[논문]도라지 물 추출물의 경구 투여가 마우스 면역 세포 활성에 미치는 효과

류혜숙

doi:10.9799/ksfan.2014.27.1.099

도라지 물 추출물의 경구 투여가 마우스 면역 세포 활성에 미치는 효과
Effects of Water Extract from Platycodon grandiflorum on Mouse Immune Cell Activation ex vivo by Oral Administration 원문보기

한국식품영양학회지 = The Korean journal of food and nutrition, v.27 no.1, 2014년, pp.99 - 104

Abstract ▼ AI-Helper

Platycodon grandiflorum have been used as a traditional remedy and food source. This study was performed to investigate the immunomodulating effects of Platycodon grandiflorum in mouse, using ex vivo experiments. Six to seven-week old mice were fed ad libitum on a chow diet, and water extract of Platycodon grandiflorum was orally administrated at two different concentractions (50 and 500 mg/kg B.W./day) every other day for four weeks. In ex vivo experiments, the highest proliferation of splenocytes and levels of cytokine (IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$) production were observed in 500 mg/kg BW/day supplementation group for all three cytokines stimulated by LPS. In conclusion, this study suggests that Platycodon grandiflorum extracts may enhance the immune function by regulating the splenocytes proliferation and cytokine production capacity by activating macrophages in mice.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그 지표로 비장세포 증식능과 복강대식세포에서 분비되는 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) 생성량의 변화를 측정하여 도라지 물 추출물이 마우스 면역능에 미치는 영향을 검색하고자 하였다.
도라지 물 추출물의 경구 투여가 마우스 비장세포 증식능, 복강 대식세포에서 분비하는 cytokine(IL-1β, IL-6, TNF-α) 생성량에 어떠한 영향을 미치는지 관찰함으로써 생체 내에서 도라지 물 추출물의 면역 활성 효과를 검증하고자 하였다.
본 연구는 천연식품으로부터 면역 증진능을 갖는 식품소재 연구의 일환으로써 도라지 면역 증강 효과를 검색하고자 하였다. 도라지 물 추출물을 4주간 격일로 체중 ㎏당 50 ㎎/㎏ BW와 500 ㎎/㎏ BW의 두 농도로 각각 마우스에 경구 투여한후 비장세포 증식능과 활성 복강 대식세포에서 분비하는 사이토카인 분비능을 측정하였다.
또한 옥수수와 더덕 물 추출물이 비장세포 증식과 사이토카인 분비를 촉진시킨 효과에 대해 보고된 바 있으며(Ryu HS 2011; Sun JS 1996), 톳과 수수 추출물의 마우스 경구 투여가 항체 생성을 촉진시킨 보고와 NO 활성 효과를 나타내어 면역세포 증진 효과가 있을 것으로 보고된 연구결과가 있다(Park KY 등 2005; Ryu HS 등 2006; Ryu HS 등 2007). 이러한 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 ex vivo 실험을 통해 도라지 추출물의 면역 활성 효과를 살펴보고자 4주간 경구 투여함으로써 도라지 추출물이 마우스 생체 내에서 면역능에 미치는 영향을 관찰하였다. 그 지표로 비장세포 증식능과 복강대식세포에서 분비되는 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) 생성량의 변화를 측정하여 도라지 물 추출물이 마우스 면역능에 미치는 영향을 검색하고자 하였다.

제안 방법

0×10⁶ cell/㎖가 되도록 희석하여 96 well plate의 각 well에 90 ㎕씩 분주하고, 각 군당 mitogen으로 ConA(5 ㎍/㎖), LPS(15㎍/㎖)를 10 ㎕씩 분주하고, 대조군에는 배지를 동량으로 분주하였다. 각 plate 는 37℃, 5% CO₂ incubator(Sanyo)에서 44시간 배양하여 MTT assay를 실시하였다. 배양후 MTT를 10 ㎕ 가하고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 상태에서 4시간 동안 다시 배양한 후 formazan crystal 형성을 유도하였다.
각 군별로 마우스 비장세포 현탁액을 5.0×106 cell/㎖가 되도록 희석하여 96 well plate의 각 well에 90 ㎕씩 분주하고, 각 군당 mitogen으로 ConA(5 ㎍/㎖), LPS(15㎍/㎖)를 10 ㎕씩 분주하고, 대조군에는 배지를 동량으로 분주하였다.
본 연구는 천연식품으로부터 면역 증진능을 갖는 식품소재 연구의 일환으로써 도라지 면역 증강 효과를 검색하고자 하였다. 도라지 물 추출물을 4주간 격일로 체중 ㎏당 50 ㎎/㎏ BW와 500 ㎎/㎏ BW의 두 농도로 각각 마우스에 경구 투여한후 비장세포 증식능과 활성 복강 대식세포에서 분비하는 사이토카인 분비능을 측정하였다. 그 결과, 도라지 추출물 투여 군에서 500 ㎎/㎏ BW 농도에서 비장세포 증식능 효과를 보 였다.
도라지 물 추출물을 경구 투여한 마우스의 복강내 대식세포를 추출하여 배양시킨 다음 배양상층액으로부터 분비되는 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 분비량을 각각 측정하였다.
도라지 추출물을 경구 투여한 마우스의 복강 내 대식세포를 추출하여 배양시킨 다음, 배양 상층액으로부터 분비되는 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) 분비량을 각각 측정하였다.
마우스 복강 대식세포의 IL-1β, IL-6, TNF-α 함량은 ELISA cytokine kit(R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
Ex vivo 실험에서는 도라지 물 추출물을 멸균 증류수로 용해시킨 후 적정 농도로 희석하여 사용하였다. 마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여군으로 나누었으며, 대조군에는 생리 식염수를, 투여군에는 검액을 각각 50 ㎎/㎏ BW/day와 500 ㎎/㎏ BW/day씩 4주간 격일로 경구 투여하였다.
배양한 plate를 완충용액으로 3회 세척하고, aspiration을 한 후 streptavidin-HRP solution을 각 well에 100 ㎕ 가해 30분간 실온에서 배양하고, 각 well에 TMB substrate solution 100 ㎕를 첨가하여 30분간 암실 배양 후 stop solution을 가해 반응을 정지시켰다. 반응 정지 30분 이내에 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, standard 사이토카인을 이용하여 작성한 표준곡선을 이용하여 각 well의 사이토카인 분비 농도를 계산하였다.
배양 상층액을 분리하여 IL-1β, IL-6, TNF-α)의 생성량을 ELISA cytokine kit(R&D system, Minneapolis, MN, USA) 를 이용하여 측정하였다.
즉, 10%의 불활성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액을 1×10⁶ cell/㎖의 세포농도가 되도록 분산시켜 24-well plate의각 well에 1,000 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ incubator(Sanyo)에서 2시간 배양한다. 배지 교환을 위해 상층액을 걷고, 각 well 에 10%의 불활성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액을 900㎕, 대식세포를 활성화시키는 mitogen인 LPS와 배지를 100㎕ 가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator(Sanyo)에서 48시간 배양하였다. 배양 상층액을 분리하여 IL-1β, IL-6, TNF-α)의 생성량을 ELISA cytokine kit(R&D system, Minneapolis, MN, USA) 를 이용하여 측정하였다.
본 실험에서는 도라지 물 추출물을 50 ㎎/㎏ B.W.와 500 ㎎/㎏ B.W.의 농도로 경구 투여한 마우스로부터 복강 대식세포를 분리해 낸 다음, 활성화된 대식세포가 생성해 낸 IL-1β, IL-6, TNF-α의 분비량을 측정하였고, 각 군별 양성 대조군으로는 LPS(15 ㎎/㎖)로 자극한 대식세포로부터 분비된 cytokine을 측정함으로써 대식세포의 활성화에 대한 지표로 삼았다.
도라지 추출물을 경구 투여한 마우스의 복강 내 대식세포를 추출하여 배양시킨 다음, 배양 상층액으로부터 분비되는 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) 분비량을 각각 측정하였다. 비부착성 세포를 제거하고, 부착성 세포 만을 얻은 후, 10%-FBS RPMI 1640 900 ㎕와 대식세포를 활성화시키는 mitogen인 LPS와 배지를 100 ㎕ 가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator(Sanyo, Osaka, Japan)에서 48시간 배양하였다. 마우스 복강 대식세포의 IL-1β, IL-6, TNF-α 함량은 ELISA cytokine kit(R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
실험 동물실 온도는 22±2℃, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기 (Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.

대상 데이터

도라지 추출물은 동결 건조된 시료를 증류수로 환류 냉각시키면서 80℃ 수욕상에서 3시간씩 3회 반복 추출한 후, 감압농축하여 물 추출물을 얻었다. 본 연구에 사용된 동물은 6~7주령된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터(Eumsung, Korea)로부터 분양 받아 고형 사료(중앙실험동물)와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 동물실 온도는 22±2℃, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기 (Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
본 연구에 사용된 배지는 RPMI medium 1640의 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였고, fetal bovine serum(FBS), lipopolysaccharide(LPS), concanavalin A(ConA), thioglycollate, sodium bicarbonate, ammonium chloride, TRIZMA ⓡ base, TRIZMAⓡ hydrochloride, trypan blue solution(0.4%), DMSO(dimethyl sulfide), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 등의 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

데이터처리

1) The data present the mean values±S.D. n=4 The different letters within every mitogen groups are significantly different from each other at p<0.05 as determined by Duncan's multiple range test.
모든 연구 결과의 자료는 통계 프로그램인 SAS(Statistic Analysis System)를 이용하여 평균 및 표준편차를 계산하였으며, 군간의 비교에서 각각의 요인은 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA)을 사용하였고, Duncan's multiple range test 로 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

성능/효과

4주 동안 도라지 물 추출물을 투여한 결과, LPS로 처리하지 않은 경우, 50 ㎎/㎏ BW와 500 ㎎/㎏ BW 농도에서 302.40±155.51 pg/㎖, 308.02±174.94 pg/㎖로 도라지 물 추출물을 투여하지 않은 대조군 (290.39±95.58 pg/㎖)에 유의적인 차이를 보이지 않았다.
4주 투여군에서 LPS로 처리하지 않은 경우, 50 ㎎/㎏ B.W.와 500 ㎎/㎏ B.W. 농도에서 각각 219.21±95.63 pg/㎖와 371.32±75.59 pg/㎖를 보였으며, LPS를 처리한 경우 50 ㎎/㎏ B.W.의 농도에서 317.09±78.20 pg/㎖로 차이를 볼 수 없었고, 500 ㎎/㎏ B.W.의 농도에서는 대조군 (437.67±50.21 pg/㎖)에 비해 495.72±60.21pg/㎖로 높게 나타났다.
LPS 첨가 시에는 50 ㎎/㎏ BW 농도군에서 1,761.21±61.27 pg/㎖로 대조군(1,600.52±30.54 pg/㎖)에 비해 유의적으로 높은 분비량을 나타냈으며, 500 ㎎/㎏ B.W.의 농도에서도 2,002.37±55.42 pg/㎖로 유의적인 차이를 보였다.
05). 결과에 따르면 도라지 물 추출물을 4주 동안 투여한 경우, 50 ㎎/㎏ BW는 대조군에 비해 증식능에 유의적인 변화는 보이지 않았으나 다소 높게 나타났고, 500 ㎎/㎏ BW는 투여군에서 유의적으로 높은 증식능을 보여주었다. 이러한 도라지 추출물의 결과는 더덕의 물 추출물 효과와 유사한 경향을 보여주었다(Ryu HS 등 2009).
도라지 물 추출물을 4주간 격일로 체중 ㎏당 50 ㎎/㎏ BW와 500 ㎎/㎏ BW의 두 농도로 각각 마우스에 경구 투여한후 비장세포 증식능과 활성 복강 대식세포에서 분비하는 사이토카인 분비능을 측정하였다. 그 결과, 도라지 추출물 투여 군에서 500 ㎎/㎏ BW 농도에서 비장세포 증식능 효과를 보 였다. 활성 복강 대식세포에 의한 사이토카인 분비량을 측정한 결과, IL-1β, IL-6, TNF-α에서도 500 ㎎/㎏ BW 농도에서 유의적으로 증가하는 경향을 보였다.
도라지 물 추출물을 경구투여한 ex vivo 실험에서 세포성 면역과 연관되어 T세포를 선택적으로 증식시키는 미토젠인 ConA 첨가 시 500 ㎎/㎏ B.W의 농도에서는 유의적인 차이를 보였다(p<0.05).
따라서 본 실험의 도라지 물 추출물을 경구 투여한 마우스의 대식세포에서 IL-1β분비량이 대조군에 비해 유의적으로 증가되어 도라지 물 추출물이 마우스의 복강 대식세포를 활성화하여 IL-1β 생성을 촉진시킴으로써 면역 증강 효과에 영향을 미칠 가능성이 있을 것으로 사료된다.
이상의 결과를 종합해 볼 때 500 ㎎/㎏ BW 농도의 도라지 추출물 경구 투여 시, 마우스 비장세포 증식능과 사이토카인 분비능에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 이는 도라지 추출물의 500 ㎎/㎏ BW 농도의 투여가 마우스 비장세포의 증식과 대식세포의 활성화를 유도함으로써 면역기능을 증강시킬수 있는 가능성이 있음을 보여주는 결과라 사료된다.
활성 복강 대식세포에 의한 사이토카인 분비량을 측정한 결과, IL-1β, IL-6, TNF-α에서도 500 ㎎/㎏ BW 농도에서 유의적으로 증가하는 경향을 보였다.

후속연구

톳 열수 추출물(Jung YH 2003)의 IL-6 생성량을 검색한 실험에서 10, 100 ㎍/㎖의 농도에서 대조군보다 높은 IL-6생성량을 보여주었고, 생강 추출물의 경우도 10, 100 ㎍/㎖에서 유의적으로 높은 IL-6의 생성량을 나타내었다(Ryu 등 2006). 이러 결과에 비추어 볼 때 도라지 물 추출물이 마우스의 복강 대식세포를 활성화시켜 IL-6의 생성을 촉진시킴으로써 면역기능 증강에 기여할 가능성이 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	도라지는 분류학상 무슨 과에 속하는가?	도라지(Platycodon grandiflorum)는 초록과에 속하는 다년생 식물로서, 한국을 비롯한 중국, 일본 등지의 산간지방에서 널리 자생한다. 도라지의 약리 효과는 예로부터 널리 알려져왔으므로(Hong MW 1975) 한방에서는 약재로 사용되기도 하고, 우리나라에서는 전통적인 일반 식품으로도 널리 이용되고 있다.
	도라지의 자생지는?	도라지(Platycodon grandiflorum)는 초록과에 속하는 다년생 식물로서, 한국을 비롯한 중국, 일본 등지의 산간지방에서 널리 자생한다. 도라지의 약리 효과는 예로부터 널리 알려져왔으므로(Hong MW 1975) 한방에서는 약재로 사용되기도 하고, 우리나라에서는 전통적인 일반 식품으로도 널리 이용되고 있다.
	도라지의 약리 효과를 내는 성분 중 사포닌의 효능은?	도라지의 약리 효과를 내는 성분 연구는 aglycone인 platycodigenin이 분리된 후 sapogenin의 구조가 알려지면서 본격화 되었고(Kubota 등 1969), 그 후에 17종의 saponin 구조가 추가로 밝혀졌다(Ishii H 등 1984). 동물실험을 통해 밝혀진 사포닌의 효능은 거담 작용, 위액 분비 억제 작용, 혈당 강화 작용, 콜레스테롤 대사 개선 작용(Kim KS 등 1995; Lee EB 1975; Lee JY 등 2004), 항산화, 항암 효과(Kim YS 등 1998; Shon MY 2001 등) 등 다양하게 알려져 있다. 이와 같은 다양한 약리 효과에 대한 실험이 밝혀져 있는 반면, 도라지를 이용한 면역기능 증강 효과에 연구는 미미한 실정이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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