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문제 정의
- 한편, 산사에 관한 주요 연구로는 콜레스테롤 합성과 저장에 관여하는 HMG-CoA reductase 효소 활성 저해(18), 산사 methanol 엑스에서 분리된 ursolic acid 및 (-)-epicatechin, quercetin 등의 monoamine oxidase 활성 억제(19), D-galactose 로 노화를 유발시킨 흰쥐 적혈구의 SOD와 GSH-px 활성 증가 및 혈장 내 총 지방 농도의 감소 효과(20) 등에 대한 연구가 이루어지고 있으나 항산화 효과에 대한 지속적인 연구는 미비한 실정이다. 이에, 본 연구에서는 산사의 천연 항산화제로서의 활용 가능성을 모색하기 위하여 산사 과육을 용매별로 추출한 후 항산화 활성을 조사하여 biohealth 기능성 식품 소재로 활용하기 위한 기초자료를 얻고자 실시하였다.
제안 방법
- 산사 과육을 70% methanol, 70% ethanol, chloroform:methanol (CM, 2:1, v/v), n-butanol, ethyl acetate(EA)로 추출하여 시료 농도 0.2 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.8 mg/mL 농도에서 각 추출물의 항산화 활성을 비교하였다. DPPH radical 소거 활성은 70% methanol, 70% ethanol, chloroform:methanol(2:1, v/v), ethyl acetate, n-butanol 추출물 순으로 높게 측정되었고 특히 70% methanol 및 70% ethanol 추출물은 다른 추출물에 비하여 유의적으로 높은 것으로 나타났으며(p<0.
- 5 mL를 가하여 25℃에서 150분간 반응시켰다. 여기에 1% sulfanilamide 1 mL 및 0.1% naphtylethylenediamide 1 mL를 가한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며 다음의 식에 의하여 NO radical 소거 활성을 계산하였다.
- 진공 동결된 건조 산사 분말 100 g을 취해 70% methanol, 70% ethanol, chloroform :methanol(CM, 2:1, v/v), n-butanol, ethyl acetate (EA) 용매를 10배 가하여(1:10, w/v) 24시간 동안 추출하는 과정을 총 2회 실시한 후 여과(filter paper, Advantec, No.1, Tokyo, Japan)하였다. 각 여과액을 rotary evaporator (N-N series, EYELA)로 40℃에서 농축하여 용매를 완전히 제거한 후, -80℃(SW-UF-400, Samwon Co.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 산사는 2011년 10월 중하순 강원도 정선군 남면 일대에서 자생하는 야생 산사를 채취한 후과육을 분리하여 시료로 사용하였다. 분리한 과육은 진공 동결건조(FDU-2000, EYELA, Tokyo, Japan) 시킨 후 분쇄기(DCM-5500, Daechang, Seongnam, Korea)로 마쇄하여-80℃(SW-UF-400, Samwon Co.
- )에 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다(21). 시료의 수율은 추출 전 시료 중량에 대한 추출 후 건조 중량 백분율로 나타내었고, 용매별 추출 수율은 70% methanol 추출물 60.45%, 70% ethanol 추출물 59.79%, chloroform:methanol (2:1, v/v) 추출물 31.18%, n-butanol 추출물 13.24%, ethyl acetate 추출물 5.05%를 얻어 본 실험의 시료로 사용하였다.
- 산사 과육의 추출 용매별 FRAP 활성은 Jeong 등(24)의 방법에 의하여 측정하였다. 즉, 0.3 M sodium acetate buffer (pH 3.6) 및 10 mM 2,4,6-tripyridyl-S-triazine(TPTZ) solution, 20 mM ferric chloride를 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 37℃에서 10분간 방치시켜 FRAP 시약을 조제하여 실험에 사용하였다. 시료 0.
이론/모형
- 산사 과육의 전자공여능(electron donating ability, EDA) 은 Blois (22)의 방법에 준하여 측정하였다. 시료 1 mL와 0.
- 산사 과육의 추출 용매별 FRAP 활성은 Jeong 등(24)의 방법에 의하여 측정하였다. 즉, 0.
- 산사 과육의 추출 용매별 NO radical 소거 활성은 Yang 등(26)과 Shrishailappa 등(27)의 방법에 따라 시료 0.5 mL에 10 mM sodium nitroprusside 0.5 mL를 가하여 25℃에서 150분간 반응시켰다. 여기에 1% sulfanilamide 1 mL 및 0.
성능/효과
- 1과 같으며 대조군인 ascorbic acid를 제외한 모든 실험군에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 70% methanol 추출물은 0.2 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.8 mg/mL 농도에서 각각 28.21%, 64.52%, 92.89%로 나타나 추출 용매 중 가장 높은 활성을 보였고 70% ethanol 추출물은 농도별로 27.58%, 62.81%, 91.17%로 70% methanol 다음으로 높은 활성을 나타내었다. Chloroform:methanol (2:1, v/v) 추출물은 18.
- 33%로 ethyl acetate 추출물 다음으로 낮은 소거 활성을 나타내었다. 70% methanol 추출물은 농도별로 14.03%, 28.79%, 41.63%, 70% ethanol 추출물은 농도별로 각각 13.90%, 27.22%, 39.62%의 소거 활성을 나타내었다. n-butanol은 농도별로 26.
- 05). ABTS radical 소거 활성은 DPPH와 동일한 경향이었으며 0.8 mg/mL 농도에서 70% methanol 및 70% ethanol 추출물은 각각 75.81%, 74.73%의 활성을 나타내었다. NO radical 소거 활성은 70% methanol, 70% ethanol, ethyl acetate, n-butanol, chloroform:methanol(2:1, v/v) 추출물 순으로 나타났고, hydroxyl radical 소거 활성은 n-butanol, 70% methanol, 70% ethanol, chloroform: methanol(2:1, v/v), ethyl acetate 추출물 순으로 측정되었다.
- 17%로 70% methanol 다음으로 높은 활성을 나타내었다. Chloroform:methanol (2:1, v/v) 추출물은 18.61%, 38.77%, 59.34%, ethyl acetate 추출물은 18.01%, 38.17%, 58.06%의 활성을 나타내었으며, n-butanol 추출물은 17.47%, 37.42%, 57.77%로 나타나 추출 용매 중 가장 낮은 활성을 보였다. 대조군인 ascorbic acid는 농도별로 95.
- 73%를 나타내어 70% methanol 다음으로 높은 활성을 보였다. Chloroform:methanol(2:1, v/v) 추출물은 농도별로 각각 12.24%, 29.24%, 49.27%를 나타내어 70% ethanol 추출물 다음으로 높은 활성을 나타내었다. Ethyl acetate 추출물은 시료 농도별로 11.
- DPPH radical scavenging activity 산사 과육의 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)에 대한 전자공여능은 Fig. 1과 같으며 대조군인 ascorbic acid를 제외한 모든 실험군에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 70% methanol 추출물은 0.
- DPPH radical 소거 활성은 70% methanol, 70% ethanol, chloroform:methanol(2:1, v/v), ethyl acetate, n-butanol 추출물 순으로 높게 측정되었고 특히 70% methanol 및 70% ethanol 추출물은 다른 추출물에 비하여 유의적으로 높은 것으로 나타났으며(p<0.05), 0.8 mg/mL 농도에서 각각 92.89%, 91.17%의 높은 활성을 나타내었다.
- 27%를 나타내어 70% ethanol 추출물 다음으로 높은 활성을 나타내었다. Ethyl acetate 추출물은 시료 농도별로 11.51%, 27.77%, 48.24%로 나타났고, n-butanol 추출물은 11.31%, 27.47%, 46.72%로 용매 추출물 중 가장 낮은 활성을 보였다. 표준물질인 ascorbic acid는 농도별로 99.
- 21%를 보였다. Ethyl acetate 추출물이 17.00%, 23.11%, 32.61%로 70% methanol 및 70% ethanol 추출물 다음으로 높은 소거 활성을 나타내 었고 n-butanol 추출물이 농도별로 각각 13.44%, 23.09%, 30.40%로 ethyl acetate 추출물 다음으로 높은 소거능을 보였다. Chloroform:methanol(2:1, v/v) 추출물이 4.
- 6과 같으며 모든 추출물에서 농도가 증가함에 따라 소거 활성도 증가하는 것으로 나타났다. Ethyl acetate 추출물이 농도별로 각각 3.67%, 11.08%, 20.65%로 나타나 추출 용매 중가장 낮은 소거 활성을 보였다. 또한, chloroform:methanol(2:1, v/v) 추출물은 10.
- Hydroxyl radical 소거 활성을 제외한 다른 실험 결과에서 70% methanol 및 70% ethanol 추출물은 다른 용매 추출물에 비하여 유의적으로 높은 것으로 나타났고 chloroform: methanol(2:1, v/v), ethyl acetate, n-butanol 추출물 간에는 대부분 유의성이 없는 것으로 측정되었다(p<0.05).
- 62%의 소거 활성을 나타내었다. n-butanol은 농도별로 26.52%, 40.83%, 47.44%의 소거능을 보여 추출 용매 중 가장 높게 나타났다. 대조군인 BHA는 농도별로 각각 89.
- 5와 같으며, 모든 추출물에서 농도 의존적으로 활성의 증가를 나타내었다. 과육의 70% methanol 추출물은 시료 농도별로 25.24%, 30.37%, 38.85%의 소거 활성을 보였고, 70% ethanol 추출물은 농도별로 17.72%, 29.10%, 36.21%를 보였다. Ethyl acetate 추출물이 17.
- 29%의 소거 활성을 보여 용매 추출물 중 가장 낮았다. 대조군인 BHA는 농도별로 43.68%, 94.34%, 95.30%를 나타내었으며 용매별 추출물과도 유의적인 차이를 나타내는 것으로 확인 되었다.
- 44%의 소거능을 보여 추출 용매 중 가장 높게 나타났다. 대조군인 BHA는 농도별로 각각 89.23%, 90.59%, 92.03%를 나타내어 다른 용매 추출물보다 높은 소거능을 보였다.
- 77%로 나타나 추출 용매 중 가장 낮은 활성을 보였다. 대조군인 ascorbic acid는 농도별로 95.92%, 95.98% 및 95.98%의 활성을 나타내는 것으로 측정되었다.
- 409를 나타내어 70% methanol 추출물의 활성이 높게 나타났다. 또한 chloroform:methanol(2:1, v/v) 추출물은 농도별로 0.070, 0.151, 0.250의 활성을 나타내었으며, ethyl acetate 추출물이 0.070, 0.159, 0.264를 나타내어 ethyl acetate 추출물이 높은 활성을 나타내었다. n-butanol 추출물은 농도별로 0.
- 303)에 비하여 낮게 나타나 유의적인 차이를 보였다. 또한, 산사 과육의 모든 용매 추출물에서 농도별로 유의적인 차이를 나타내었으며 과육의 70% methanol 추출물이 농도별로 각각 0.073, 0.149, 0.242로 다른 용매 추출물에 비하여 가장 높은 환원력을 나타내었다. 70% ethanol이 0.
- Park 등(8)에 의하면 산사 methanol 추출물에 있어서 용매 분획물의 DPPH 활성은 methanol 추출물과 ethyl acetate 및 butanol 분획물이 대조군인 α-tocopherol 과 비슷한 활성을 나타내었다고 하였다. 또한, 산약 및 살구씨, 산사, 지실을 물과 ethanol로 추출한 결과, 물 및 ethanol 추출물 모두에서 산사의 전자공여능이 가장 높게 나타났으며 특히, ethanol 추출물 1,000 ppm 농도에서 89%의 높은 활성을 보여 산사는 free radical에 의한 lipid peroxidation을 감소시키는 효과가 높은 것으로 확인되어 있다(32).
- 0%의 활성을 보였다고 한다(48). 본 실험 결과 n-butanol 및 70% methanol 추출물에서 hydroxyl radical 소거 활성이 높게 나타났다.
- 05). 본 실험 결과 산사 과육 추출물의 항산화 활성은 우수한 것으로 나타났고 특히, 70% methanol 및 70% ethanol 추출물에서 높은 활성을 보였다. 따라서 산사는 천연 항산화제 및 기능성 식품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 4와 같이, 대조군인 ascorbic acid 및 trolox를 제외한 용매간의 활성도는 농도 의존적으로 증가하였으며 유의적인 차이를 나타내었다. 산사 과육의 70% methanol 추출물은 시료 농도별로 18.41%, 44.96%, 75.81%를 나타내어 용매 추출물 중 가장 높은 활성을 나타내었으며, 70% ethanol 추출물은 각각 18.27%, 44.42%, 74.73%를 나타내어 70% methanol 다음으로 높은 활성을 보였다. Chloroform:methanol(2:1, v/v) 추출물은 농도별로 각각 12.
- ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt] radical 소거 활성의 측정은 시료 중의 항산화 물질이 ABTS radical을 제거하여 탈색되는 정도를 흡광도를 통해서 측정하는 방법으로, DPPH 시험법은 free radical을 제거하는 것과 달리 ABTS 시험법은 양이온을 제거하기 때문에 radical 제거 능력에서 차이를 보이며 지용성 및 수용성 물질을 모두 측정할 수 있다는 장점이 있다(39,40). 산사 과육의 ABTS radical 소거 활성은 Fig. 4와 같이, 대조군인 ascorbic acid 및 trolox를 제외한 용매간의 활성도는 농도 의존적으로 증가하였으며 유의적인 차이를 나타내었다. 산사 과육의 70% methanol 추출물은 시료 농도별로 18.
- 가 반응하는 Fenton's reaction에 의해 생성되는 반응성이 강한 free radical로 지질, 단백질, poly peptide 및 DNA 등과 반응한다고 알려져 있으며, Fenton system에 의해 생성되어진 hydroxyl radical 이 2-deoxyribose를 산화시켜 malondialdehyde(MDA)로 분해시키는 원리를 이용하여 측정한다고 보고되어져 있다 (29,46). 산사 과육의 hydroxyl radical 소거 활성은 Fig. 6과 같으며 모든 추출물에서 농도가 증가함에 따라 소거 활성도 증가하는 것으로 나타났다. Ethyl acetate 추출물이 농도별로 각각 3.
- 의 농도로 시료의 환원력을 측정 할 수 있으며, 흡광도 수치 그 자체로 환원력을 나타내므로 환원력이 우수 할수록 흡광도 수치가 크며 진하게 발색되는 것으로 알려져 있다(33). 산사 과육의 농도별 환원력은 Fig. 2와 같이 시료 추출물의 농도가 높을수록 환원력은 증가하였으나 대조군인 ascorbic acid(0.615, 1.340, 2.303)에 비하여 낮게 나타나 유의적인 차이를 보였다. 또한, 산사 과육의 모든 용매 추출물에서 농도별로 유의적인 차이를 나타내었으며 과육의 70% methanol 추출물이 농도별로 각각 0.
- 용매별 추출물의 NO radical 소거 활성은 Fig. 5와 같으며, 모든 추출물에서 농도 의존적으로 활성의 증가를 나타내었다. 과육의 70% methanol 추출물은 시료 농도별로 25.
- 72%로 용매 추출물 중 가장 낮은 활성을 보였다. 표준물질인 ascorbic acid는 농도별로 99.56%, 99.66%, 99.76%를 나타내었고, trolox는 농도별로 각각 95.10%, 98.82%, 98.87%의 활성을 보여 전 농도에서 95% 이상의 높은 활성을 나타내었다. 한편, 대추 열매의 ABTS 소거 활성은 20% 미만이었으나 잎에서는 최고 98.
- 환원력과 ferric reducing antioxidant power(FRAP)는 동일한 경향을 나타내었는데 활성은 70% methanol, 70% ethanol, n-butanol, ethyl acetate, chloroform: methanol(2:1, v/v) 추출물 순으로 높게 나타났으며, 70% methanol 및 70% ethanol 추출물이 다른 추출물에 비하여 높은 것으로 측정되었다(p<0.05).
후속연구
- 녹색 함초 25% ethanol 추출물은 빨간 함초 25% ethanol 추출물보다 높은 소거능을 보였고 시료 농도가 증가할수록 높아지는 경향을 나타내었으며(28), 산사 및 인삼 15 g의 추출물은 염증성 반응에 중요한 영향을 하는 NO의 생성을 억제하여 Alzheimer성 치매의 치료에 유효할 것이라고 보고되어 있다(45). 따라서 산사는 NO radical 소거능이 뛰어나 기능성 소재로서 응용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 실험 결과 산사 과육 추출물의 항산화 활성은 우수한 것으로 나타났고 특히, 70% methanol 및 70% ethanol 추출물에서 높은 활성을 보였다. 따라서 산사는 천연 항산화제 및 기능성 식품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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