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문제 정의
- 본 연구에서 선발된 항균활성이 우수한 균주가 김치 종균으로 사용되기 위해서는 김치발효 환경에 잘 적응해야 함으로 이들 균주의 내산성, 내염성, 저온생육 가능성을 분석해보았다. 식품공전에 따르면 냉장보관 제품의 보존온도는 0~10℃로 되어 있으며, 보통 상품김치의 유통온도는 10℃ 부근으로 알려져 있다.
- sakei 두 균주 모두에 대해 생육억제능을 나타낸 보고는 없었다. 본 연구에서는 기존 종균 관련 연구 결과들을 고려하여 김치의 저장성을 증가시키기 위한 일환으로 김치발효과정 중 과도한 산생성에 관여하는 균주를 지시균(indicator strain)으로 선정하고 지시균의 성장을 억제할 수 있는 항균활성을 지닌 균주를 적숙기 김치로부터 선발한 다음, 이들 균주 중 김치 환경의 특수성을 고려한 pH, 염도, 저온의 조건에서 잘 생육할 수 있는 균주를 최종적으로 선발하여 김치종균으로 이용하고자 하였다.
- 김치는 살균공정 없이 유통되기 때문에 유통과정에서도 발효가 진행되는 특성을 가지고 있어 김치의 산도가 계속 증가하여 김치의 상품성이 저하되는 문제점을 안고 있다. 본 연구에서는 김치발효과정 중 과도한 산생성에 관여하는 균주 선발과 더불어 이들 균주의 성장을 억제할 수 있는 항균활성을 지닌 균주를 김치로부터 선발하고자 하였다. 우선 김치과 숙 관련 균주를 선발한 결과 Lb.
제안 방법
- 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 추출된 genomic DNA를 template로 하여 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', forward), 1492R(5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3', reverse) primer를 이용하여 PCR을 진행하였다(14).
- 45 μm membrane filter(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 뒤 100 μL를 준비된 well에 가하였다. 30℃에서 2일간 배양하여 생육 저지환의 생성을 확인하였으며 항균활성의 정도는 배양 후 생성된 clear zone의 크기를 측정하여 나타내었다.
- 얻어진 PCR product는 sequencing을 위하여 purification kit(iNtRON Biotechnology, Daejeon, Korea)를 이용하여 정제하였다. DNA 염기서열은 ABI PRISM 3700 DNA analyzer(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였으며, 이것을 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)를 이용하여 분리균주를 동정하였다. 또한, 이들 균주의 생화학적 특성을 알아보고자 API 시스템(API system, bioMérieux, La Balme-les-Grottes, France)을 이용하여 분석하였다.
- sakei CK0153, Lb. sakei CK0154에 대해서 항균활성을 조사한 결과 두 균주가 지시균에 대해서 우수한 항균활성을 나타냄으로써 최종적으로 선발하여 동정을 수행하였다(Fig. 1, Table 1). 지시균에 대한 생육억제능이 우수했던 두 균주에 대해 16S rDNA 염기 서열 분석과 API kit를 이용하여 동정한 결과(Table 2), Lactococcus lactis subsp.
- 거즈를 이용하여 김치국물에 있는 고형분을 제거하고 순차적으로 희석한 뒤 MRS(Lactobacilli MRS agar, BD Difco, Sparks, MD, USA)에 0.2% BPB(bromophenol blue) 지시약 1%를 넣어 제조한 MRS-BPB 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 BD GasPak™ EZ(BD Difco)를 사용하여 혐기적 조건으로 배양한 다음 colony를 분리하였다.
- 김치 종균으로 사용했을 때 김치의 적숙상태를 오랫동안 유지시키기 위한 일환으로 배양액의 pH가 높고 항균활성이 높은 균주를 선발하고자 적숙기 김치로부터 유산균들을 분리하였다. 김치유산균의 분리방법은 상기 배양액의 pH가 낮은 유산균의 분리방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
- 김치의 pH를 과도하게 저하시켜 김치의 품질을 손상시키는 균주를 분리하고자 20℃와 4℃에서 각각 4일, 3개월간 발효시킨 발효 후기단계의 김치 및 묵은지 시료로부터 유산균을 분리하였다. 거즈를 이용하여 김치국물에 있는 고형분을 제거하고 순차적으로 희석한 뒤 MRS(Lactobacilli MRS agar, BD Difco, Sparks, MD, USA)에 0.
- 항균활성 우수균주의 김치 환경 내 적응 가능성을 알아보고자 내산성, 내염성, 저온생육 가능성을 측정하였다. 내산성 시험은 pH를 3, 3.5, 4로 조절한 MRS배지에 전배양한 균주를 배양액의 1% 농도로 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 생균수를 측정하였다(15). 내염성 실험은 MRS 액체배지에 1%, 3%, 5%의 NaCl을 첨가한 후 전배양한 균주 배양액을 1% 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 NaCl을 첨가하지 않은 대조군의 생균수와 비교하여 생존율을 계산하였다.
- 5, 4로 조절한 MRS배지에 전배양한 균주를 배양액의 1% 농도로 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 생균수를 측정하였다(15). 내염성 실험은 MRS 액체배지에 1%, 3%, 5%의 NaCl을 첨가한 후 전배양한 균주 배양액을 1% 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 NaCl을 첨가하지 않은 대조군의 생균수와 비교하여 생존율을 계산하였다. 저온생육 가능성은 선발한 균주를 MRS 액체배지에 접종하여 4℃에서 배양하며 1일 간격으로 600 nm에서 흡광도를 측정하며 저온 생육성을 살펴보았다.
- 또한, 이들 균주의 생화학적 특성을 알아보고자 API 시스템(API system, bioMérieux, La Balme-les-Grottes, France)을 이용하여 분석하였다.
-
김치로부터 배양액의 pH가 낮은 유산균의 선발
발효 후기단계의 김치 및 묵은지에서 분리한 유산균들 중에서 배양액의 pH가 낮은 균주를 분리하고자 MRS-BPB 고체배지를 이용하여 100여개의 균주를 분리한 다음, 이들 균주를 MRS broth에 순수배양한 후 pH를 측정하여 다른 균들보다 상대적으로 배양액의 pH가 낮았던 6균주(pH 3.7~3.9)를 김치의 과숙에 관여하는 균주로 간주하여 지시균(indicator strain)으로 선발하였다. 이들 균주들은 16S rDNA 분석을 통해서 동정한 결과 Lb.
- 분리균주의 항균활성을 측정하기 위해 MRS 고체배지에 지시균 배양액 100 μL를 0.7% (v/v) soft agar에 접종하여 중층한 후 구멍을 뚫어 well을 준비하였다.
- 김치유산균의 분리방법은 상기 배양액의 pH가 낮은 유산균의 분리방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리된 유산균은 MRS broth에 순수배양한 후(30℃, 24시간) 배양액의 pH가 높은 균주들을 분리하고 이들의 항균활성 특성을 분석하였다.
- PCR 조건은 95℃에서 1분간 denaturation, 45℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초간 extension으로 30 cycle을 수행하였다. 얻어진 PCR product는 sequencing을 위하여 purification kit(iNtRON Biotechnology, Daejeon, Korea)를 이용하여 정제하였다. DNA 염기서열은 ABI PRISM 3700 DNA analyzer(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였으며, 이것을 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)를 이용하여 분리균주를 동정하였다.
- 또한, 이들 균주의 생화학적 특성을 알아보고자 API 시스템(API system, bioMérieux, La Balme-les-Grottes, France)을 이용하여 분석하였다. 우선 균체를 McFarland 표준 용액 No.2(McFarland Standard Solution No.2)의 농도로 균질화시킨 후, API 50 CHL kit에 상기 배양액을 넣고 30℃에서 48시간 동안 배양시켜 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인하였다.
- 내염성 실험은 MRS 액체배지에 1%, 3%, 5%의 NaCl을 첨가한 후 전배양한 균주 배양액을 1% 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 NaCl을 첨가하지 않은 대조군의 생균수와 비교하여 생존율을 계산하였다. 저온생육 가능성은 선발한 균주를 MRS 액체배지에 접종하여 4℃에서 배양하며 1일 간격으로 600 nm에서 흡광도를 측정하며 저온 생육성을 살펴보았다.
- 항균활성 우수균주의 김치 환경 내 적응 가능성을 알아보고자 내산성, 내염성, 저온생육 가능성을 측정하였다. 내산성 시험은 pH를 3, 3.
- 항균활성이 우수하여 선발된 균주는 MRS broth에 배양 시킨 후 genomic DNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Daejeon, Korea)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 1% agarose gel을 이용하여 확인하였다.
대상 데이터
- sakei CK0153과 Lb. sakei CK0154도 경기대로부터 분양받아 지시균에 포함시켜 실험에 사용하였다.
- 2% BPB(bromophenol blue) 지시약 1%를 넣어 제조한 MRS-BPB 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 동안 BD GasPak™ EZ(BD Difco)를 사용하여 혐기적 조건으로 배양한 다음 colony를 분리하였다. 분리된 유산균은 MRS broth에 순수배양한 후(30℃, 24시간) 이들의 pH를 측정하여 다른 균들보다 상대적으로 배양액의 pH가 낮았던 균주를 김치의 과숙에 관여하는 균주로 간주하여 지시균으로 실험에 사용하였다. 그리고 김치발효 후기의 우점종으로 알려진 Lb.
- 항균활성 시험은 agar-well diffusion assay 방법(13)을 사용하여 김치 과숙 관련 지시균주에 대해서 분리균주들의 생육저해활성을 확인하였다. 실험에 사용한 균주들은 MRS broth에 접종한 후 30℃에서 18시간 동안 전배양한 후, MRS 액체배지에 전배양액 1%를 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 사용하였다. 분리균주의 항균활성을 측정하기 위해 MRS 고체배지에 지시균 배양액 100 μL를 0.
이론/모형
- 항균활성 시험은 agar-well diffusion assay 방법(13)을 사용하여 김치 과숙 관련 지시균주에 대해서 분리균주들의 생육저해활성을 확인하였다. 실험에 사용한 균주들은 MRS broth에 접종한 후 30℃에서 18시간 동안 전배양한 후, MRS 액체배지에 전배양액 1%를 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 사용하였다.
성능/효과
- lactis, Lb. brevis 두 균주 모두 pH 3.5에서의 내산성, 3% NaCl에서의 내염성, 4℃에서의 생육가능성을 나타내었다. Lee와 Lee(12)는 김치종균이 갖추어야 할 조건으로 김치발효 초기 및 적숙기의 우점종이어야 하며, 산생성량이 적고 청량감을 부여하는 hetero 발효형 유산균, 내산성 보유, 김치발효 후기에 우점하는 homo 발효형 Lactobacillus 속 유산균에 대해 생육억제능을 지닌 균주가 적합하다고 하였는데, 본 연구에서 선발된 항균활성 보유 균주들이 위의 요건들을 일부 갖추고 있는 것으로 나타났다.
- lactis, Lb. brevis 두 균주가 항균활성이 우수한 것으로 나타났다. 이들 균주의 김치 종균으로서의 적용 가능성을 살펴본 결과 모든 균주가 pH 3.
- lactis 균주가 Lb. brevis에 비해 다소 느린 증식율을 나타내었지만 두 균주 모두 증식능이 있는 것으로 판단되었다. 최종 선발된 Lc.
- plantarum, Lb. sakei, P. pentosaceus 균주에 대해 생육억제능을 나타냄으로써 기존에 보고된 김치종균들에 비해 우수한 것으로 판단되었다.
- brevis 두 균주가 항균활성이 우수한 것으로 나타났다. 이들 균주의 김치 종균으로서의 적용 가능성을 살펴본 결과 모든 균주가 pH 3.5에서의 내산성, 3% NaCl에서의 내염성, 4℃에서의 생육가능성을 나타내었다.
후속연구
- 8을 나타내었던 Lb. plantarum 균주들보다는 다소 높았지만 저온에서 발효시킨 김치 적숙기의 pH가 4.2~4.5인 점을 감안하다면 homo 발효형 유산균인 이들 P. pentosaceus 균들도 김치를 과도하게 시어지게 하는데 어느 정도 기여를 할 것으로 생각되었다.
- Lee와 Lee(12)는 김치종균이 갖추어야 할 조건으로 김치발효 초기 및 적숙기의 우점종이어야 하며, 산생성량이 적고 청량감을 부여하는 hetero 발효형 유산균, 내산성 보유, 김치발효 후기에 우점하는 homo 발효형 Lactobacillus 속 유산균에 대해 생육억제능을 지닌 균주가 적합하다고 하였는데, 본 연구에서 선발된 항균활성 보유 균주들이 위의 요건들을 일부 갖추고 있는 것으로 나타났다. 향후본 연구에서 선발된 균주에 대하여 생육저해활성 물질 및 작용기작 구명, 타 균주와 혼합 배양 시 길항작용 여부, 안전성 시험 등을 거쳐 김치 적용 실험을 진행할 예정이다.
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