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문제 정의
- 본 연구에서 우리는 MrTS의 모발성장 효능을 모낭의 성장기 유도능력에 초점을 맞추어 관찰하였다. 연구 결과 MrTS는 C57BL/6 마우스에서 모낭 기질의 세포증식과 성장기의 유도를 통하여 모발의 두께와 성장을 촉진시켰음을 확인하였다(Fig.
- 최근 미세침의 기계적 자극이 콜라겐 합성을 유도함으로써 피부 흉터와 주름개선에 효과가 있다는 경험으로 임상가에서 다용되고 있다. 본 연구에서는 피부결합조직의 재생을 유도하는 것으로 알려진 미세침 치료법이 피하 모낭 조직의 성장 대한 가능성을 관찰하고자 설계를 하였으며, 육안적, 현미경적 관찰을 통하여 모발성장 효과가 있음을 확인하였다.
- 피부 표면의 미약한 손상은 손상에 대한 수복을 유도함으로써 여러 수복인자들을 발현한다23,24). 본 연구에서는 피부조직의 손상에 따른 수복인자들의 발현을 통한 피부조직 재생은 모낭의 성장에 영향을 줄 수 있을 것으로 기대되어 본 실험을 설계하게 되었다.
제안 방법
- 제모 후 1일부터 16일까지 하루 1회씩 생리식염수와 미녹시딜은 외용도포하였고, 미세침은 마우스의 등피부의 머리쪽 부분에서 꼬리쪽 부분으로 3회 롤링시켰다. 16일 후 모발의 성장상태를 dermoscopy(Sometech, Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 육안적으로 관찰하였다.
- MrTS가 모발의 성장과 관련된 유전자의 발현을 얼마나 유도하는지 관찰하였다. 16일 동안 처치한 마우스의 등 피부조직으로부터 total RNA를 추출한 후 모발성장연관 인자인 VEGF 수용체 2, FGF-2, EFG에 대하여 semi-quantitative RT-PCR을 시행하였다. Figure 5에서 보는 바와 같이 MrTS는 미녹시딜 처치군과 더불어 피부조직 내 VEGFR-2, FGF-2, EGF mRNA의 발현을 증기시켰다.
- Bromodeoxyuridine (BrdU)은 증식하는 조직을 추적하는데 사용되는 물질16) 로 제모 후 1일부터 3일까지 50 μg/g b.w.의 농도로 하루 3번 복강주사를 하였다.
- C57BL/6 마우스의 등 피부 조직에서 모발성장과 연관된 단백질들의 발현을 관찰하고자 면역조직염색을 시행하였다. 증식하고 있는 세포를 추적하는데 사용되는 표지자인 BrdU는 MrTS 처치군에서 표피상피세포에서부터, 진피층의 진피유두, 내외모근초에 이르기까지 널리 양성반응을 보이고 있었다.
- C57BL/6 생쥐를 한 군에 5마리씩 배정하여 생리식염수를 도포한 음성대조군과 5% 미녹시딜을 도포한 양성대조군, MrTS 를 시술한 실험군으로 나누어 진행하였다. 16일 처치 후 육안적 현미경적 관찰소견은 Fig.
- Data는 mean ± SD (standard deviation)로 표시하였으며, 적어도 세 번의 반복 실험을 하였다.
- Fibroblast growth factor(FGF)와 vascular endothelial growth factor(VEGF)에 대한 1차 항체는 fibroblast growth factor(FGF, 1:80, Santa Cruz, CA, USA), vascular endothelial growth factor(VEGF, 1:50, Santa Cruz, CA, USA),를 이용하였고, 4℃의 moisture chamber에서 24시간 염색하였다. 2차 항체는 1차 항체 반응 후 5분간 3회 0.
- PCR product는 1% agarose gel에서 전기영동하였고, ethidium bromide로 염색을 한 후 Gel Doc(Bio-Rad, USA)을 사용하여 관찰하였다. GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 internal control로 사용하여 VEGFR-2, FGF-2, EGF의 발현을 상대적으로 평가하였다. PCR에 사용된 primer는 Table 1과 같다.
- MrTS가 동일한 면적에서 얼마나 더 많은 모발을 만들었는지(모발의 밀도)와 모낭기질의 부피에 비례하는 모발의 두께를 얼마나 증가시켰는지 관찰하고자 handscope를 100배, 400배 확대하여 관찰하였다. 관찰한 결과 MrTS는 생리식염수 투여군에 비하여 동일 면적에서 더 많은 모발의 형성을 유도하였으며(그림 3, ×100), 단일 모발의 두께도 미녹시딜과 동등한 수준으로 증가시켰다(Fig.
- MrTS가 모발의 성장과 관련된 유전자의 발현을 얼마나 유도하는지 관찰하였다. 16일 동안 처치한 마우스의 등 피부조직으로부터 total RNA를 추출한 후 모발성장연관 인자인 VEGF 수용체 2, FGF-2, EFG에 대하여 semi-quantitative RT-PCR을 시행하였다.
- 각각의 cycle은 95℃에서 30초 동안 denaturation,55-60℃에서 30초 동안 annealing, 72℃에서 40초 동안 extension시켰다. PCR product는 1% agarose gel에서 전기영동하였고, ethidium bromide로 염색을 한 후 Gel Doc(Bio-Rad, USA)을 사용하여 관찰하였다. GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 internal control로 사용하여 VEGFR-2, FGF-2, EGF의 발현을 상대적으로 평가하였다.
- PCR 증폭을 하기 위하여 TaqPCRxDNA polymerase, Recombinant(Invitrogen)을 사용하였고, 반응조건은 다음과 같이 하였다. 95℃에서 5분간 초기 denaturation 시킨 후 30 cycle 을 증폭시켰다.
- Total RNA는 Trizol reagent(Invitrogen)를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다. Spectrophotometer를 이용하여 RNA 의 농도를 측량한 후 M-MLV reverse transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)에 의하여 cDNA를 합성하였고, specific primer 들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다.
- 그 후 다시 0.1 M PBS로 15분간 2회 수세하고 나서 30 mg의 3-3' diaminobenzidine를 150 ml의 0.1 M PBS에 녹인 용액에서 5분간 반응시킨 후 과산화수소를 0.005% 되게 첨가하여 갈색의 발색반응을 약 15분간 시행하였다.
- 이어서 7-μm 의 두께로 자른 후 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 하고 광학현미경을 통하여 모낭의 변화를 관찰하였다.
- 처치 16일 후 C57BL/6 마우스의 등쪽 피부를 절개하여 채취한 후 bouin solution에 24시간 동안 실온에서 고정을 시켰다. 이어서 탈수, 건조, 침투과정을 거친 후 파라핀에 포매를 하였다. 이어서 7-μm의 두께로 자른 후 hematoxylin & eosin(H&E) 염색을 하고 광학현미경을 통하여 모낭의 변화를 관찰하였다.
- 간단히 서술하면, 모낭 주기가 휴지기로 들어갔음을 시사하는 분홍 피부색을 띈 생후 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 등을 클리퍼와제모제를 이용하여 제모함으로써 성장기를 유도하였다. 제모 후 1일부터 16일까지 하루 1회씩 생리식염수와 미녹시딜은 외용도포하였고, 미세침은 마우스의 등피부의 머리쪽 부분에서 꼬리쪽 부분으로 3회 롤링시켰다. 16일 후 모발의 성장상태를 dermoscopy(Sometech, Inc.
- 의 농도로 하루 3번 복강주사를 하였다. 처치 16일 후 C57BL/6 마우스의 등쪽 피부조직을 채취하여 BrdU에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다. BrdU 에 대한 1차 항체는 mouse anti-BrdU antibody(Santa Cruz, CA, USA)를 1:50으로 희석하여 조직절편에 떨어드려 실온에서 2시간 반응시켰다.
- 사육실은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%에서 12시간씩 밤낮을 유지하였다. 총 15마리를 다음과 같이 3군으로 나누어 군당 5마리씩 배정하여 실험을 진행하였다; 생리식염수 처치군(음성대조군), 미녹시딜 처치군(양성대조군), 미세침 처치군(실험군). 본 연구에서 포함된 동물실험계획서는 부산대학교 동물실험 윤리위원회(PNU-IACUC)에 의해 동물실험의 윤리성과 과학성에 대한 검토를 받아 적합한 것으로 승인(승인번호 : PNU-2012-0105)을 획득하여 수행되었다.
대상 데이터
- Hair regrowth, as well as darkness of skin, was increased in mice treated with MrTS when compared with control mice. Dorsal skin was taken from C57BL/6 mice and examined after staining with hematoxylin and eosin.
- 1과 같다. 간단히 서술하면, 모낭 주기가 휴지기로 들어갔음을 시사하는 분홍 피부색을 띈 생후 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 등을 클리퍼와제모제를 이용하여 제모함으로써 성장기를 유도하였다. 제모 후 1일부터 16일까지 하루 1회씩 생리식염수와 미녹시딜은 외용도포하였고, 미세침은 마우스의 등피부의 머리쪽 부분에서 꼬리쪽 부분으로 3회 롤링시켰다.
- 본 실험에 사용된 미세침(Mi-Roll 0.5)은 DS Tech(Okcheon, Korea)으로부터 구입하였다.
- 생후 7주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 샘타코(Osan, Korea)로부터 구입하여 1주간 동물 사육실 환경에서 적응을 시켰다. 사육실은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%에서 12시간씩 밤낮을 유지하였다.
데이터처리
- Data는 mean±SD (standard deviation)로 표시하였으며, 적어도 세 번의 반복 실험을 하였다. 각 군들을 비교하고자 one-way analysis of variance(ANOVA) 검사를 사용하였다. P values가 0.
이론/모형
- Fibroblast growth factor(FGF)와 vascular endothelial growth factor(VEGF)에 대한 1차 항체는 fibroblast growth factor(FGF, 1:80, Santa Cruz, CA, USA), vascular endothelial growth factor(VEGF, 1:50, Santa Cruz, CA, USA),를 이용하였고, 4℃의 moisture chamber에서 24시간 염색하였다. 2차 항체는 1차 항체 반응 후 5분간 3회 0.1 M PBS로 수세과정을 거친 후에 Hsu 등(1981)의 방법에 따라 biotinylated anti-IgG(Vector Laboratories, Inc., CA, USA)를 1:200으로 희석한 후 실온의 moisture chamber에서 30분 반응시켰다. 다시 5분간 3회 0.
- Total RNA는 Trizol reagent(Invitrogen)를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다. Spectrophotometer를 이용하여 RNA 의 농도를 측량한 후 M-MLV reverse transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)에 의하여 cDNA를 합성하였고, specific primer 들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다.
- 본 연구에서 이용된 방법은 식약처 양모제 효력평가시험법 가이드라인에 준하였으며, 실험설계도는 Fig. 1과 같다. 간단히 서술하면, 모낭 주기가 휴지기로 들어갔음을 시사하는 분홍 피부색을 띈 생후 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 등을 클리퍼와제모제를 이용하여 제모함으로써 성장기를 유도하였다.
성능/효과
- 증식하고 있는 세포를 추적하는데 사용되는 표지자인 BrdU는 MrTS 처치군에서 표피상피세포에서부터, 진피층의 진피유두, 내외모근초에 이르기까지 널리 양성반응을 보이고 있었다. FGF는 표피상피와 외모근초에서 생리식염수 도포군(Con)보다 강한 반응을 보였으나 미녹시딜 도포군보다는 반응이 약했고, VEGF의 발현 역시 생리식염수 도포군과 미녹시딜도포군의 중간정도의 발현양 상을 보였다(Fig. 4).
- 손상 후 치유과정에서 혈관형성을 주관하는 것으로 알려진 VEGF는 VEGF수용체-2를 통하여 모낭의 진피유두와 외모근초의 세포들을 증식시킴으로써 모발의 성장을 유도하는 것으로 보고되었다26-28). MrTS는 조직에서 VEGF의 발현에는 별다른 영향을 주지 않았으나, 대조군보다는 발현이 증가되었으며(Fig. 4i), VEGFR-2 mRNA의 발현은 유의성 있게 증가하였음을 관찰하였다(Fig. 5).
- 관찰한 결과 MrTS는 생리식염수 투여군에 비하여 동일 면적에서 더 많은 모발의 형성을 유도하였으며(그림 3, ×100), 단일 모발의 두께도 미녹시딜과 동등한 수준으로 증가시켰다(Fig. 3, ×400).
- MrTS는 휴지기 모발을 제거하여 성장기를 맞춘 C57BL/6 마우스에서 모발의 굵기와 성장을 촉진시켰다. 또한 MrTS는 C57BL/6 마우스의 피부조직에서 모낭의 성장을 주관하는 성장인자 중 FGF, VEGF의 발현을 증가시킴과 아울러 EGF, FGF-2, VEGFR-2 mRNA의 발현을 증가시킴으로써 모발주기 가운데 성장기로의 유도를 촉진하였다.
- 이 가운데 FGF는 진피유두를 활성화시키고, 외모근초의 증식을 유도한다고 알려져 있다25). 면역조직화학염색과 RT-PCR분석 결과 MrTS는 FGF 단백질과 FGF-2 mRNA의 조직 내 발현을 증가시켰으나 미녹시딜보다 우수하지는 않았다(Fig. 4f, 5). 손상 후 치유과정에서 혈관형성을 주관하는 것으로 알려진 VEGF는 VEGF수용체-2를 통하여 모낭의 진피유두와 외모근초의 세포들을 증식시킴으로써 모발의 성장을 유도하는 것으로 보고되었다26-28).
- 본 연구에서 우리는 MrTS의 모발성장 효능을 모낭의 성장기 유도능력에 초점을 맞추어 관찰하였다. 연구 결과 MrTS는 C57BL/6 마우스에서 모낭 기질의 세포증식과 성장기의 유도를 통하여 모발의 두께와 성장을 촉진시켰음을 확인하였다(Fig. 2, 3). 피부의 조직학적 관찰 결과 MrTS의 처치를 받은 마우스의 모낭은 미녹시딜처치군과 유사한 정도의 성장기의 형태를 취하고 있었다(Fig.
- C57BL/6 마우스의 등 피부 조직에서 모발성장과 연관된 단백질들의 발현을 관찰하고자 면역조직염색을 시행하였다. 증식하고 있는 세포를 추적하는데 사용되는 표지자인 BrdU는 MrTS 처치군에서 표피상피세포에서부터, 진피층의 진피유두, 내외모근초에 이르기까지 널리 양성반응을 보이고 있었다. FGF는 표피상피와 외모근초에서 생리식염수 도포군(Con)보다 강한 반응을 보였으나 미녹시딜 도포군보다는 반응이 약했고, VEGF의 발현 역시 생리식염수 도포군과 미녹시딜도포군의 중간정도의 발현양 상을 보였다(Fig.
- 2, 3). 피부의 조직학적 관찰 결과 MrTS의 처치를 받은 마우스의 모낭은 미녹시딜처치군과 유사한 정도의 성장기의 형태를 취하고 있었다(Fig. 2). 또한 MrTS는 조직 내에서 증식하는 세포의 표지자로 인식되는 BrdU의 발현을 현저히 증가시켰으며(Fig.
후속연구
- 이상의 결과 MrTS를 통한 피부상피의 미약한 물리적 손상은 수복인자이자 모낭 주기를 조절하는 성장인자인 FGF와 VEGF의 발현에 영향을 주어 모발성장을 유도하였으며, 나아가 모발손상의 외용제의 흡수를 용이하게 할 수 있어 외용요법과 병행함으로써 탈모질환의 치료에 효율적으로 응용될 수 있을 가능성을 제시해 준다.
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