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문제 정의
- 가 반응하는 Fenton's reaction에 의해 생성되어진 hydroxyl radical이 2-deoxyribose를 산화시켜 지질과 산화물인 malondialdehyde (MDA)로 분해된다. 이때 MDA 를 530 nm에서 측정하여 메뚜기류의 hydroxyl radical 에 대한 소거능을 확인하고자 하였다. 실험 결과는 Fig.
- 이에 본 연구는 생물학적으로 유용한 자원의 확보 및 이용의 즉면에서, 섬서구 메뚜기 (Atractomorpha lata Motschulsky), 벼 메뚜기 (Oxya japonica Thunberg) 그리고 끝검은 메뚜기 (Stethophyma magister Rehn) 의 용매별 추출물의 생물학적 활성 중 특히 항산화 활성, 산화적 스트레스에 의해 유도된 세포독성에 대한 세포보호능, 그리고 분자 염증에 대표적인 분자표적인 Cox-2 억제능을 살펴보기 위한 실험을 수행하였다.
제안 방법
- DPPH radical에 대한 각 용매별 시료의 라디칼 소거능을 측정하기 위해 50% 에탄올에 용해시킨 400 11M DPPH 용액을 190 yL씩 96 well plate에 분주하고, 여기에 시료를 10µL를 첨가하여 최종 반응용액이 200 yL가 되도록 하였다. 30 min 동안 반응시킨 후 VICTOR3를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며 , DPPH radical의 소거 활성 비율 (% inhibition)은 다음과 같이 계산하였다. 이때 대조구는 시료 대신 에탄올을 첨가하여 수행하였고, 양성 대조구는 기존의 항산화제로 알려진 butylated hydroxy toluene (BHT, Sigma)와 활성을 비교하였다(20).
- 6, 300 mM) : 100 mM의 TPTZ : 20 mM의 Rb . 6HQ를 10 : 1 : 1의 비율로 실험 직전에 섞어 사용하였으며 반응액 (190µL)와 추출물 (10 11L)을 혼합한 후 20 min 후 590 im에서 multilabel reader인 VICTOR3(Wallac, Turku, Finland)로 흡광도를 측정하였다. 환원력은 상대비교를 하였으며 재료별 활성정도는 시간대별, 그리고 5 min 후의 값을 비교하였다(21).
- Cox-2 promoter의 활성의 조절을 알아보기 위해 이들 유전자의 promoter 부분을 활용하였다. Promoter 부분을 luciferase activity를 확인할 수 있는 pGL3 (Promega) vector 에 cloning 한 후 glioma cell 에 transfection하여 stable cell line으로 안정화시켰다. 이후 메뚜기의 추출물을 넣은 다음 24 hr동안 37℃, 5% CO2 incubator(Model No.
- 약술하면, SH-SY5Y (neuroblastoma cell line) 세포를 5 x 104 cells/mL 로 희석한 다음, 96 well plate에 200 pL/well 씩 접종하고 200 pM의 H2O2와 추출물을 첨가하여 24 hr 배양한 후 세포 생존율을 측정하였다. 먼저 배양액을 제거하고 fresh medium으로 한 번 더 씻은 다음, MTT (5 pg/mL, Sigrna)가 포함된 배양액을 100 µL씩 넣고, 4시간 동안 배양하여 formazan0] 형성되면 isopropanol 혼합액 100µL를 넣고 fonnazaii을 녹인 후 VICTOR3로 590 nm에서 흡광도를 측정하였다 (22).
- 산화스트레스에 의한 대표적인 질병의 하나인 천식(aslhma)에 있어서 염증은 매우 중요한 문제이며 이와 관련하여 분자염증관련 분자 표적 유전자인 Cox-2 promoter 영역의 활성억제를 비교하는 실험을 하였다. 유전자의 promoter 부분을 이용하여 Cox-2의 transcription을 억제할 수 있는지를 살펴보았는데 섬서구메뚜기와 벼메뚜기의 DMSO 추출물에서 높은 억제효과를 보였을 뿐 다른 추출물 은 억제하지 못하는 것으로 나타났다.
- 시간에 따른 활성의 정도는 FRAP asay로 확인해 보았다. FRAP assay는 pH 3.
- 세포생존율은 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-ephenyl tetrazolium bromide) 분석법 으로 측정하였다. 약술하면, SH-SY5Y (neuroblastoma cell line) 세포를 5 x 104 cells/mL 로 희석한 다음, 96 well plate에 200 pL/well 씩 접종하고 200 pM의 H2O2와 추출물을 첨가하여 24 hr 배양한 후 세포 생존율을 측정하였다. 먼저 배양액을 제거하고 fresh medium으로 한 번 더 씻은 다음, MTT (5 pg/mL, Sigrna)가 포함된 배양액을 100 µL씩 넣고, 4시간 동안 배양하여 formazan0] 형성되면 isopropanol 혼합액 100µL를 넣고 fonnazaii을 녹인 후 VICTOR3로 590 nm에서 흡광도를 측정하였다 (22).
- 30 min 동안 반응시킨 후 VICTOR3를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며 , DPPH radical의 소거 활성 비율 (% inhibition)은 다음과 같이 계산하였다. 이때 대조구는 시료 대신 에탄올을 첨가하여 수행하였고, 양성 대조구는 기존의 항산화제로 알려진 butylated hydroxy toluene (BHT, Sigma)와 활성을 비교하였다(20).
- 이들은 세포의 신호전달과정 중 mitogen-activated protein kinases (MAPKs), c-JUN N-terminal kinase (JNK), p38 and extra cellular signal-regulated kinase (ERK) 등의 많은 부분에 관여하여 세포를 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(24-26). 이에 SH-SY5Y 세포를 이용하여 과산화수소로 유도된 세포독성에 대한 메뚜기류의 세포보호 효과를 살펴보기 위해 200µM의 과산화 수소를 처리하고, 메뚜기류 추출물을 처리한 다음, 24 hr 후에 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과는 Fig.
- 따라서 생체 내 활성라디칼 반응을 억제시키는 항산화 물질은 이러한 질환을 예방할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 매우 간단하면서도 널리 사용되어지는 항산화 실험인 DPPH와 FRAP assay 를 실시하여 인체 내 세포막에서의 지질 과산화 및 활성 산소종의 생성을 억제하는 반응, 생성된 활성 산소종의 소거반응을 살펴보았다. 먼저, DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 활성 산소종으로서 cysteine, glutathione과 같은 함유황아미노산과 ascorbic add, BHT 등에 의해 환원되어 탈색되므로 다양한 천연소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다.
- 본 실험에 사용된 재료인 섬서구 메뚜기(Atractomorpha lata Motschulslg)는 2004년 9월 15일 충청북도 영동군 학산 면 일대에서, 벼메뚜기 (Oxya japonica Thunberg)는 8월경 전라북도 무주군 일대에서, 끝검은 메뚜기(Stethoplyma magister Rehn)는 6월 10일 전라북도 무주군 잠두 일대에서 채집하였다. 채집된 재료는 1주일간 음건하여 -20℃ 에서 보관을 하였으며, 실험 직전에 열풍건조 (Circulation Convection Oven, 60℃, 24 hr)에 의하여 powder로 만들고, 이를 추출용매에 녹여 사용하였으며, 50 mL용 tube에 각 1 g씩 보존하여 voucher specimen으로 보존하였다 추출용매로는 증류수edistilled water; DW), dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma Chemical, St. Louis, MO), 에탄올(ethanol), 메탄올 (methanol)을 사용하였다. 추출 용매의 양은 건조된 시료 1 g 당 2 mL의 양을 첨가하여 추출하였으며, 용매에 따라 DW의 경우 60℃에서 24 hr 동안 열수추출 과정을 거쳤으며, DMSO, 에탄올, 메탄올의 경우에는 24 hr 동안 실온에서 rotator(Model No.
- Louis, MO), 에탄올(ethanol), 메탄올 (methanol)을 사용하였다. 추출 용매의 양은 건조된 시료 1 g 당 2 mL의 양을 첨가하여 추출하였으며, 용매에 따라 DW의 경우 60℃에서 24 hr 동안 열수추출 과정을 거쳤으며, DMSO, 에탄올, 메탄올의 경우에는 24 hr 동안 실온에서 rotator(Model No. AG; FinePCR, Seoul, Korea)로 shaking 과정을 거쳐 추출하였다. 추출 후 4, 000 g에서 5분간 원심분리 (Eff&idQtf, Centrifuge 5415R, Germany)하여 침전물을 버리고 상층액을 실험에 이용하였다(Fig.
대상 데이터
- SH-SY5Y (a human neuroblastoma cell line) 세포는 한국 세포주 은행으로부터 분양받았으며 RPMI-1640 배지에 10% FBS (fetal bovine serum; GIBCO)와 1% antibiotics (penicillin/ streptomycin; Sigma Chemical) 을 첨가하여 37 ℃ 의 5% CO2 incubator(Model No. MCO175; Sanyo, Tokyo, Japan)에서 배양하면서, 48-72 hr에 한 번씩 계대 배양하며 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 재료인 섬서구 메뚜기(Atractomorpha lata Motschulslg)는 2004년 9월 15일 충청북도 영동군 학산 면 일대에서, 벼메뚜기 (Oxya japonica Thunberg)는 8월경 전라북도 무주군 일대에서, 끝검은 메뚜기(Stethoplyma magister Rehn)는 6월 10일 전라북도 무주군 잠두 일대에서 채집하였다. 채집된 재료는 1주일간 음건하여 -20℃ 에서 보관을 하였으며, 실험 직전에 열풍건조 (Circulation Convection Oven, 60℃, 24 hr)에 의하여 powder로 만들고, 이를 추출용매에 녹여 사용하였으며, 50 mL용 tube에 각 1 g씩 보존하여 voucher specimen으로 보존하였다 추출용매로는 증류수edistilled water; DW), dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma Chemical, St.
데이터처리
- The data show mean value + SD of triplicate detaminations. Values with different lete are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- The data show mean value + SD of triplicate determinations. Values with different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 6HQ를 10 : 1 : 1의 비율로 실험 직전에 섞어 사용하였으며 반응액 (190µL)와 추출물 (10 11L)을 혼합한 후 20 min 후 590 im에서 multilabel reader인 VICTOR3(Wallac, Turku, Finland)로 흡광도를 측정하였다. 환원력은 상대비교를 하였으며 재료별 활성정도는 시간대별, 그리고 5 min 후의 값을 비교하였다(21).
이론/모형
- Cox-2 promoter의 활성의 조절을 알아보기 위해 이들 유전자의 promoter 부분을 활용하였다. Promoter 부분을 luciferase activity를 확인할 수 있는 pGL3 (Promega) vector 에 cloning 한 후 glioma cell 에 transfection하여 stable cell line으로 안정화시켰다.
- MCO175; Sanyo, Tokyo, Japan) 에서 배양하였다. Luciferase 의 intensity는 Luciferase assay system (E1500, Promega) 를 사용하여 VICTOR3 (Perkin Elmer, Turku)에서 활성을 확인하였다 (23).
- 세포생존율은 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-ephenyl tetrazolium bromide) 분석법 으로 측정하였다. 약술하면, SH-SY5Y (neuroblastoma cell line) 세포를 5 x 104 cells/mL 로 희석한 다음, 96 well plate에 200 pL/well 씩 접종하고 200 pM의 H2O2와 추출물을 첨가하여 24 hr 배양한 후 세포 생존율을 측정하였다.
성능/효과
- 이에 SH-SY5Y 세포를 이용하여 과산화수소로 유도된 세포독성에 대한 메뚜기류의 세포보호 효과를 살펴보기 위해 200µM의 과산화 수소를 처리하고, 메뚜기류 추출물을 처리한 다음, 24 hr 후에 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과는 Fig. 5에서와 같이, 과산화 수소만 처리한 세포의 생존율이 14% 정도인데 비해 메뚜기 추출물을 함께 처리하였을 때는 생존율이 증가하였다. 섬서구 메뚜기의 경우 DW 추출물에서 23%, 벼메뚜기의 경우 DW, 에탄올, 메탄올 추출물에서 각각 51%, 28%, 31%, 그리고 끝검은 메뚜기의 경우 DW 추출물에서 20%의 증가율을 보였으며 이는 메뚜기류 추출물이 과산화수소로 유도된 세포독성에 대해 세포보호 효과를 가지는 것으로 나타낸다(27, 28).
- 4와 같았으며, 3 종의 메뚜기류 추출물 중 끝검은 메뚜기에서 hydroxyl radical 소거능이 높게 나타났다. 그리고 에탄올과 메탄올 추출물에서 50% 이상의 소거능을 나타내어 높은 활성을 보였다. 지질 과산화물은 넓은 의미에서 인체 세포 막 등을 형성하고 있는 지질이 활성산소에 의해서 지나치게 산화되어 생긴 2차적 활성산소이다.
- 유전자의 promoter 부분을 이용하여 Cox-2의 transcription을 억제할 수 있는지를 살펴보았는데 섬서구메뚜기와 벼메뚜기의 DMSO 추출물에서 높은 억제효과를 보였을 뿐 다른 추출물 은 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 또한 DPPH, FRAP, MTT assay에서 항산화 활성이 높아 Cox-2 발현도 억제할 것이라고 예상되었던 DW 추출물은 Cox-2 발현을 촉진하는 것으로 나타났다 Fig. 6). 인체 내에서의 항산화 스트레스 불균형이 lh-1 형 면역반응을 억제시키고 Th-2형 면역 반응과 면역 글로불린 생성을 촉진시킴으로써 알레르기 반응과 천식에 대한 면역력이 약하게 될 수도 있다는 연구 결과 로 비추어 볼 때, 항산화능과 항염증 활성은 반드시 일치하는 것은 아니라고 주장하는 연구자도 있다(29).
- 6에서 ferric tripyridyltriazine (Fem -TPTZ) 복합체가 환원제(antioxidant)에 의해서 파란색의 ferrous tripyridyltriazine (Fen-TPTZ) 복합체로 될 때 흡광도를 측정하여 검색하고자 하는 화합물에 대한 환원력 (ferric reducing ability)을 보는 것이다. 메뚜기 종류에 상관없이 DW추출물에서 공통적으로 매우 높은 환원력을 나타냈고, DPPH와 마찬가지로 에탄올과 메탄올 추출물에서도 높은 활성을 나타냈지만 DMSO에서는 비교적 낮은 활성을 나타내었다. 메뚜기류 추출물은 DPPH 및 FRAIM 대하여 에탄올과 메탄올 추출물에서 높은 활성을 보였다 (Hg- 3).
- 메뚜기 종류에 상관없이 DW추출물에서 공통적으로 매우 높은 환원력을 나타냈고, DPPH와 마찬가지로 에탄올과 메탄올 추출물에서도 높은 활성을 나타냈지만 DMSO에서는 비교적 낮은 활성을 나타내었다. 메뚜기류 추출물은 DPPH 및 FRAIM 대하여 에탄올과 메탄올 추출물에서 높은 활성을 보였다 (Hg- 3). 그러나 합성항산화제인 BHH와 비교하면 낮은 활성을 보였는데, 이는 메뚜기류 추출물이 단일 성분이 아니라 여러가지 활성물질 또는 일부 억제물질이 공존하여 이들에 의한 상호 작용에 의한 결과로 생각된다.
- 이때 MDA 를 530 nm에서 측정하여 메뚜기류의 hydroxyl radical 에 대한 소거능을 확인하고자 하였다. 실험 결과는 Fig. 4와 같았으며, 3 종의 메뚜기류 추출물 중 끝검은 메뚜기에서 hydroxyl radical 소거능이 높게 나타났다. 그리고 에탄올과 메탄올 추출물에서 50% 이상의 소거능을 나타내어 높은 활성을 보였다.
- 산화스트레스에 의한 대표적인 질병의 하나인 천식(aslhma)에 있어서 염증은 매우 중요한 문제이며 이와 관련하여 분자염증관련 분자 표적 유전자인 Cox-2 promoter 영역의 활성억제를 비교하는 실험을 하였다. 유전자의 promoter 부분을 이용하여 Cox-2의 transcription을 억제할 수 있는지를 살펴보았는데 섬서구메뚜기와 벼메뚜기의 DMSO 추출물에서 높은 억제효과를 보였을 뿐 다른 추출물 은 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 또한 DPPH, FRAP, MTT assay에서 항산화 활성이 높아 Cox-2 발현도 억제할 것이라고 예상되었던 DW 추출물은 Cox-2 발현을 촉진하는 것으로 나타났다 Fig.
- 2와 같다. 전반적으로 polarity index가 5.0부근인 용매로서 에탄올과 메탄올로 추출물을 얻어서 실험을 수행한 결과 공통적으로 60-70%의 높은 활성을 보였다. 그 중에서도 특히 섬서구 메뚜기의 메탄올 추출물에서 70% 이상의 가장 높은 활성을 보였다.
후속연구
- 인체 내에서의 항산화 스트레스 불균형이 lh-1 형 면역반응을 억제시키고 Th-2형 면역 반응과 면역 글로불린 생성을 촉진시킴으로써 알레르기 반응과 천식에 대한 면역력이 약하게 될 수도 있다는 연구 결과 로 비추어 볼 때, 항산화능과 항염증 활성은 반드시 일치하는 것은 아니라고 주장하는 연구자도 있다(29). 따라서 본 연구에서도 명확히 하지 못한 Cox-2 promoter 활성이 반드시 항염증 활성과 밀접한 관계가 있는지에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다.
- Superoxide나 hydroxyperoxide 등의 활성 산소종 생성에 의한 인체 위해 물질들이 체내에 점진적으로 축적되는 경우, 발암, 동맥경화 등과 같은 질환은 물론, 전반적인 세포의 노화가 야기되는 것으로 알려지고 있다. 따라서 생체 내 활성라디칼 반응을 억제시키는 항산화 물질은 이러한 질환을 예방할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 매우 간단하면서도 널리 사용되어지는 항산화 실험인 DPPH와 FRAP assay 를 실시하여 인체 내 세포막에서의 지질 과산화 및 활성 산소종의 생성을 억제하는 반응, 생성된 활성 산소종의 소거반응을 살펴보았다.
- 그러나 합성항산화제인 BHH와 비교하면 낮은 활성을 보였는데, 이는 메뚜기류 추출물이 단일 성분이 아니라 여러가지 활성물질 또는 일부 억제물질이 공존하여 이들에 의한 상호 작용에 의한 결과로 생각된다. 따라서 항산화물질이 분리 및 정제된다면 상당한 수준의 항산화능을 나타낼 수 있을 것으로 판단되며 이는 천연 항산화제 및 기능성 식품으로 이용할 수 있는 가능성을 시사한다.
- 지질 과산화물은 넓은 의미에서 인체 세포 막 등을 형성하고 있는 지질이 활성산소에 의해서 지나치게 산화되어 생긴 2차적 활성산소이다. 이에 메뚜기 추출물이 지질 과산화물 제거 기전에 작용하여 촉매나 효소의 속도 (kinetics)를 증가시킴으로써 적정 수준 이상으로의 체내 축적을 방지하거나 제거율을 높여서 체내에 축적되는 양을 감소시키는 기전을 통하여 불가피하게 생성되는 지질 과산 화물에 의한 손상을 줄일 수 있을 것으로 기대되어진다.
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