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문제 정의
- 특히 국내의 경남지역에서는 토종도라지의 보존과 육성을 위한 정책을 추진하고 있고 도라지의 단가도 급등함에 따라 그 재배 면적이 크게 증가하였다. 본 연구에서는 토종 도라지의 순계를 보존하기 위한 조직배양 기술의 확립과 함께 분자생물학적 기술을 이용한 토종 도라지의 판별 기술을 개발하기 위한 기초연구를 수행하였다. 먼저 경남지역과 충남아산시 등의 야산에서 채종하여 수 십년간 자가 채종하여 재배하여온 농가에서 수집한 종자를 중심으로 5종의 primer를 이용하여 RAPD 분석을 수행한 결과 총 48개의 밴드를 생산하였으며, 이중 21개 밴드는 다형성을 보이는 밴드로 40.
- 이에 본 연구에서는 국내의 도라지 재배 농가를 방문하여 야산에서 수집하여 오랫 동안 자가 채종하여 재배하였다는 농가를 중심으로 종자를 수집하여 RAPD기술을 이용한 유전적인 연관관계를 우선적으로 조사하여 보았기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- RAPD결과를 근거로 하여 NTSYS -PC doftware version 2.1 프로그램을 사용하여 각 밴드의 유무를 입력한 후 최종적으로 phylogenetic tree를 도식화 하였다(Fig . 2). 전체 48개의 밴드에 대하여 계통간의 유무를 입력한 후 프로그램에 따라 dendrogram을 얻어서 계통간의 유전적 연관성을 조사한 결과 경남 함안군 주서리에서 수집한 11 -5번, 화천군에서 수집한 11 -7번과 11-8번 그리고 고성군에서 수집한 11-10번 계통들이 하나의 가장 가까운 그룹으로 조사되었다.
- Template DNA 15 ng과 프라이머 별로 5pmole을 첨가하고 PCR premix 용액(2 × reaction buffer, 2.0mM dNTP, 4 m M MgCl2, Taq polymerase)과 혼합하여 94℃에서 5분간 pre-denaturation한 후 94℃에서 30초, 32℃에서 1분, 72℃에서 1분을 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후 72℃에서 10분간 연장반응을 시킨 후 4℃에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA 밴드는 1.5% agarose gel을 이용하여 전기영동하여 그 결과를 분석하였다.
- 경남 지역 내 도라지 재배 농가를 방문하여 종자구입경로, 재배면적, 재배년수 등을 파악하였다. 수집된 종자는 초저온 냉동고, 4℃, 실온에 나누어 보관하였고, 식물체는 온실에서 재배하여 종자를 채취하도록 하였다.
- 수집된 종자들은 소규모 비닐 포장 속에 넣고 감압기로 공기를 뺀 다음 4℃에 보관하면서 일정량의 종자로부터 직접 RAPD 분석을 위한 게놈 DNA 를 분리하였다. 국내의 경남지역 및 중국에서 수집된 39종의 도라지 계통을 대상으로 1차 RAPD 분석을 수행하여 아주 유사하게 나타나는 계통은 제외하고 특별히 많은 다형성 밴드를 보이는 10계통만을 대상으로 분석을 수행하였으며 특히 야산에서 채종하여 해마다 자가 채종하여 오랫동안 재배하였다고 진술한 농가의 시료를 중심으로 Table 2에서 기술한 5종류의 프라이머를 사용하여 RAPD를 수행하여 전기영동 하여 얻은 결과를 Figure 1에 도식화하였으며, 각 프라이머별로 전체 생성된 밴드의 수, 다형성을 보이는 밴드의 수와 빈도를 조사하여 Table 3에 요약하였다. 가장 많은 다형성 밴드를 보인 프라이머는 HD 3으로 총 13개의 밴드를 형성하고 이중 10개는 계통 간 서로 다른 것으로 나타나 76.
- 본 연구에서는 국내의 도라지 재배 농가를 방문하여 최초의 종자구입 경로, 재배연수, 재배목적(채소용 또는 약용) 등을 조사하고 농가별로 종자를 수집하였다. 경남 지역은 주로 함안군, 함양군, 고성군, 의령군, 사천시, 합천군 등을 중심으로 수집하였으며 대조구로 강원도, 충남 청양군, 충북, 경북 등의 국내 지역의 농가, 시장 등에서 종자를 구입하였다.
- 경남 지역 내 도라지 재배 농가를 방문하여 종자구입경로, 재배면적, 재배년수 등을 파악하였다. 수집된 종자는 초저온 냉동고, 4℃, 실온에 나누어 보관하였고, 식물체는 온실에서 재배하여 종자를 채취하도록 하였다.
- 수집된 종자들은 소규모 비닐 포장 속에 넣고 감압기로 공기를 뺀 다음 4℃에 보관하면서 일정량의 종자로부터 직접 RAPD 분석을 위한 게놈 DNA 를 분리하였다. 국내의 경남지역 및 중국에서 수집된 39종의 도라지 계통을 대상으로 1차 RAPD 분석을 수행하여 아주 유사하게 나타나는 계통은 제외하고 특별히 많은 다형성 밴드를 보이는 10계통만을 대상으로 분석을 수행하였으며 특히 야산에서 채종하여 해마다 자가 채종하여 오랫동안 재배하였다고 진술한 농가의 시료를 중심으로 Table 2에서 기술한 5종류의 프라이머를 사용하여 RAPD를 수행하여 전기영동 하여 얻은 결과를 Figure 1에 도식화하였으며, 각 프라이머별로 전체 생성된 밴드의 수, 다형성을 보이는 밴드의 수와 빈도를 조사하여 Table 3에 요약하였다.
- 수집된 도라지 계통별로 일정량의 종자를 이용하여 cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) 방법(Doyle and Doyle, 1987)으로 게놈 DNA를 분리하였다. 액체질소를 이용하여 마쇄한 분말상태의 시료를 DNA extraction kit에 포함된 완충용액을 사용하여 회사에서 제공한 표준 방법에 따라 분리하였다. 정제된 genomic DNA 의 순도를 조사하기 위하여 일정량의 분획을 1 % agarose gel에서 전기영동을 실시하여 확인한 후 U V-spectrophotometer를 이용하여 234 nm, 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 A260/A280 값이 1.
- 전기영동 후 촬영된 gel 사진을 토대로 밴드의 유·무에 따라 밴드가 있는 경우에는 1, 밴드가 없는 경우에는 0을 부여하여 데이터화 하였으며, 이를 토대로 NTSY S-PC (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis for personal computer) software, version 2.1 (Rohlf 2000)을 이용하여 UPGMA (Unweight Pair-group Method using Arithmetic Average)에 의한 각 계통간의 similarity를 분석하여 dendrogram을 작성하였다.
- 액체질소를 이용하여 마쇄한 분말상태의 시료를 DNA extraction kit에 포함된 완충용액을 사용하여 회사에서 제공한 표준 방법에 따라 분리하였다. 정제된 genomic DNA 의 순도를 조사하기 위하여 일정량의 분획을 1 % agarose gel에서 전기영동을 실시하여 확인한 후 U V-spectrophotometer를 이용하여 234 nm, 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 A260/A280 값이 1.8-2.2 법위 그리고 A234/A260 값이 0.5-0.8 범위 내 포함 여부를 조사하여 RNA 및 단백질 등의 오염정도를 확인하여 순수한 DNA 를 사용하였다. 정제된 genomic DNA를 사용하여 RAPD분석을 위하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
- 8 범위 내 포함 여부를 조사하여 RNA 및 단백질 등의 오염정도를 확인하여 순수한 DNA 를 사용하였다. 정제된 genomic DNA를 사용하여 RAPD분석을 위하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. Template DNA 15 ng과 프라이머 별로 5pmole을 첨가하고 PCR premix 용액(2 × reaction buffer, 2.
- 증폭된 PCR 산물을 각각 1.5 % agarose gel에 전기영동하여 Red safe (IntRon, Korea)로 염색한 후 UV trans -illuminator를 이용하여 사진을 촬영하였다. 전기영동 후 촬영된 gel 사진을 토대로 밴드의 유·무에 따라 밴드가 있는 경우에는 1, 밴드가 없는 경우에는 0을 부여하여 데이터화 하였으며, 이를 토대로 NTSY S-PC (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis for personal computer) software, version 2.
대상 데이터
- 본 연구에서는 국내의 도라지 재배 농가를 방문하여 최초의 종자구입 경로, 재배연수, 재배목적(채소용 또는 약용) 등을 조사하고 농가별로 종자를 수집하였다. 경남 지역은 주로 함안군, 함양군, 고성군, 의령군, 사천시, 합천군 등을 중심으로 수집하였으며 대조구로 강원도, 충남 청양군, 충북, 경북 등의 국내 지역의 농가, 시장 등에서 종자를 구입하였다. 또한 중국에서 구입한 것도 있으며, 일부 중국에서 판매되는 말린 뿌리(길경)도 포함하였다.
이론/모형
- 수집된 도라지 계통별로 일정량의 종자를 이용하여 cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) 방법(Doyle and Doyle, 1987)으로 게놈 DNA를 분리하였다. 액체질소를 이용하여 마쇄한 분말상태의 시료를 DNA extraction kit에 포함된 완충용액을 사용하여 회사에서 제공한 표준 방법에 따라 분리하였다.
성능/효과
- RAPD결과를 통하여 얻은 다형성을 보이는 DNA 밴드를 프라이머별로 조사한 결과를 Table 4에 요약하였다. 4개의 프라이머를 사용하여 상기한 8종의 계통들을 대상으로 RAPD를 수행한 결과 총 61개의 DNA bands가 생성되었으며 이중 20개가 계통간 다형성을 보였다. HD 3 프라이머를 사용한 경우에 가장 많은 8개의 다형성 밴드를 생성하여 57.
- 5 %의 가장 낮은 다형성을 나타내었다. HD 1과 HD 4 프라이머는 각각 8개와 10개의 밴드를 형성하였으나 3개의 다형성 밴드를 보여 각각 30과 37.5 %의 다형성 빈도를 보였고 HD 2 프라이머는 총 9개의 DNA 밴드 중 4개의 밴드가 다형성을 보여 44.4 %의 다형성 빈도를 보였다.
- 국내의 경남지역 및 중국에서 수집된 39종의 도라지 계통을 대상으로 1차 RAPD 분석을 수행하여 아주 유사하게 나타나는 계통은 제외하고 특별히 많은 다형성 밴드를 보이는 10계통만을 대상으로 분석을 수행하였으며 특히 야산에서 채종하여 해마다 자가 채종하여 오랫동안 재배하였다고 진술한 농가의 시료를 중심으로 Table 2에서 기술한 5종류의 프라이머를 사용하여 RAPD를 수행하여 전기영동 하여 얻은 결과를 Figure 1에 도식화하였으며, 각 프라이머별로 전체 생성된 밴드의 수, 다형성을 보이는 밴드의 수와 빈도를 조사하여 Table 3에 요약하였다. 가장 많은 다형성 밴드를 보인 프라이머는 HD 3으로 총 13개의 밴드를 형성하고 이중 10개는 계통 간 서로 다른 것으로 나타나 76.9%의 높은 다형성 빈도를 보였다. 반면에 HD 5 프리아머는 총 8개의 밴드 중 다형성을 보이는 밴드는 단 하나로 12.
- HD 3 프라이머를 사용하여 얻은 다형성 밴드 중 장백, 으뜸백도라지, 중국에서 수집한 11-39와 12-5번에만 특이적으로 나타는 뚜렷한 밴드들을 확인할 수 있었으나 충남에서 수집한 토종 백도라지와 자색도라지라고 진술한 12-4번과 12-5번에만 특이하게 존재하는 밴드는 찾기가 어려웠다. 그러나 이들 두 계통을 비교한 결과 자색계통(12 -5번)에만 특이하게 1.0 Kb 이상의 비교적 큰 DNA밴드가 확인되었다(Fig . 3)
- 본 연구에서는 토종 도라지의 순계를 보존하기 위한 조직배양 기술의 확립과 함께 분자생물학적 기술을 이용한 토종 도라지의 판별 기술을 개발하기 위한 기초연구를 수행하였다. 먼저 경남지역과 충남아산시 등의 야산에서 채종하여 수 십년간 자가 채종하여 재배하여온 농가에서 수집한 종자를 중심으로 5종의 primer를 이용하여 RAPD 분석을 수행한 결과 총 48개의 밴드를 생산하였으며, 이중 21개 밴드는 다형성을 보이는 밴드로 40.3%의 다형성을 나타내었다. 특히 primer HD3는 총 13개의 밴드 중 10개가 계통간 다형성을 보여서 76.
- 1 (Rohlf 2000)을 이용하여 UPGMA (Unweight Pair-group Method using Arithmetic Average)에 의한 각 계통간의 similarity를 분석하여 dendrogram을 작성하였다. 모든 PCR실험은 3회 이상 반복하였다.
- (2012)은 우리나라와 중국에서 수집된 8종의 도라지계통을 대상으로 22개의 다형성 패턴을 보이는 microsatellite marker를 개발하였다고 하였으며 향후 이들 마커들은 도라지계통의 유전적 다양성에 관한 연구에 유용하게 이용될 수 있을 것이라고 보고하였다. 본 연구에서도 국내의 경남 지역 내 함안군, 함양군, 사천시 등과 충남아산시의 인근야산에서 종자를 채종하여 오랫동안 자가 채종을 하여 재배하여 온 계통들을 대상으로 국내의 다른 지역 즉 강원도, 충남, 제주도 등에서 수집한 계통과 중국에서 수집한 계통들과 비교 조사한 결과로서, 일부 계통은 지역별로 서로 다른 유전적인 유연관계를 보이는 것으로 조사되었다. 그러나 향후 보다 많은 수집 계통들을 대상으로 하여 보다 진보된 분자생물학적기술을 도입하여 추가연구를 수행하여야 정확한 기원을 판별할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 2). 전체 48개의 밴드에 대하여 계통간의 유무를 입력한 후 프로그램에 따라 dendrogram을 얻어서 계통간의 유전적 연관성을 조사한 결과 경남 함안군 주서리에서 수집한 11 -5번, 화천군에서 수집한 11 -7번과 11-8번 그리고 고성군에서 수집한 11-10번 계통들이 하나의 가장 가까운 그룹으로 조사되었다. 그리고 중국에서 수집한 11 -31번과 사천시에서 수집한 11 -35번 계통이 유사한 그룹으로 cluster를 형성하였으며 여기에 함양군 가흥리에서 수집한 계통들이 유사한 그룹으로 나타났다.
- 3%의 다형성을 나타내었다. 특히 primer HD3는 총 13개의 밴드 중 10개가 계통간 다형성을 보여서 76.9%의 높은 다형성빈도를 보였다. 향후 핵 DNA 보다는 핵외 DNA를 이용한 SNP 마커의 확보 등 보다 진보된 기술을 이용한 보완연구가 수행되어야 할 것으로 사료되었다.
후속연구
- 본 연구에서도 국내의 경남 지역 내 함안군, 함양군, 사천시 등과 충남아산시의 인근야산에서 종자를 채종하여 오랫동안 자가 채종을 하여 재배하여 온 계통들을 대상으로 국내의 다른 지역 즉 강원도, 충남, 제주도 등에서 수집한 계통과 중국에서 수집한 계통들과 비교 조사한 결과로서, 일부 계통은 지역별로 서로 다른 유전적인 유연관계를 보이는 것으로 조사되었다. 그러나 향후 보다 많은 수집 계통들을 대상으로 하여 보다 진보된 분자생물학적기술을 도입하여 추가연구를 수행하여야 정확한 기원을 판별할 수 있을 것으로 사료되었다. 특히 최근 중국 등에서 대량의 도라지 종자가 유입되어 국내의 대단위 지역에서 재배됨에 따라 혼재된 상태에서 토종 종자의 기원을 찾기가 어려울 것으로 사료되며, 향후 핵외 유전을 하는 엽록체의 게놈을 분리하여 염기서열 분석을 통한 SNP를 상호 비교 분석하는 연구가 수반되어야 할 것으로 사료되었다.
- 그러나 실제로는 국내에서 자생하여 토착화된 토종 도라지 종자의 구분이 모호하고 품종으로 등록된 백도라지등도 타가수정에 의하여 순계를 보존하기가 어려운 실정이다. 따라서 조직배양기술에 의한 토종 순계의 보존과 중국 및 일본종과의 구분이 가능한 분자생물학적 마커의 개발에 관한 연구가 수반되어야 경남도에서 추진하고 있는 토종 보존 육성정책을 성공적으로 뒷받침 할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 향후 이러한 증가추세는 지속될 것으로 보이며 도라지 재배농가 호수와 면적은 늘어갈 것으로 전망된다. 따라서 중국 및 일본산과의 차별화와 함께 우수한 품종을 육성하고, 잡종강세를 이용한 F1 종자의 생산기술의 확립 등이 선행되어야 할 것으로 조사되었다. 이러한 연구는 재래종 또는 토종 등 다양한 유전자원의 확보가 선행되어야 하고 이를 보존하는 기술이 개발되어야 한다.
- 그러나 향후 보다 많은 수집 계통들을 대상으로 하여 보다 진보된 분자생물학적기술을 도입하여 추가연구를 수행하여야 정확한 기원을 판별할 수 있을 것으로 사료되었다. 특히 최근 중국 등에서 대량의 도라지 종자가 유입되어 국내의 대단위 지역에서 재배됨에 따라 혼재된 상태에서 토종 종자의 기원을 찾기가 어려울 것으로 사료되며, 향후 핵외 유전을 하는 엽록체의 게놈을 분리하여 염기서열 분석을 통한 SNP를 상호 비교 분석하는 연구가 수반되어야 할 것으로 사료되었다.
- 그 이유로는 첫째, 도라지 단가가 급등하였으며, 둘째, 소비자들의 수요가 지속적으로 증가하고 있다는 점, 셋째, ｢경상남도 토종농산물 보존·육성에 관한 조례｣의 발표에 따른 적극적인 정책을 추진하고 있기 때문이라고 사료된다. 향후 이러한 증가추세는 지속될 것으로 보이며 도라지 재배농가 호수와 면적은 늘어갈 것으로 전망된다. 따라서 중국 및 일본산과의 차별화와 함께 우수한 품종을 육성하고, 잡종강세를 이용한 F1 종자의 생산기술의 확립 등이 선행되어야 할 것으로 조사되었다.
- 9%의 높은 다형성빈도를 보였다. 향후 핵 DNA 보다는 핵외 DNA를 이용한 SNP 마커의 확보 등 보다 진보된 기술을 이용한 보완연구가 수행되어야 할 것으로 사료되었다.
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