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문제 정의
- 본 연구에서는 가축의 장내에서 유산균의 효능과 유기산의 효능을 동시에 발현시키고자 하는 목적으로 젖산에 대한 내성을 부여하는 인공변이를 통하여 젖산 생성이 증가된 유산균 변이주를 제작하고, 육계(broiler)를 대상으로 하는 사양시험을 통하여 유기산 생성이 증가된 유산균 변이주가 가축의 생산성 증가에 미치는 영향을 보고자 하였다.
- 본 연구에서는 곡물와 콩류에 폭넓게 분포되어 있으며 수확, 저장, 운송 중에 아플라톡신 등의 독소를 생성하는(14,15) 곰팡이 A. flavus ATCC 22546과 사람에게 감염되어 α-hemolysin 등 독소를 생성하여 여러 가지 병원성 질환을 일으킬 수 있는 E. coli ATCC 25922에대한 유산균 변이주 L. paracasei ML-7의 성장 억제 효과를 평가하였다.
제안 방법
- A. flavus는 동일한 방법으로 실험을 하였으며, 균주의 농도는 hematocytometer를 이용하여 1×104 conidias/mL로 희석하였다.
- MRS agar 배지에서 1차로 선별된 균주들로부터 유기산 생성이 증강된 변이주를 스크리닝하기 위해 methyl red 지시약을 사용하였다. 선별된 콜로니들을 멸균된 이쑤시개를 사용하여 methylred 지시약이 10 ppm이 첨가 된 MRS agar에 가볍게 접종하였으며, 페트리디쉬상의 콜로니 주변 색깔이 붉은 색으로 빠르게 변하는 균주를 선별하였다(9).
- UV를 조사한 후 약 100개의 콜로니를 얻은 plate 10장을 수집, 총 1,000개의 콜로니를 선택하고 지시약을 이용하여 선별하였다. 각 plate당 5개의 콜로니를 선별하여 pH 저감 배지 성장과 유기산 생성능력을 분석하여 최종적으로 한 개의 균체를 분리하였다. 분리한 변이주를 액체 배지에 배양 후 80% glycerol에 동량 비율로 혼합하여 -80℃에서 보관하였다.
- 김치로부터 분리, 선별한 유산균 L. paracasei LS-2에 UV 조사 및 L. paracasei LS-2균주가 성장하지 않는 pH 3.5 MRS agar 배지에서 성장하는 변이주를 선별함으로써 변이주인 L. paracasei ML-7를 선별하였다. 선별된 변이주 L.
- 5에서는 성장하지 않는 것을 확인하였다(data not shown). 따라서 UV 조사에 의해 L. paracasei LS-2의 변이를 유발한 뒤에 pH 3.5 MRS agar 배지에서 성장하는 콜로니들을 수집하였다. 수집된 콜로니들의 유기산 생성 능력을 평가하기 위하여 methyl red가 포함된 MRS agar 배지(pH 7.
- 모든 균주를 두 번 활성화를 거친 후 실험에 사용하였고, A. flavus는 30℃, 호기적 조건에서 배양하였으며, E. coli는 37℃, 호기적 조건에서 배양하였다. 사용한 균주는 Table 1과 같다.
- 변이주를 선별하기 위해 -80℃에서 보관중인 모균주 L. paracasei LS-2를 MRS agar에 18시간, 혐기적 조건에서 배양 및 활성화시킨 후, MRS 액체배지에 18시간 배양하였다. 액체배지에서 배양한 균체의 농도는 visible spectrophotometer를 이용하여 600nm에서 흡광도(O.
- 실험사료는 National Research Council (NRC, Washington, DC, USA) 사양 표준에 의한 육계 전기 사료를 사용하였으며, 각 그룹의 사료 조성은 Table 2와 같다. 사료 섭취량은 3일 단위로 기록하였으며, 점등시간은 1일 23시간이 되도록 하였다. 조사항목 및 분석 방법은 처리구간의 사양 성적을 산출하기 위하여 각 처리구의 체중 증가량(weight gain, G)과 사료 섭취량(feed intake, F)을 실험 개시일(2일령) 및 종료일(23일령)에 측정하여 기록하고, 이에 따라 사료 요구율(feed conversion rate, F/G)을 산출하여 평가하였다(12).
- 선별된 L. paracasei ML-7 균주의 MRS 액체배지(pH 6.5)에서의 성장곡선을 확인하였다(Fig. 1). 선별균주인 L.
- 선별된 균주들이 pH저감 배지에서의 성장성을 확인하기 위해 lactic acid를 이용하여 pH를 5부터 3.5까지 낮춘 MRS agar 배지를 이용하였다. 액체배지에서의 균체 성장은 MRS 액체배지에서 측정하였으며, 성장정도는 spectrophotometer에 의한 600 nm에서의 흡광도 및 serial dilution에 의한 생균수 측정을 병행하였다.
- paracasei ML-7를 선별하였다. 선별된 변이주 L. paracasei ML-7의 유기산 생성능력, 병원성 미생물의 생육 저해 능력, 육계에서의 증체 및 사료 효율 개선효과를 시험하였다. 변이주인 L.
- MRS agar 배지에서 1차로 선별된 균주들로부터 유기산 생성이 증강된 변이주를 스크리닝하기 위해 methyl red 지시약을 사용하였다. 선별된 콜로니들을 멸균된 이쑤시개를 사용하여 methylred 지시약이 10 ppm이 첨가 된 MRS agar에 가볍게 접종하였으며, 페트리디쉬상의 콜로니 주변 색깔이 붉은 색으로 빠르게 변하는 균주를 선별하였다(9).
- 세 종의 유산균 L. paracasei ML-7, L. paracasei LS-2 및 L. paracasei ATCC 27216을 MRS 배지(pH 6.5)에서 stationary phase에 충분히 도달할 수 있도록 48시간 배양하고 배지 중에 축적된 lactic acid, acetic acid, succinic acid를 HPLC로 분석하였다. 이들 균주들이 생산하는 유기산 중에서 lactic acid의 생산이 가장 많았으며, L.
- 5 MRS agar 배지에서 성장하는 콜로니들을 수집하였다. 수집된 콜로니들의 유기산 생성 능력을 평가하기 위하여 methyl red가 포함된 MRS agar 배지(pH 7.2 by NaOH)에 접종하여 배양 중에 콜로니 주변이 가장 빠르게 적색으로 변하는 균주를 선발하여 L. paracasei ML-7으로 명명하였다.
- 시료 중 유기산 함량 분석은 HPLC (Waters Co., Milford, MA, USA)로 분석하였으며, ODS column (Reversedphase C18 column, Prevail Organic Acid, 4.6×150 nm, 3μm, Alltech Co., Lexington, KY, USA)을 사용하였다.
- paracasei LS-2를 MRS agar에 18시간, 혐기적 조건에서 배양 및 활성화시킨 후, MRS 액체배지에 18시간 배양하였다. 액체배지에서 배양한 균체의 농도는 visible spectrophotometer를 이용하여 600nm에서 흡광도(O.D., optical density)를 측정하여, 0.1로 맞춘 뒤, MRS agar 배지에 도말하여 유산균의 치사율이 99.9%가 되는 조건인 10 W UV lamp 30 cm 거리에서 3분간 조사하여 돌연변이를 유발하였다(8). UV를 조사한 후 약 100개의 콜로니를 얻은 plate 10장을 수집, 총 1,000개의 콜로니를 선택하고 지시약을 이용하여 선별하였다.
- 5까지 낮춘 MRS agar 배지를 이용하였다. 액체배지에서의 균체 성장은 MRS 액체배지에서 측정하였으며, 성장정도는 spectrophotometer에 의한 600 nm에서의 흡광도 및 serial dilution에 의한 생균수 측정을 병행하였다.
- 1일령의 육계(Ross 308) 수평아리를 구입하여 1일간 적응기간을 거친 후 2일령 육계 150마리를 3그룹으로 나눈 후 각각 10마리씩 5반복으로 실험하였다. 유산균은 MRS 액체배지에서 48시간 동안 배양한 배양액을 실험 사료에 0.3% 혼합하여 급여하였으며, 사료는 물과 함께 3주간 자유 급식토록 하였다. 실험사료는 National Research Council (NRC, Washington, DC, USA) 사양 표준에 의한 육계 전기 사료를 사용하였으며, 각 그룹의 사료 조성은 Table 2와 같다.
- flavus는 동일한 방법으로 실험을 하였으며, 균주의 농도는 hematocytometer를 이용하여 1×104 conidias/mL로 희석하였다. 유산균의 E. coli와 A. flavus에 대한 억제 효과는 각각의 성장 조건에 따라 24-48시간 동안 배양한 후에 관찰하였다(11).
- 사료 섭취량은 3일 단위로 기록하였으며, 점등시간은 1일 23시간이 되도록 하였다. 조사항목 및 분석 방법은 처리구간의 사양 성적을 산출하기 위하여 각 처리구의 체중 증가량(weight gain, G)과 사료 섭취량(feed intake, F)을 실험 개시일(2일령) 및 종료일(23일령)에 측정하여 기록하고, 이에 따라 사료 요구율(feed conversion rate, F/G)을 산출하여 평가하였다(12).
대상 데이터
- 1일령의 육계(Ross 308) 수평아리를 구입하여 1일간 적응기간을 거친 후 2일령 육계 150마리를 3그룹으로 나눈 후 각각 10마리씩 5반복으로 실험하였다. 유산균은 MRS 액체배지에서 48시간 동안 배양한 배양액을 실험 사료에 0.
- paracasei sub. Paracasei ATCC 27216 균주와 Escherichia coli ATCC 25922 및 Aspergillus flavus ATCC 22546 등의 균주 들은 한국생명자원센터(Korean Col-lection for Type Culture, Daejeon, Korea)에서 분양 받아 사용하였다.
- 9%가 되는 조건인 10 W UV lamp 30 cm 거리에서 3분간 조사하여 돌연변이를 유발하였다(8). UV를 조사한 후 약 100개의 콜로니를 얻은 plate 10장을 수집, 총 1,000개의 콜로니를 선택하고 지시약을 이용하여 선별하였다. 각 plate당 5개의 콜로니를 선별하여 pH 저감 배지 성장과 유기산 생성능력을 분석하여 최종적으로 한 개의 균체를 분리하였다.
- 미생물 배양에 사용한 MRS, LB 배지는 Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 제품을 사용하였고, lactic acid, acetic acid, succinic acid등의 표준 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 균주는 김치로부터 분리된 유산균인 Lacto-bacillus paracasei LS-2를 모균주로 사용하였다(특허 균주 기탁 번호 KFCC11490P). 이 밖에 L.
- 3% 혼합하여 급여하였으며, 사료는 물과 함께 3주간 자유 급식토록 하였다. 실험사료는 National Research Council (NRC, Washington, DC, USA) 사양 표준에 의한 육계 전기 사료를 사용하였으며, 각 그룹의 사료 조성은 Table 2와 같다. 사료 섭취량은 3일 단위로 기록하였으며, 점등시간은 1일 23시간이 되도록 하였다.
이론/모형
- 사용한 균주는 Table 1과 같다. 선별된 유산균의 E. coli와 A. flavus에 대한 성장 억제 효과를 보기 위해서 overlay assay법을 이용하였다. 먼저 유산균을 활성화 한후 배지의 삼등분이 되는 지점에 루프를 이용하여 2 cm의 길이로 11자 형태로 streaking하여 24-48시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- 13 g/L의 lactic acid 를 생산하였다(Table 3). 낮은 pH의 배지에서 모균주에 비해 성장성이 높은 유산균 변이주를 선별하는 것, 즉, 보다 높은 농도의 젖산에 대한 내성 변이주를 선별하는 것은 일정량의 발효배 지당 젖산의 생산을 증가시키는 변이주의 선별과 관련이 있다는 결론이다. 하지만 1차 대사산물인 유기산의 생산이 균주의 성장 증가에 기인한 것인지, 균체의 유기산 생성능력이 증가한 것인지의 여부는 명확하지 않아 추가적인 실험이 필요하다.
- 하지만 유산균은 세계의 연구결과를 토대로 인체를 비롯한 축산에서도 면역 개선과 장내 환경을 개선, 기타 유해균을 억제하여 체내건강에 이로운 효과를 주는 것은 자명하다. 따라서, 몇몇 연구 결과의 불일치는 생균을 다루는 연구에서 각각의 배양 조건, 생균수, 식이방법 등의 차이가 있을 수 있으며, 가축의 생육환경조건에 따라 결과가 상이하게 달라질 수 있을 거라 생각한다.
- paracasei LS-2에 비하여 MRS 배지에서 성장속도가 증가되었으며, 유기산 생성도 증가되었다. 또한 L. paracasei ML-7은 병원성 미생물인 E. coli ATCC 25922 (α-hemolysin producing E. coli)와 A. flavus ATCC 22546에 대한 생육 저해 능력이 모균주인 L. paracasei LS-2에 비해 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 육계를 대상으로 하는 사양시험에서 변이주 L.
- 변이주 선별을 위하여 L. paracasei LS-2 균주가 젖산으로 pH를 조절한 MRS agar 배지에서 성장하는지를 실험한 결과(13), pH 3.7에서 미약하게 성장하고, pH 3.5에서는 성장하지 않는 것을 확인하였다(data not shown). 따라서 UV 조사에 의해 L.
- paracasei ML-7의 유기산 생성능력, 병원성 미생물의 생육 저해 능력, 육계에서의 증체 및 사료 효율 개선효과를 시험하였다. 변이주인 L. paracasei ML-7는 모균주인 L. paracasei LS-2에 비하여 MRS 배지에서 성장속도가 증가되었으며, 유기산 생성도 증가되었다. 또한 L.
- paracasei ML-7을 급여한 처리구에서 증체량 개선 및 사료효율이 개선됨을 확인하였다. 본 결과로부터 유산균의 인공변이로부터 유기산 생산 증가 및 그에 따른 가축 사양 성적 개선이 가능한 변이주의 제작이 가능함을 확인할 수 있었다.
- paracasei ML-7을 급여한 처리구의 경우 다소 증가되는 경향을 확인하였다. 사료 효율의 경우에도 L. paracasei ML-7을 급여한 처리구에서 다소 개선되는 경향을 확인할 수 있었다. 변이주의 첨가로 인해 이러한 개선효과는 lactic acid production의 증가에 의한 결과라 생각된다.
- 2%가 개선되는 효과를 확인하였다. 사료섭취량은 대조군과 L. paracasei LS-2를 급여한 처리구에서는 거의 같은 수치를 보였지만, L. paracasei ML-7을 급여한 처리구의 경우 다소 증가되는 경향을 확인하였다. 사료 효율의 경우에도 L.
- 1). 선별균주인 L. paracasei ML-7 변이주가 모균주인 L. paracasei LS-2 및 공시균주 L. paracasei ATCC 27216에 비해 성장이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 유기산 생산이 증가된 변이주 L. paracasei ML-7 균주의 급여가 육계 성장에 미치는 영향을 평가한 결과, 유산균을 급여한 처리구들이 급여하지 않은 처리구에 비하여 성장이 잘되는 경향을 확인할 수 있었으며, 변이주인 L. paracasei ML-7을 급여한 처리구가 모균주인 L. paracasei LS-2를 급여한 처리구에 비해 증체량 및 사료섭취량이 증진되었다(Table 4). 증체량의 경우 유산균을 급여하지 않은 대조구에 비해 L.
- paracasei ML-7의 성장 억제 효과를 평가하였다. 유산균 L. paracasei LS-2와 L. paracasei ML-7의 A. flavus ATCC 22546과 E. coli ATCC 25922에 대한 성장저해를 overlay assay로 확인한 결과, L. paracasei LS-2 및 L. paracasei ML-7 균주 모두 A. flavus ATCC 22546과 E. coli ATCC 25922의 성장을 억제시켰으며, L. paracasei LS-2에 비해 L. paracasei ML-7의 성장저해환이 커지는 것을 확인할 수 있었다. A.
- paracasei LS-2에 비해 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 육계를 대상으로 하는 사양시험에서 변이주 L. paracasei ML-7을 급여한 처리구에서 증체량 개선 및 사료효율이 개선됨을 확인하였다. 본 결과로부터 유산균의 인공변이로부터 유기산 생산 증가 및 그에 따른 가축 사양 성적 개선이 가능한 변이주의 제작이 가능함을 확인할 수 있었다.
- 이들 균주들이 생산하는 유기산 중에서 lactic acid의 생산이 가장 많았으며, L. paracasei ATCC 27216은 0.55 g/L, L. paracasei LS-2는 0.61 g/L의 lactic acid를 생산하였으며 변이주인 L. paracasei ML-7에서는 이보다 약 2배 정도 많은 1.13 g/L의 lactic acid 를 생산하였다(Table 3).
- paracasei LS-2를 급여한 처리구에 비해 증체량 및 사료섭취량이 증진되었다(Table 4). 증체량의 경우 유산균을 급여하지 않은 대조구에 비해 L. paracasei LS-2를 급여한 경우 약 1.9%, L. paracasei ML-7를 급여한 경우 6.2%가 개선되는 효과를 확인하였다. 사료섭취량은 대조군과 L.
후속연구
- 낮은 pH의 배지에서 모균주에 비해 성장성이 높은 유산균 변이주를 선별하는 것, 즉, 보다 높은 농도의 젖산에 대한 내성 변이주를 선별하는 것은 일정량의 발효배 지당 젖산의 생산을 증가시키는 변이주의 선별과 관련이 있다는 결론이다. 하지만 1차 대사산물인 유기산의 생산이 균주의 성장 증가에 기인한 것인지, 균체의 유기산 생성능력이 증가한 것인지의 여부는 명확하지 않아 추가적인 실험이 필요하다.
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