기 염증반응을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
- 또한 SRE 10, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 각각 21.56 ± 1.56 pg/㎖, 17.1 ± 2.41 pg/㎖, 11.25 ±1.14 pg/㎖로 TNF-α의 분비가 감소함으로써 SRE가 활성화된 비만세포에서 염증반응에 억제 효과가 있음을 확인 할 수 있었다.
- 또한, TNF-α억제 효과는 정상세포에서 TNF-α의 농도가 3.89 ± 1.19 pg/㎖로 낮게 측정되었으며, DNP-IgE에 의해 활성화됨으로써 TNFα의 농도가 29.20 ± 0.98 pg/㎖로 증가되었다.
- 또한, TNF-α억제 효과는 정상세포에서 TNF-α의 농도가3.89 ± 1.19 pg/㎖로 측정되었으며, DNP-IgE에 의해 활성화됨으로써 TNF-α의 농도가 29.20 ± 0.98 pg/㎖로 증가되었다.
- 05 % 의 저해효과를 확인 하였으며 시료의 농도가 증가함에 따라 beta-hexosaminidase의 양이 감소하는 것을 확인 하였다. 이 결과는SRE가 비만세포에서 초기 염증반응을 억제 할 수 있는 효과를 가지고 있음을 의미한다.
후속연구
- 이와 같이 SRE가 RBL-2H3에서 생존 및 증식에 미치지 않으면서 비만세포의 탈과립 및 염증매개 관련 cytokin을 생성을 억제하는 것은 알레르기 및 염증반응 완화에 효능이 있음으로 판단된다. 본 연구를 바탕으로 염증질환에 효과적인 한약재 개발을 위해 현삼에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 여겨지는바이다.
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