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문제 정의
- 따라서 본 연구는 항천식 관련 건강기능소재로서 감초의 이용 가능성을 알아보기 위하여 항원-항체 반응으로 인해 활성화된 RBL-2H3 세포에서 감초 추출물이 천식의 초기 반응에 관여하는 β-hexosaminidase의 분비 및 후기 반응에 관여하는 Th2 세포 관련 IL-4, IL-13 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.
- , 1999; Choi, 2002). 따라서 본 연구에서는 이러한 실험계를 이용하여 감초 추출물이 천식 초기 반응에 관여하는 화학매체의 탈과립 억제 활성을 간접적으로 측정하였다.
제안 방법
- IL-4와 IL-13의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. PCR 튜브에 Go Tag Green Master 10 ㎕, forward primer (15 µM)와 reverse primer (15 µM)을 각각 0.
- 1% diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 75 : 25로 섞어 만든 75% 에탄올을 각 튜브에 1 ㎖씩 분주하여 12,000 × g에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. Nuclease free water를 15 ㎕씩 분주하여 녹인 후 RNA 5 ㎕에 0.1% DEPC를 995 ㎕를 첨가하여 260 ㎚에서 흡광도를 측정하였고 total RNA 양을 정량하였다.
- IL-4와 IL-13의 PCR 조건은 94℃에서 4분 (1 cycle), 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초 (25 cycles), 72℃에서 5분 (1 cycle)이었고, GAPDH 조건은 94℃에서 4분 (1 cycle), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초 (20 cycles), 72℃에서 5분 (1 cycle) 이었다. PCR 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가된 1.2% agarose gel에 100v에서 30분간 전기영동한 후 자외선 광으로 유전자 발현정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel (Jandel Scientific) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
- PCR 튜브에 Go Tag Green Master 10 ㎕, forward primer (15 µM)와 reverse primer (15 µM)을 각각 0.5 ㎕, nuclease free water 8 ㎕, 합성한 first-stand cDNA 1 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR를 실행하였다.
- Primer의 염기서열은 IL-4, Forward) ACCTTGCTGTCAC CCTGTTC and Reverse) TTGTGAGCGTGGACTCATTC 및 IL-13, Forward) GCTCTCGCTTG CCTTGGTG GTC and Reverse) CATCCGAGGCCTTTTGGTTAGAG, 그리고 내부 표준유전자 GAPDH, Forward) ACCACAGTCCATGCCATCAC and Reverse) TCCACCACCCTGTTGCTGTA을 사용하였다.
- RBL-2H3 세포를 96 well plates에 1 × 106 cells/㎖ 농도로 100 ㎕ 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 DMEM 배지에 감초 추출물을 각 농도별 (0, 100, 250, 500, 1000, 2000 ㎍/㎖)로 제조한 후 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
- 5 ㎍/㎖)를 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 12시간 배양하였다. 각 세포들을 Siraganian buffer (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM glucose, 0.4 mM MgCl2, 25 mM PIPES, 1 mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)로 2회 세척한 다음 37℃, 5 % CO2 배양기에서 10분간 반응시킨 후 FBS와 DMEM 배지에 감초 추출물을 농도별 (0, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖)로 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 dinitropheny-Human Serum Albumin(DNPHSA) (2 ㎍/㎖)을 가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 반응시키고 얼음에서 냉각시키고 반응을 종결시켰다.
- 2% agarose gel에 100v에서 30분간 전기영동한 후 자외선 광으로 유전자 발현정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel (Jandel Scientific) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
- 따라서 이하의 실험에서는 감초 추출물의 0, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도 범위에서 세포 내 β-hexosaminidase 분비와 Th2 cytokine의 발현 억제 정도를 확인하였다.
- , 2005; Renauld, 2001). 본 연구에서는 항원-항체 반응을 일으키기 위하여 DNP-IgE와 DNP-HSA를 사용하였는데, DNP는 두 개의 페놀 기능기를 포함하는 작은 분자로 DNP 자체는 어떤 면역반응이나 항원을 일으키지 않지만 DBP 합텐에 대한 항체로 BSA와 같은 단백질에 결합시키면 항원 역할만 하던 합텐이 면역원의 역할을 하게 된다.
- 이를 실온에서 방냉하고 여과한 다음 감압농축기 (rotary vaccum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)로 농축하였고, 시료를 동결 건조기 (IlShin FD 8508, Ilshin, Seoul, Korea)를 이용하여 −70℃에서 건조한 시료를 냉동보관하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
- Oligo (dT)15 primer (500 ㎍/㎖) 1 ㎕, dNTP Mix (10 mM) 1 ㎕, 추출한 RNA 1 ㎍와 RNase free water로 11 ㎕을 맞추고 65℃에서 5분간 반응시킨 후 즉시 얼음에서 냉각시켰다. 이후 5배 firststand 완충용액 4 ㎕, nuclease free water 1 ㎕, DTT (100 mM) 1 ㎕, SuperScript III reverse transcriptase 1 ㎕를 섞어 7 ㎕씩 각 PCR tube에 더한 후 50℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- 2)로 2회 세척한 다음 37℃, 5 % CO2 배양기에서 10분간 반응시킨 후 FBS와 DMEM 배지에 감초 추출물을 농도별 (0, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖)로 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 dinitropheny-Human Serum Albumin(DNPHSA) (2 ㎍/㎖)을 가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 반응시키고 얼음에서 냉각시키고 반응을 종결시켰다.
- Na2CO3 포화 용액 1 ㎖을 넣은 후 1시간 동안 방치 후 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 tannic acid (Sigma Co., USA)를 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 총 페놀 함량을 측정 하였다.
대상 데이터
- Rat basophilic leukemia 세포주인 RBL-2H3 세포는 한국세동주은행에서 분양받아 사용하였다. RBL-2H3 세포는 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillinstreptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 배지에서 37℃로 유지되는 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
- 감초는 2009년 6월 춘천시 소재 건재상에서 건시료로 구입하여 냉장보관하면서 사용하였다. 시료의 추출은 Choe 등 (2008)의 방법에 따라 수세한 후 10.
데이터처리
- For each gene, means with different letters differ significantly from each other (p < 0.05), as determined by Duncan's multiple range test.
- Means with different letters differ significantly from each other (p < 0.05), as determined by Duncan's multiple range test.
- 분석 결과는 평균치와 표준오차로 표기하였고, 통계처리는 SPSS (version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용 하여 one-way ANOVA 분석을 실시한 후 Duncan's multiple range test로 유의성 (p < 0.05)을 검증하였다.
이론/모형
- β-hexosaminidase 분비량 측정은 Huang 등 (2008)의 방법에 준하여 실시하였다.
- DPPH 라디칼 소거활성은 Blois (1958)의 방법에 따라 각 시료의 DPPH (2.2- diphenyl-1-picryl-hydrazyl) 라디칼에 대한 환원력을 측정하였다. 에탄올에 희석한 시료 600 ㎕에 DPPH (1.
- First-stand cDNA를 합성하기 위하여 SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen)를 이용하였다. Oligo (dT)15 primer (500 ㎍/㎖) 1 ㎕, dNTP Mix (10 mM) 1 ㎕, 추출한 RNA 1 ㎍와 RNase free water로 11 ㎕을 맞추고 65℃에서 5분간 반응시킨 후 즉시 얼음에서 냉각시켰다.
- 배양이 끝난 세포의 생존율은 Chung 등 (2005)에 의한 MTT (3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. RBL-2H3 세포를 96 well plates에 1 × 106 cells/㎖ 농도로 100 ㎕ 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 DMEM 배지에 감초 추출물을 각 농도별 (0, 100, 250, 500, 1000, 2000 ㎍/㎖)로 제조한 후 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
- 감초는 2009년 6월 춘천시 소재 건재상에서 건시료로 구입하여 냉장보관하면서 사용하였다. 시료의 추출은 Choe 등 (2008)의 방법에 따라 수세한 후 10.7배 증류수를 가하고 60℃에서 24시간 교반하면서 유효성분을 추출하였다. 이를 실온에서 방냉하고 여과한 다음 감압농축기 (rotary vaccum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)로 농축하였고, 시료를 동결 건조기 (IlShin FD 8508, Ilshin, Seoul, Korea)를 이용하여 −70℃에서 건조한 시료를 냉동보관하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu's phenol 시약을 이용한 비색법을 이용하였다(Singleton and Rossi, 1965).
성능/효과
- DNP-IgE와 HSA에 의해 활성화된 RBL-2H3 세포에서 분비된 탈과립의 양을 100%로 보았을 때 자극되지 않은 안정 상태의 세포에서는 65.5 ± 0.26% 억제율을 보였으며, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도로 감초 추출물을 처리하였을 때에는 항원과 항체에 의해 활성화된 세포를 기준으로 각각 36.1 ± 4.28%, 36.6 ± 5.84%, 35.3 ± 5.29%, 40.99 ± 2.90%로 억제율을 나타내었다.
- 1과 같다. 감초 추출물 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도 범위에서 각각 21.2%, 37.4%, 54.2%, 58.3%로 농도 의존적인 DPPH 라디컬 소거 활성을 나타내었다. 이는 Table 1에서와 같이 높은 페놀 함량이 이러한 항산화 작용에 기여한 것으로 사료되며, 페놀 화합물 함량이 높을수록 전자공여능 또한 높게 나타났다.
- 감초 추출물의 수율은 건시료 30 g을 물 추출한 후 감압 농축하여 동결 건조된 무게를 측정한 결과는 감초 추출물 6.65 g을 얻어 총 수율 22.16%로 높은 추출 효율을 보였으며, 총 페놀 함량은 1,000 ㎍/㎖의 농도에서 103.0 ㎎/g의 함량을 나타내었다 (Table 1).
- 결과적으로 감초 추출물 100~1,000 ㎍/㎖의 농도에서는 항천식 활성 측정 시 세포사멸에 큰 영향을 주지 않는 것으로 분석되었다. 따라서 이하의 실험에서는 감초 추출물의 0, 100, 250, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도 범위에서 세포 내 β-hexosaminidase 분비와 Th2 cytokine의 발현 억제 정도를 확인하였다.
- 06%로 유의적인 감소를 나타내었다. 결과적으로 감초 추출물이 천식 병리와 관련된 Th2 cell 관련 cytokine을 억제함으로써 치료 효과를 나타낼 것으로 사료된다.
- 그러나 감초 추출물 100 ㎍/㎖을 처리하였을 때 IL4와 IL-13 mRNA 발현량은 각각 25.4 ± 0.04%, 17.7 ± 0.02% 억제되었으며, 1,000 ㎍/㎖ 에서 mRNA 발현은 각각 38 ± 0.17%, 30 ± 0.06%로 유의적인 감소를 나타내었다.
- IL-4와 IL-13은 Th2에서 분비되는 세포로 B-림프구의 증식과 항체 생산에 관여하며, IL-13 수용체는 IL-4 수용체의 a-사슬을 공유하고 있어 IL-4와 유사한 기능을 가지는 것으로 보고되어 있다 (Hogan and Foster, 1997). 본 실험 결과를 보면 농도별 차이는 있지만 IL-4와 IL-13 mRNA 발현의 전체 경향은 유사한 것을 확인할 수 있었다.
- 2와 같다. 아무런 처리를 하지 않은 세포의 생존율은 100% 이었으며, 감초 추출물 100, 250 ㎍/㎖의 농도를 처리한 세포에서 각각 99.2%, 100%를 나타내어 유의성 있는 변화는 없었다. 한편 감초 추출물 2000 ㎍/㎖ 농도에서는 83.
- 6 ㎎/g으로 가장 적은 폴리페놀 함량을 나타낸다고 보고하였다. 위 결과와 비교하였을 때 본 실험에 사용된 감초 물 추출물은 상당히 높은 양의 페놀 함량을 함유하고 있었으며, 이는 시료 추출 온도와 방법, 표준시료의 차이로 인한 것이라 사료된다.
- Choe 등 (2008)은 7종의 한약재 물 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 알아본 결과 산수유는 농도 의존적으로 라디칼 소거활성이 감소되어 positive control인 L-ascorbic acid와 비슷한 수준의 항산화 활성을 보였으나 1,000 ppm의 산약, 천화분 물 추출물은 50% 이하의 DPPH 라디칼 소거능을 보였다고 보고하였다. 이는 본 실험에 사용한 감초 물 추출물과 같은 농도의 positive control 보다는 낮은 활성이었지만 산약, 천화분에 비교하여 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다.
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