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문제 정의
- 그러나 국내에서는 cryotop을 이용한 유리화 동결법에 관한 연구 보고는 거의 없어, 본 연구에서는 현재 가장 일반적으로 사용하는 동결법인 완만 동결법 중 직접 이식 동결법과 cryotop을 이용한 유리화 동결법을 사용하여 동결/융해 후의 한우 수정란의 생존율을 비교하고, 수정란의 발달 상태에 따른 동결 성적 분석을 통해 농가 현장에서 한우 수정란의 간이 동결을 위한 동결법으로써 cryotop 유리화 동결법이 사용 가능성이 있는지를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Cryotop을 이용한 유리화 동결법은 수정란의 동결과 융해를 위한 세정액(washing solution)으로써 TCM199에 FBS가 20%가 되도록 첨가하고, 동결을 위한 평형액(equilibration sol)은 세정액에 7.5% ethylene glycol(Sigma), 7.5% dimethylsulfoxide(DMSO, Sigma)가 되도록 조성하였으며, 유리화 동결액 (vitrification solution)은 세정액에 0.5M sucrose(Sigma), 16% ethylene glycol, 16% DMSO를 첨가하여 제조하였다. 수정란의 동결은 수정란을 세정액으로 2∼3회 세정하여, 평형액에서 3분 동안 평형시킨 후 유리화 동결액에서 30초간 정치하여 동결 용기인 cryotop (Kitazato, Japan)의 polypropylene strip에 5개 정도의 수정란을 일정 간격으로 로딩한 후, 파스퇴르 피펫을 이용하여 동결액을 흡입, 제거하고, 신속하게 액체 질소에 침지하였다.
- 그리고 수정 후 2일째 분할율과 7∼9일째 배반포 발달율을 조사하였다.
- 도축 한우의 난소로부터 난포란을 회수하기 위하여 18G needle이 부착된 5 ml syringe를 이용, 7 mm 이하의 가시 난포로부터 난포액을 흡입하여 100 mm petri dish 내에 천천히 분주하였다. 난포란 흡입배지는 3% fetal bovine serum(FBS, Gibco)이 첨가된 Dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS, Gibco)을 사용하였다.
- 동결 방법에 따른 동결/융해 후 생존율 조사를 위하여 한우 체외 수정란을 1.8 M ethylene glycol을 이용한 직접 이식 동결법(완만동결법)과 cryotop을 이용한 유리화 동결법으로 동결한 한우 수정란을 각각 융해하여 12∼24시간 동안 38.5℃, 5% CO2 incubator 내에서 배양한 후 발달 상태를 나타낸 생존 수정란을 조사하였다.
- 본 연구는 수정란의 동결법 중 ethylene glycol을 동결 방지제로 사용한 직접 이식 동결법(완만 동결법)과 동결 용기로써 cryotop을 이용한 유리화 동결법으로 한우 수정란을 동결하여 융해 후 생존율을 비교하였고, 체외 수정 후 배반포 발생 날짜와 배반포의 발생 단계에 따른 동결/융해 후 생존율도 조사하였다.
- 수정란의 동결은 수정란을 세정액으로 2∼3회 세정하여, 평형액에서 3분 동안 평형시킨 후 유리화 동결액에서 30초간 정치하여 동결 용기인 cryotop (Kitazato, Japan)의 polypropylene strip에 5개 정도의 수정란을 일정 간격으로 로딩한 후, 파스퇴르 피펫을 이용하여 동결액을 흡입, 제거하고, 신속하게 액체 질소에 침지하였다.
- 수정란의 배반포 발달 시기에 따른 생존율 조사를 위하여 체외 성숙시킨 한우 난포란을 한우 동결 정액과 체외 수정 후 각각 7, 8, 9 일에 배반포 단계로 발달한 수정란을 직접 이식 동결법과 유리화 동결법으로 동결한 후 융해하여 발달 상태를 나타낸 생존 수정란을 조사하였다.
- 수정란의 배반포 발생 단계에 따른 생존율 조사를 위하여, 체외 성숙시킨 한우 난포란을 한우 동결 정액과 체외 수정 후 7∼9일 동안 배반포 단계로 발달한 수정란을 초기배반포, 배반포, 확장 배반포 군으로 나누어, 직접 이식 동결법과 유리화 동결법으로 동결한 후 융해하여 발달 상태를 나타낸 생존 수정란을 조사하였다.
- 실체 현미경(Leica)하에서 난포란을 회수하여 난포란 흡입배지로 세척한 후, 25 mM hepes와 10% FBS가 첨가된 tissue culture medium(TCM)199으로 2∼3회 세척하여 난포란 20개를 체외 성숙 배지 100 µl droplet 내로 옮겨, 38.5℃, 5% CO2 incubator 내에서 20∼22시간 동안 배양하였다.
- 완만 동결법으로써 직접 이식 동결법은 동결 방지제로써 1.8 M ethylene glycol이 첨가된 동결 배지(IFP, Japan)에서 15∼20분간 평형을 실시한 후, 수정란 동결기(FHK)를 사용하여 동결하였다.
- 유리화 동결법으로 동결한 수정란을 융해한 후, 희석 처리와 세정을 위하여 희석 처리를 위한 희석액(dilution solution)은 세정액에 0.5 M sucrose를 첨가하였으며, 융해액(thawing solution)은 세정액에 1M sucrose를 첨가하여 제조하였다. 유리화 동결법에 의한 수정란의 융해는 액체 질소에서 cryotop의 플라스틱 커버를 벗긴 후 수정란이 장착된 polypropylene strip을 37℃의 융해액에 넣어서 1분 동안 정치한 후 희석액에서 3분간 정치하였고, 세정액에서 5분씩 2회 세정하였다.
- 체외 성숙 배지는 TCM199에 10% FBS, 0.5 µg/ml follicle stimulating hormone(FSH, Sigma), 0.5 µg/ml luteinizing hormone(LH, Sigma), 1 µg/ml β-estradiol(Sigma), 0.07 µg/ml epidermal growth factor(EGF, Sigma)를 첨가하여 조성하였다.
- 체외 수정 후 난자는 10% FBS 첨가 TCM199으로 3∼4회 세척하여, 7∼9일간 38.5℃, 5% CO2 incubator 내에서 난구 세포와 공배양하였으며, 48시간마다 체외 배양액을 교환하였다.
- 한우 도축암소의 난소로부터 난포란을 회수하여, 체외에서 22시간 성숙시킨 후, 한우 동결 정액과 체외 수정을 실시하였다. 체외 수정 후 2일째 분할율과 수정 후 7∼9일간 체외 배양액(TCM199 +10% FBS)에서 난구 세포와 공배양하여 분할율과 배반포로 발달율을 조사한 결과는 Table 1과 같다.
- 한우 체외 수정란을 동결한 후 융해하여 체외 배양액(10% FBS 첨가 TCM199)으로 세정한 수정란을 체외 배양액에 넣어 12∼24시간동안 5% CO2 인큐베이터에서 배양하여 재확장(re-expanded) 또는 부화(hatching) 배반포로 발달한 수정란을 생존 수정란으로 판정하였다.
데이터처리
- 시험 결과의 통계학적 분석은 t-test, one-way ANOVA로 실시하였다.
성능/효과
- 7일에 생산된 배반포와 달리 8일과 9일에 생산된 배반포의 동결/융해 후 생존율에서는 유리화 동결법의 성적이 완만 동결법보다 높은 수치의 생존율을 나타내었고, 9일에 생산된 배반포에서는 유리화 동결법 사용 시 유의적으로 더 높은 생존율을 나타내었다(p<0.05).
- 결론적으로 유리화 동결법 사용 시 더 좋은 수정란의 융해 후 생존율은 체외배양 후 9일에 생산된 배반포 간의 비교에서, 그리고 배반포 발생 단계 중 배반포 단계의 수정란의 경우에서 완만 동결법보다 유리화 동결법에서 더 높은 융해 후 수정란의 생존율이 확인되었다(p<0.05).
- 그리고 확장 배반포 단계의 수정란이 두 가지 동결 방법 모두에서 다른 시험군에 비해 높은 생존율을 보였는데, 완만 동결법에서는 유의성 있게(p<0.05), 유리화 동결 법에서는 비유의적으로 높은 생존율을 나타내었다.
- 난포란 3,571개를 공시하여 체외 성숙 및 체외 수정시키고, 2일 후에 분할된 난자의 수는 2,312개로써 64.83 ± 9.18%의 분할율을 나타내었으며, 체외 수정 후 7∼9일간 38.5℃, 5% CO2 조건하에서 난구 세포와 공배양하여 분할 난자 중 547개가 배반포로 발달되어 24.59 ± 9.90%의 배반포율을 나타내었다.
- 05). 두 가지 동결 방법 모두에서 7일에 생산된 배반포 수정란이 8, 9일에 생산된 배반포에 비해 가장 높은 생존율을 나타내었다.
- 또한 두 가지 동결 방법 모두에서 확장 배반포 단계의 수정란이 초기 배반포 및 배반포 단계보다 더 높은 수치의 생존율을 나타내었으나, 유의성 있는 차이는 완만 동결법에서만 인정되었다(p<0.05).
- 또한 완만 동결법에서는 배양 후 7일, 8일, 9일에 생산된 배반포 순으로, 그리고 유리화 동결법에서는 7일, 9일, 8일에 생산된 배반포 순으로 융해 후 수정란의 생존율의 수치가 높았으며, 완만 동결법에서 유의적인 차이를 나타내어 배양 후 7일의 배반포 생존율이 8, 9일에 생산된 배반포보다 각각 높았다(p<0.05).
- 또한 체외 수정 후 7일에 생산된 배반포는 8, 9일에 생산된 배반포와 비교하여 완만 동결법에서는 유의성있게(p<0.05) 유리화 동결법에서는 비 유의적으로 더 높은 융해 후 생존율을 나타내었다.
- 본 연구에서 ethylene glycol을 동결 방지제로 사용한 직접 이식 동결법과 sucrose, ethylene glycol, DMSO를 혼합하여 동결액으로 사용하고, cryotop을 이용한 유리화 동결법을 비교하여 동결/융해 후 수정란의 생존율이 서로 비슷한 성적을 나타내었으나, 체외 수정 후 배반포가 생산된 날짜와 배반포 발달 단계에 따라 두 가지 동결법에 의한 수정란 생존율 비교에서는 체외 배양 9일에 생산된 배반포와 배반포 단계의 수정란의 경우, 직접 이식 동결법보다 유리화 동결법 사용 시 유의성 있게 더 높은 생존율을 나타내었다.
- 1 M sucrose를 이용하여 완만 동결하였을 때, 수정란의 발달 단계에 따른 내동성을 확인하기 위하여 수정란의 생존성을 평가하였다. 상실배 수정란의 생존율은 31.6%로써 배반포와 확장 배반포 수정란보다 유의적으로 낮은 결과를 나타내었으며, 확장배반포의 수정란은 73.7%로써 가장 높은 성적을 나타내었다. 또한 체외 수정란이 체내 수정란보다 낮은 생존율을 나타내었다고 보고하여 체내 수정란이 더 양호한 생존성을 나타내었고, 이러한 결과는 수정란의 배양 체계에 따른 수정란의 질적인 차이로 인하여 생존율에 영향을 미칠 수 있다고 보고하였다.
- 이들의 연구에서 동결/융해 후 수정란의 생존율은 본 연구보다 낮은 수치를 나타내었지만, 유리화 동결법에서 배반포 단계가 진행될수록 더 높은 성적을 보인 결과와 유사한 경향을 나타내었으며, 이러한 결과는 체외에서의 발달이 더 진행될수록 동결에 대한 손상을 줄일 수가 있어 확장 배반포기에 동결하는 것이 유리한 것으로 나타났다.
- 직접 이식 동결법의 동결/융해 후 생존율은 55.07 ± 26.43%이었으며, cryotop을 이용한 유리화 동결법의 생존율은 56.86± 26.53%로써 직접 이식 동결법과 거의 비슷한 성적을 나타내었다.
- 체외 배양 후 8일에 생산된 배반포의 생존율은 완만 동결법과 유리화 동결법에서 각각 49.20 ± 23.4%와 56.04 ± 20.5%로써 유리화 동결법에서 더 높은 생존율이 나타났으나, 유의성 있는 차이는 인정되지 않았다.
- 초기 배반포 단계의 수정란을 완만 동결법의 하나인 직접 이식 동결법과 유리화 동결법으로 동결/융해한 후 생존율을 조사한 바, 각각 60.89 ± 18.3%와 61.98 ± 15.3%로써 서로 비슷한 성적을 나타내었으며, 배반포 단계의 수정란은 각각 45.76± 12.8%와 66.22 ± 18.8%로써 유리화 동결법의 성적이 높았으며, 유의성 있는 차이가 인정되었다(p<0.05).
- 한우 난포란을 체외에서 22시간 배양하고, 한우 동결 정액을 이용한 체외 수정 후 배양하여 7일에 생산된 배반포기 수정란을 완만 동결법으로 동결, 융해한 후 생존율은 79.06 ±17.8%이었으며, cryotop을 이용한 유리화 동결법에 의한 동결/융해 후 생존율은 72.65 ± 18.3%로써 완만 동결법보다 낮은 수치를 나타내었으나, 유의성 있는 차이는 없었다.
- 한우 체외 수정란을 직접 이식 동결법과 cryotop을 이용한 유리화 동결법으로 동결하여 융해한 후, 수정란의 생존율은 각각 55.07 ± 26.43%와 56.86 ± 26.53%로써 거의 비슷한 성적을 나타내었다.
- 한우 체외 수정란의 배반포 발달 날짜에 따른 수정란의 생존율은 체외 배양 후 7일에 생산된 배반포는 직접이식 동결법과 유리화 동결법에서 각각 79.06 ± 17.8%와 72.65± 18.3%를 나타내었고, 8일에 생산된 배반포는 각각 49.20 ±23.4%와 56.04 ± 20.5%이었으며, 배양 후 9일에 생산된 배반포는 각각 44.62 ± 16.1%와 68.69 ± 23.5%의 생존율을 나타내어, 7일에 생산된 배반포와 달리 8일과 9일에 생산된 배반포는 직접이식 동결법보다 유리화 동결법 사용 시 더 높은 생존율을 나타내었고, 9일에 생산된 배반포의 경우, 유의적인 차이를 나타내었다(p<0.05).
- 한우 체외 수정란의 배반포 발생 단계에 따른 동결/융해 후 수정란의 생존율 비교에서 초기 배반포 단계의 수정란은 직접 이식 동결법과 유리화 동결법에서 각각 60.89 ± 18.3%와 61.98± 15.3%로써 서로 비슷한 성적을 나타내었고, 배반포 단계의 수정란은 각각 45.76 ± 12.8%와 66.22 ± 18.8%로써 유리화 동결법 사용 시 더 높은 생존율을 나타내었으며(p<0.05), 확장 배반포 단계의 수정란은 각각 80.32 ± 21.8%와 70.58 ± 17.2%를 나타내었다.
- 한편, 배양 후 9일에 생산된 배반포의 생존율은 각각 44.62 ± 16.1%와 68.69 ± 23.5%로써 유리화 동결법을 사용한 경우, 더 높은 수정란의 생존율을 나타내었다 (p<0.05).
- 확장 배반포 단계의 수정란은 각각 80.32 ± 21.8%와 70.58 ± 17.2%를 나타내어 유리화 동결법보다 직접 이식 동결법이 높은 수치를 나타내었으나, 유의성 있는 차이는 아니었다.
후속연구
- 본 연구에서의 상기의 결과를 고려하여, 동결 보호제의 종류, 노출 시간, 동결 및 융해 방법 등 유리화 동결 후 생존성에 영향을 미칠 수 있는 여러 요인들을 추가로 조사, 분석하여 동결/융해 후 생존율을 더 높일 수 있다면, cryotop을 이용한 유리화 동결법이 농가 현장에서 이용할 수 있는 양호한 동결법으로 제시될 수 있을 것으로 생각된다.
- 이와 같은 상황에서 유리화 동결법은 농가 현장에서 사용 가능한 동결법으로써 그 용이한 방법과 시간이 적게 소요된다는 점에서 추천할만하며, 유리화 동결법으로 동결된 수정란의 융해법에 있어서 본 연구에서는 다단계 희석을 하였으나, 일 단계 희석으로도 높은 생존율을 보인 김 등(1998)과 Vajta 등(1997)의 보고로 추정해 볼 때 융해법도 간단히 조작할 수 있을 것으로 기대된다.
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