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문제 정의
- 이러한 식물추출물과의 혼합 비율에 따른 도라지 효능의 증감에 대한 보고는 잘 알려지지 않았으며, 또한 면역활성 및 조절 기능이 있는 T 세포나 M2 대식세포에 대한 활성여부를 특이 유전자의 발현을 가지고 평가 연구한 논문은 없다. 이번 연구에서는 도라지 추출액과 도라지를 함유한 한약재 추출액(맥환, 활맥단)들의 T 세포 활성화 여부(c-fos, CD40L)와 M1 & M2 대식세포 분화 능력 여부(iNOS, Ym1, ARG1)를 조사하기 위하여 각각의 특이 유전자의 발현을 측정하였다.
제안 방법
- T 세포의 활성여부를 알기 위해 분리한 지라세포를 1×106/ml 농도로 24-well plates에 분주하고 50 μg/ml의 농도로 도라지 추출액(CC), 맥환 추출액(MAEK), 활맥단 추출액(HWAL)을 각각 처리하였다. 양성 대조군에는 concavalin A(conA)을 5 μg/ml를 각각 처리하였다.
- 양성 대조군에는 concavalin A(conA)을 5 μg/ml를 각각 처리하였다. 대식세포의 M1, M2 분화 정도를 분석하기 위해 RAW 264.7 세포를 1×106 /ml 농도로 24-well plates에 분주하고 50 μg/ml의 농도로 도라지 추출액, 맥환 추출액, 활맥단 추출액을 각각 처리하였다. M1 분화의 양성 대조군에는 LPS를 5 μg/ml를, M2 분화의 양성 대조군으로는 IL-4 40 ng/ml을 처리하였다.
- 본 연구에 사용한 생약 원료인 도라지는 경상남도 진주시 인근에서 재배된 것으로 (주)장생도라지로부터 공급받았으며, 상황버섯 등 기타 약재는 경남 진주시 소재의 약재 시장에서 구입하였다. 도라지 추출액(CC)은 동결건조 상태의 건조도라지 만을, 맥환 추출액(MAEK)은 도라지(82%)에 구기자(3%), 결명자(3%), 산약(3%), 두충(3%), 황기(3%), 감초(3%) 등 6가지 한약재(18%)를 합한 총 100 kg의 시료에 물 800 l를 가하고 80℃ 에서 6시간 동안 열수 추출하였으며 45℃에서 감압농축 후 4℃ 냉장 보관하면서 사용하였다. 활맥단 추출액(HWAL)은 도라지(7%)에 당귀(10%), 천궁(10%), 숙지황(18%), 백작약(10%), 백출(10%), 상황버섯(20%), 영지버섯(5%), 표고버섯(10%) 등 8가지 한약재(93%)를 합한 총 100 kg을 맥환 추출액과 동일한 방법으로 추출하여 제조하였다.
- 이번 연구에서 도라지를 함유하고 있는 한약재 추출 추출액을 투여하여 T세포 활성화와 항알레르기 및 항염증작용에 중요한 역할을 하는 M2 대식세포의 활성화 여부를 관찰하였다. 도라지 추출물은 M1 대식세포의 활성을 통하여 유도하여 세균 및 바이러스 감염에 있어서 방어 기전을 높여 줄 수 있을 것으로 보였다.
- 도라지 추출액(CC)은 동결건조 상태의 건조도라지 만을, 맥환 추출액(MAEK)은 도라지(82%)에 구기자(3%), 결명자(3%), 산약(3%), 두충(3%), 황기(3%), 감초(3%) 등 6가지 한약재(18%)를 합한 총 100 kg의 시료에 물 800 l를 가하고 80℃ 에서 6시간 동안 열수 추출하였으며 45℃에서 감압농축 후 4℃ 냉장 보관하면서 사용하였다. 활맥단 추출액(HWAL)은 도라지(7%)에 당귀(10%), 천궁(10%), 숙지황(18%), 백작약(10%), 백출(10%), 상황버섯(20%), 영지버섯(5%), 표고버섯(10%) 등 8가지 한약재(93%)를 합한 총 100 kg을 맥환 추출액과 동일한 방법으로 추출하여 제조하였다.
대상 데이터
- 마우스 대식세포인 RAW 264.7은 penicillin/streptomycin (Gibco) 100 unit/ml과 10% FBS이 함유된 DMEM (HyClone) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 2일에 한 번씩 계대 배양을 시행하였다.
- 본 연구에 사용한 생약 원료인 도라지는 경상남도 진주시 인근에서 재배된 것으로 (주)장생도라지로부터 공급받았으며, 상황버섯 등 기타 약재는 경남 진주시 소재의 약재 시장에서 구입하였다. 도라지 추출액(CC)은 동결건조 상태의 건조도라지 만을, 맥환 추출액(MAEK)은 도라지(82%)에 구기자(3%), 결명자(3%), 산약(3%), 두충(3%), 황기(3%), 감초(3%) 등 6가지 한약재(18%)를 합한 총 100 kg의 시료에 물 800 l를 가하고 80℃ 에서 6시간 동안 열수 추출하였으며 45℃에서 감압농축 후 4℃ 냉장 보관하면서 사용하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 수집된 자료의 분석은 나온 결과는 PASW 통계프로그램(SPSS Ver 17.0, Chicago, IL, USA)을 이용하여 모든 변인에 대한 평균값과 표준편차를 산출하였으며 대응표본 t검정(paired t-test)로 분석하였다.
이론/모형
- M1 분화의 양성 대조군에는 LPS를 5 μg/ml를, M2 분화의 양성 대조군으로는 IL-4 40 ng/ml을 처리하였다. 위와 같이 처리된 세포군들은 37℃, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양 후 각각 RNA를 분리 한 후, Moloney murine leukemia virus (MMLV) reverse transcriptase kits (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 Reverse RNA transcription 합성한 후 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 지라세포의 경우 c-FOS, CD40L 그리고 대식세포의 경우 iNOS, Ym1, ARG1 유전자의 발현 정도를 Real-time PCR법을 통해 비교하였다. 본 실험에 사용한 primer sequence는 Table 1에 기술되어 있다.
성능/효과
- 이들은 IL-4와 IL-13이 관여하며 염증이 있는 조직이나 병변 주변으로 M2 대식세포들이 신속히 이동하여 염증을 억제하는 역할을 한다[24]. M2 대식세포에서의 면역 조절활성을 측정한 결과, 활맥단 추출액을 처리한 군에서 M2 대식세포의 활성인자로 알려진 Ym1, ARG1 유전자의 발현이 매우 유의적으로 증가하는 것이 관찰되었다. 그러나 맥환 추출액과 도라지 추출액에서는 두 가지 유전자의 유의적인 증가가 관찰되지 않았다(Fig.
- 이번 연구에서 도라지를 함유하고 있는 한약재 추출 추출액을 투여하여 T세포 활성화와 항알레르기 및 항염증작용에 중요한 역할을 하는 M2 대식세포의 활성화 여부를 관찰하였다. 도라지 추출물은 M1 대식세포의 활성을 통하여 유도하여 세균 및 바이러스 감염에 있어서 방어 기전을 높여 줄 수 있을 것으로 보였다. 도라지를 다량함유하고 있고 세포면역활성 효과가 있는 구기자 등이 혼합된 경우, T세포 활성을 강하게 유도하여 면역활성을 증강하는 것으로 관찰되었다.
- 도라지 추출물은 M1 대식세포의 활성을 통하여 유도하여 세균 및 바이러스 감염에 있어서 방어 기전을 높여 줄 수 있을 것으로 보였다. 도라지를 다량함유하고 있고 세포면역활성 효과가 있는 구기자 등이 혼합된 경우, T세포 활성을 강하게 유도하여 면역활성을 증강하는 것으로 관찰되었다. 도라지는 천식과 같은 알레르기 억제 능력은 M2 대식세포 활성을 통해 이루어지는 것이 아니고 다른 기전이 있을 것으로 사료된다.
- 구기자의 경우, 항암효과 및 항균효과가 매우 높고 또한 세포면역반응을 증가시키는 것으로 보고되었으며[17], 산약의 경우, 점질다당류에 의한 임파계 면역세포의 활성화가 보고되었다[3]. 따라서 맥환 추출액에는 도라지(25%) 외에도 이러한 면역활성인자들로 구성되어 있는 한약재가 포함되었기 때문에 c-FOS와 CD40L과 같은 T세포의 활성인자들을 매우 높게 증가시키는 것으로 사료되었다(Fig. 1).
- 또한 숙지황 추출물을 집먼지 진드기로 자극한 아토피 피부염 생쥐 모델을 대상으로 피부에 바른 결과, 아토피 피부염 증상이 크게 개선되는 효과들이 발표되었다[23]. 따라서 활맥단 추출액에는 도라지(7%) 외에도 다양한 면역활성 조절인자들로 구성되어 있는 한약재가 포함되었기 때문에 M2 대식세포에서의 면역 조절활성에 관련된 유전자들이 발현을 증가시키는 것으로 사료되었다.
- 또한 이러한 인체면역 기능을 수행함에 있어서 대식세포는 class II MHC 물질을 대량으로 분비함으로써 T-helper lymphocyte와 상호활성화를 이루기도 한다[2]. 이러한 M1 대식세포의 면역 조절활성을 알아보기 위해 i-NOS 유전자 발현 정도를 확인 한 결과, 도라지 추출액에서는 유전자의 발현이 유의적으로 증가되었지만, 도라지 함유가 상대적으로 적은 맥환 추출액과 활맥단 추출액에서는 유전자의 발현 증가가 확인되지 않았다(Fig. 2A).
- 지라는 중요한 제2차 면역기관으로 노화된 적혈구가 사멸될 뿐만 아니라 항원을 탐지한 항원제시세포(대식세포, 수지상세포)들과 임파구(T세포, B세포) 들과 간에 다양한 면역 상호 자극이 일어나며 이러한 자극의 결과 다양한 항체의 생성은 물론 T세포의 활성이 일어난다[14]. 지라세포에서 T 세포의 활성화 여부를 측정한 결과, 맥환 추출액을 처리한 세포에서 T세포 활성인자인 conA를 5 μg/ml을 처리한 양성 대조군과 유사하게 대조군에 비해 c-fos와 CD40L 유전자의 발현을 각각 10배 이상, 6배 이상 증가시켰다. 하지만 도라지 추출액과 활맥단 추출액을 처리한 군에서는 c-fos의 경우, 거의 증가하지 않았으나 CD40L의 경우, 대조군에 비해 2배이상 발현이 증가되는 것을 알 수 있었다(Fig.
후속연구
- 도라지는 천식과 같은 알레르기 억제 능력은 M2 대식세포 활성을 통해 이루어지는 것이 아니고 다른 기전이 있을 것으로 사료된다. 도라지와 여러 한약재의 배합 조건에 따라서 면역의 활성화 또는 항 면역반응을 더 활성화 시킬 수 있어서 더욱 강력한 면역강화제 및 항 면역제제의 개발을 위한 최적의 조합을 찾는 것이 필요할 것으로 사료된다.
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