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문제 정의
- 본 연구는 미생물로부터 유래된 5종(AH, AK, AY, PS와 R)의 lipase들을 Amberlite XAD 7에 흡착법으로 고정화 시킨 후 각 immobilized lipase들의 특성을 알아보았다. 고정화 전과 후의 단백질 함량 및 각 free lipase들과 immobilized lipase들을 이용한 interesterification 반응물의 지방산과 TAG 조성을 분석하였다.
- 본 연구에서는 미생물로부터 유래된 free lipase와 이들로부터 adsorption법을 이용하여 제조한 immobilized lipase들의 효소적 interesterification 반응 특성과 재사용성(reusability)을 관찰하고자 하였다. 이를 위하여 카놀라유(canola oil)와 palmitic ethyl ester(PEE), stearic ethyl ester (StEE)를 기질로 사용하였다.
제안 방법
- 이 때 반응 조건은 46℃, 200 rpm으로 laboratory stirrer/hot plate (Corning, PC-420, Oklahoma City, OK, USA)와 항온수조(WBC 1506D, Jeio-tech, Daejeon, Korea)를 이용하였다. 1, 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72시간별로 반응물을 취하였으며 이를 분석에 사용하였다.
- 사용된 효소는 5종의 immobilized lipase(AK, AY, AH, PS와 R)를 이용하였으며 반응은 shaking heating bath (BS-21, Lab Companion, Daejeon, Korea)에서 진행하였다. 1, 3, 9, 48 시간별로 반응물을 취하여 분석에 이용하였으며 그 외의 반응 조건은 free lipase를 이용한 interesterification 반응 조건과 동일하였다.
- Carrier gas는 He을 사용하였으며 1 mL/min으로 유지시키고 시료 1 µL를 GC에 주입하여 지방산 조성을 분석하였다.
- Immobilized lipase 중 위치적 특이성은 크지 않았지만 활성이 높았던 immobilized lipase AK를 scale-up 제조하여 continuous type reactor로 interesterification 반응을 수행할 때 유속의 변화가 반응물의 지방산 조성 변화에 미치는 영향을 살펴보았다(Table 2). 유속을 0.
- Immobilized lipase의 반응 특성을 알아보기 위하여 interesterification 반응을 수행하였다. 사용된 효소는 5종의 immobilized lipase(AK, AY, AH, PS와 R)를 이용하였으며 반응은 shaking heating bath (BS-21, Lab Companion, Daejeon, Korea)에서 진행하였다.
- Immobilized lipase의 재사용 가능성을 확인하기 위하여 50 mL vial에 카놀라유, PEE와 StEE를 1:1:1의 몰 비율로 1g의 기질 혼합물과 각각의 immobilized lipase를 0.1 g (총 기질 무게의 10%)를 혼합하여 반응을 하였다. 이 때 반응 조건은 46℃, 185 rpm으로 9시간 동안 항온교반수조에서 진행하였다.
- Pancreatic lipase (from hog pancreas, Sigma Chemical Co.)를 이용하여 가수분해한 후 triacylglycerol 분자의 위치(sn-2, sn-1.3)에 따른 지방산 조성을 분석하였다. 반응물 10 mg에 1 M TrisHCl buffer (pH 7.
- 마지막으로 70분까지 이를 유지함으로써 분석을 마쳤다(18). TAG의 조성은 retention time (RT)와 partition number (PN) 사이의 관계식을 통하여 분석하였으며 계산식 중 CN은 TG의 전체 탄소수를 의미하며 ND는 총 이중결합의 수를 뜻한다(19).
- 7 HP Resin 350 mg을 6 mL의 ethanol에 20분간 침지 후, 2-3번 distilled water를 이용하여 수세시켰으며, 이를 밤새 후드에 방치하여 건조한 후 고정화 support로 이용하였다. 고정화 방법은 Zhang 등(2)이 연구한 방법을 일부 변형하여 사용하였으며 전처리를 시킨 support 200 mg을 2 mL의 lipase solution과 혼합시켰다. 이 때 lipase solution은 각 효소의 단백질 함량에 따라 11.
- 고정화 전 free lipase의 반응 특성을 알아보기 위해 50 mL vial에 카놀라유, PEE와 StEE를 1:1:1의 몰 비율로 총 10 g이 되도록 설정하였으며 5종의 효소는 총 기질무게의 10%인 1 g을 첨가하여 반응을 진행하였다. 이 때 반응 조건은 46℃, 200 rpm으로 laboratory stirrer/hot plate (Corning, PC-420, Oklahoma City, OK, USA)와 항온수조(WBC 1506D, Jeio-tech, Daejeon, Korea)를 이용하였다.
- 본 연구는 미생물로부터 유래된 5종(AH, AK, AY, PS와 R)의 lipase들을 Amberlite XAD 7에 흡착법으로 고정화 시킨 후 각 immobilized lipase들의 특성을 알아보았다. 고정화 전과 후의 단백질 함량 및 각 free lipase들과 immobilized lipase들을 이용한 interesterification 반응물의 지방산과 TAG 조성을 분석하였다. 또한, immobilized lipase에 있어 중요한 요인인 reusability를 확인하였다.
- 고정화된 효소 5종 중에서 batch type interesterification 반응 시에 활성이 가장 높았던 immobilized lipase AK를 이용하여 continuous type interesterification 반응을 수행하였다. 반응기는 water-jacketed glass column (1 cm i.
- 반응기는 water-jacketed glass column (1 cm i.d. × 37.5 cm)에 12.02 g의 immobilized lipase AK와 25.33 g의 glass bead (6호)를 혼합 패킹하고 column에 silicone tubing을 연결한 후에 peristaltic tubing pump (EYELA, MP-1000-H, Tokyo, Japan)를 연결하였다.
- 반응물 50 µL를 chloroform 200 µL에 희석하여 thin layer chromatograph (TLC, 20×20 cm, Merck, Darmstadt, Germany)에 spotting 하였으며 전개 용매는 petroleum ether:diethyl ether:acetic acid=90:10:1 (v/v/v)를 사용하여 전개한 후 TAG band만을 분리하였다.
- 반응물의 TAG 조성을 알아보기 위하여 RP-HPLC (Younglin, Anyang, Korea)를 이용하였다. 분석에 사용된 HPLC는 영린 SP930D 듀얼 램프와 Sedex 75 evaporative light scattering detector(Alfortvill, France)가 장착되어 있었다.
- 이를 TLC에 spotting 하여 전개용매 hexane:diethyl ether:acetic acid=50:50:1 (v/v/v)를 사용하여 전개 시킨 뒤 2-monoacylglycerol (MAG) band만을 분리하였다. 분리한 MAG band는 BF3-methanol을 이용하여 methylation시킨 후 GC분석을 시행하여 sn-2 위치의 지방산 조성을 분석하였다(19). 이 sn-2위치의 지방산 조성과 triacylglycerol의 지방산 조성을 이용하여 sn-1.
- 냉각된 시료에 2 mL의 iso-octane과 1 mL의 포화 NaCl 용액을 첨가하여 1분간 진탕한 후 원심분리를 이용하여 층을 분리하였다. 수분과 불순물을 제거하기 위하여 sodium sulfate anhydrous column을 이용하였으며 이를 농축시켜 지방산 조성을 분석하였다(18). 분석에 이용한 기기는 GC(YL6100GC, 6000series, Younglin, Anyang, Korea)이며 flame ionized detector (FID)를 이용하였다.
- 반응이 끝난 반응물들을 회수한 후 3 mL의 hexane을 이용하여 사용된 고정화 효소를 2번 세척하여 후드에서 건조시킨 다음 다시 반응을 진행하였으며 이를 6번까지 수행하였다. 이 후 각 반응회수별 TAG의 총 포화지방산 함량을 1회 반응물의 총 포화지방산 함량에 대하여 상대적 잔존율을 구하였다.
- Lowry 등(17)의 방법을 일부 변형하여 단백질 함량 측정 시에 이용하였으며 bovine serum albumin (BSA)을 standard로 이용하여 각각의 고정화 전 free lipase와 고정화한 후 상층에 대한 단백질 함량을 측정하였다. 이를 이용하여 support에 흡착된 bounding protein(%)과 mg protein/g support를 계산하였다. 단백질 함량을 측정하기 위하여 용액 A (CuSO4·5H2O 0.
- 2 g/min)로 감소하였다. 이와 같은 반응물의 지방산조성 변화로 인한 TAG 분자들의 조성변화를 알아보기 위하여 RP-HPLC를 이용하여 결과를 제시하였다(Table 3). Continuous type reactor를 이용한 반응물의 TAG 분자 조성은 유속을 0.
- 제조된 immobilized lipase의 반복 반응 가능 여부를 확인하기 위해 9시간 반응을 6번 반복하여 나타내었다(Table 5). Immobilized lipase R과 AY는 앞의 결과에서 본 바와 같이 interesterification 반응이 크게 나타나지 않았으므로 이 실험에서 제외하였다.
- 지방산 조성은 gas chromatography (GC)를 이용하여 분석하였다. 반응물 50 µL를 chloroform 200 µL에 희석하여 thin layer chromatograph (TLC, 20×20 cm, Merck, Darmstadt, Germany)에 spotting 하였으며 전개 용매는 petroleum ether:diethyl ether:acetic acid=90:10:1 (v/v/v)를 사용하여 전개한 후 TAG band만을 분리하였다.
- 5 mL이였다. 카놀라유, PEE와 StEE를 1:1:1의 몰 비율로 혼합한 후 46℃에서 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 g/min의 유속으로 합성하였으며 이 반응물을 분석에 이용하였다.
- 한편, free lipase AK를 선택하여 이를 이용한 interesterification 반응 시간별 TAG species를 RP-HPLC를 이용하여 분석하였다(Fig. 2). 카놀라유의 TAG 조성(Table 3)은 triolein (OOO)이 57.
대상 데이터
- Interesterification 반응에 사용된 기질인 카놀라유(canola oil)는 Wesson (ConAgra Foods, Inc., Omaha, NE, USA), palmitic ethyl ester (PEE, 16:0)와 stearic ethyl ester (StEE, 18:0)는 (주) 네오메가(Daejeon, Korea)에서 제공받아서 사용하였다. 고정화(immobilization)에 사용한 lipase는 5종으로써 lipase AK (from Pseudomonas fluorescens), AY (from Candida rugosa), AH (from Burkholderia cepacia), PS (from Burkholderia cepacia), R (from Penicillium roqueforti)이며 이들은 Amano Enzyme Inc.
- , Omaha, NE, USA), palmitic ethyl ester (PEE, 16:0)와 stearic ethyl ester (StEE, 18:0)는 (주) 네오메가(Daejeon, Korea)에서 제공받아서 사용하였다. 고정화(immobilization)에 사용한 lipase는 5종으로써 lipase AK (from Pseudomonas fluorescens), AY (from Candida rugosa), AH (from Burkholderia cepacia), PS (from Burkholderia cepacia), R (from Penicillium roqueforti)이며 이들은 Amano Enzyme Inc. (Nagoya, Japan)에서 제공받았다. 고정화에 사용한 support는 Amberlite®XAD®7 HP Resin으로 Sigma-Aldrich Chemical Co.
- 고정화에 사용한 support는 Amberlite®XAD®7 HP Resin으로 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며 기기분석에 사용된 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.
- 단백질 함량을 측정하기 위하여 용액 A (CuSO4·5H2O 0.5 g+Na3C6H5O7·2H2O 1 g +distilled water 100 mL) 1 mL과 용액 B (Na2CO3 20 g+NaOH 4 g+distilled water 100 mL) 50 mL을 혼합하여 용액 C를 제조하였으며 용액 D는 Folin-Ciocalteu phenol 10 mL과 distilled water 10 mL을 혼합하여 제조하였다.
- 반응물의 TAG 조성을 알아보기 위하여 RP-HPLC (Younglin, Anyang, Korea)를 이용하였다. 분석에 사용된 HPLC는 영린 SP930D 듀얼 램프와 Sedex 75 evaporative light scattering detector(Alfortvill, France)가 장착되어 있었다. 이동상은 기울기 용리를 이용하였으며 용매 A (acetonitrile)와 용매 B (isopropanol:hexane =2:1, v/v)를 유속 1 mL/min으로 흘려주었고 column은 Nova-pak C18 column (4 µm, 150×3.
- 수분과 불순물을 제거하기 위하여 sodium sulfate anhydrous column을 이용하였으며 이를 농축시켜 지방산 조성을 분석하였다(18). 분석에 이용한 기기는 GC(YL6100GC, 6000series, Younglin, Anyang, Korea)이며 flame ionized detector (FID)를 이용하였다. 이때 detector의 온도는 260℃, injector의 온도는 250℃로 설정하였으며 column은 SPTM2560 (100 m×0.
- Immobilized lipase의 반응 특성을 알아보기 위하여 interesterification 반응을 수행하였다. 사용된 효소는 5종의 immobilized lipase(AK, AY, AH, PS와 R)를 이용하였으며 반응은 shaking heating bath (BS-21, Lab Companion, Daejeon, Korea)에서 진행하였다. 1, 3, 9, 48 시간별로 반응물을 취하여 분석에 이용하였으며 그 외의 반응 조건은 free lipase를 이용한 interesterification 반응 조건과 동일하였다.
- 그 후 상층은 단백질 함량 측정에 이용하였으며 support층은 buffer로 여러 번 수세하여 건조시킨 후 고정화 효소로 사용하였다. 이 때 수분을 제어하기 위해 데시케이터에 보관하였으며 이로써 water activity가 0.13-0.19의 범위를 나타내는 고정화된 immobilized lipase AK, AY, AH, PS와 R을 준비하였다.
- 이를 위하여 카놀라유(canola oil)와 palmitic ethyl ester(PEE), stearic ethyl ester (StEE)를 기질로 사용하였다. 이 중 카놀라유의 경우 TAG 분자의 sn-2 위치에 올레인산(oleic acid)의 함량이 많으며 TAG의 조성이 주로 triolein (OOO)로 이루어져 있으므로 lipase를 이용한 효소적 합성 시 위치적 특이성의 유무를 보다 쉽게 관찰할 수 있어 본 연구에서 기질로 선택하였다.
- 본 연구에서는 미생물로부터 유래된 free lipase와 이들로부터 adsorption법을 이용하여 제조한 immobilized lipase들의 효소적 interesterification 반응 특성과 재사용성(reusability)을 관찰하고자 하였다. 이를 위하여 카놀라유(canola oil)와 palmitic ethyl ester(PEE), stearic ethyl ester (StEE)를 기질로 사용하였다. 이 중 카놀라유의 경우 TAG 분자의 sn-2 위치에 올레인산(oleic acid)의 함량이 많으며 TAG의 조성이 주로 triolein (OOO)로 이루어져 있으므로 lipase를 이용한 효소적 합성 시 위치적 특이성의 유무를 보다 쉽게 관찰할 수 있어 본 연구에서 기질로 선택하였다.
데이터처리
- 통계처리는 SAS (statistical analysis system, version 9.2)를 실시하여 Duncan's multiple range test를 진행하였으며 각 그룹간의 유의적인 차이를 p<0.05 수준에서 검증하였다.
성능/효과
- 고정화된 각 효소별 특성을 비교한 결과, 고정화된 immobilized lipase AK, AH와 PS의 경우 반응시간이 1시간에서 48시간으로 증가함에 따라 총 지방산 함량 중 불포화지방산의 함량(ΣUSFA)은 감소하였으며 포화지방산의 함량(ΣSFA)이 증가하였다. 48시간 반응물에서의 palmitic acid와 stearic acid의 함량은 immobilized lipase AK가 20.79와 17.51 area%, immobilized lipase PS가 12.35와 7.30 area%, 그리고 immobilized lipase AH가 10.55와 5.49 area% 순으로 나타났다. 이는 기질로 사용된 카놀라유의 palmitic acid와 stearic acid의 함량이 각각 5.
- 38 area%이었으며 반응시간이 증가함에 따라 interesterification의 기질로 사용된 PEE와 StEE가 반응 중 카놀라유의 TAG분자 안에 결합되어 총 포화지방산의 조성이 증가되었다는 것을 의미한다. 48시간 반응을 비교해보면 immobilized lipase AK가 38.3 area%의 총 포화지방산 함량을 보이면서 가장 높은 활성을 보였다. 이를 free lipase AH, AK 및 PS와 비교하여 interesterification의 반응성을 살펴보면, 고정화를 함에 따라 lipase의 활성이 감소하는 것을 볼 수 있었으며 이는 Kartal 등(22)이 Candida rugosa에서 유래된 lipase의 고정화 전과 후의 활성을 비교한 연구와 같은 결과를 나타내었다.
- 이와 같은 반응물의 지방산조성 변화로 인한 TAG 분자들의 조성변화를 알아보기 위하여 RP-HPLC를 이용하여 결과를 제시하였다(Table 3). Continuous type reactor를 이용한 반응물의 TAG 분자 조성은 유속을 0.6에서 1.2 g/min로 점차 증가시킬 경우 OOO(triolein)의 함량이 각각 40.37, 49.08, 51.05 및 50.28 area%로 증가하는 경향을 보인 반면, POO (1-palmitiyl-2,3-dioleolyglycerol)의 함량은 16.89, 10.43, 8.05 및 8.31 area%로 감소하였는데 이는 펌프의 유속이 감소함에 따라 기질과의 접촉 시간이 길어지고 반응할 시간이 증가하여 반응기질인 카놀라유의 주요 TAG분자인 OOO의 조성은 적어지면서 StEE와 PEE가 interesterification반응에 참여하여 POO와 SOO 등의 조성이 증가하는 것으로 판단된다. 이와 같이 da Silva 등(24)도 연속식 반응기를 이용하여 재구성지질의 합성 연구를 할 때에는 유속이 가장 중요한 요인이라 하였으며 이를 증가시킴에 따라 기질과 효소의 반응 시간이 감소한다고 보고하였다.
- 또한, immobilized lipase에 있어 중요한 요인인 reusability를 확인하였다. Free lipase의 단백질 함량은 2.22-11.41%로 AH가 가장 높았던 반면, immobilized lipase에서는 AH, PS와 AK가 mg protein/g support이 높았다. 한편, 반응 특성을 알아보기 위해 카놀라유, PEE와 StEE를 기질로 하여 batch type interesterification을 진행하였을 때, free lipase의 경우 free lipase R을 제외한 다른 free lipase들은 반응시간이 1시간에서 72시간으로 증가함에 따라총 포화지방산 함량이 증가하였으며 그 중 free lipase AH가 반응성이 가장 높았다.
- 고정화 전 free lipase의 단백질 함량 및 고정화 후 support에 흡착된 단백질 함량(bounding protein)과 g support당 흡착된 protein (mg protein/g support)을 Table 1에 나타내었다. Free lipase의 단백질 함량은 free lipase AH가 11.41%로 가장 높았던 반면, free lipase R이 2.22%로 가장 낮게 나타났다. Yang과 Rhee(20)의 경우 resin인 Amberlite XAD 7을 이용하여 효소를 고정화 시킬 경우 56%의 protein이 흡착되었으며 Mustranta 등(25)은 resin을 고정화 support로 이용하였을 경우 silica gel이나 polyethylene보다 g당 support에 흡착된 protein의 함량(mg)이 더 많았다고 보고하였다.
- Immobilized lipase R과 AY는 앞의 결과에서 본 바와 같이 interesterification 반응이 크게 나타나지 않았으므로 이 실험에서 제외하였다. Immobilized lipase AK, AH와 PS 모두에서 두 번째 반복 반응 시에 첫 번째 반응 시보다 interesterification 정도가 120.9-196.5% 증가하였는데, 특히 immobilized lipase AH와 PS의 경우 두 번째 반응 이후부터 6회 반응 시까지 효소활성의 변화가 크게 나타나지 않았다. 반면, immobilized lipase AK의 경우는 두 번째 반응 이후 점차 interesterification 반응이 감소하였으며 6회 반응 시에는 첫 번째 반응 대비 약 38%까지 감소하였다.
- 또한, 이를 사용하여 continuous type으로 반응하였을 때 유속이 느릴수록 효소와 기질 사이의 접촉 시간이 길어져 반응물의 총 포화지방산 함량이 증가함을 알 수 있었다. Reusability는 immobilized AK, AH와 PS 모두에서 두 번째 반복 반응을 하였을 때, 첫 번째 반응보다 총 포화지방산이 120-196.5% 증가하였다. 그러나 bounding protein 함량이 가장 높았던 immobilized AK는 support에 흡착되었던 free lipase AK의 탈착이 일어나 2번째 반응 후부터 활성이 감소한 반면, immobilized AH와 PS는 활성이 비교적 유지되었다.
- 고정화된 각 효소별 특성을 비교한 결과, 고정화된 immobilized lipase AK, AH와 PS의 경우 반응시간이 1시간에서 48시간으로 증가함에 따라 총 지방산 함량 중 불포화지방산의 함량(ΣUSFA)은 감소하였으며 포화지방산의 함량(ΣSFA)이 증가하였다.
- 반응 기질로 포화지방산의 ethyl ester인 PEE 와 StEE를 사용하여 interesterificaton 반응을 진행하였으며 lipase의 활성이 높을수록 반응물의 포화지방산(palmitic acid, stearic acid)의 조성 비율이 높아지는 것으로 보인다. 따라서 단백질 함량이 가장 높았던 free lipase AH (Table 1)가 PEE와 StEE의 포화 acyl기를 카놀라유의 TAG 분자들에 결합시키는 interesterification 반응을 가장 높게 수행하였음을 보여주었다. 반면, 단백질 함량이 가장 낮았던 free lipase R(2.
- 한편, 반응 특성을 알아보기 위해 카놀라유, PEE와 StEE를 기질로 하여 batch type interesterification을 진행하였을 때, free lipase의 경우 free lipase R을 제외한 다른 free lipase들은 반응시간이 1시간에서 72시간으로 증가함에 따라총 포화지방산 함량이 증가하였으며 그 중 free lipase AH가 반응성이 가장 높았다. 또한, RP-HPLC를 통해 free lipase AK 반응물을 분석한 결과, 반응시간이 길어질수록 카놀라유(0시간)에서 볼 수 있었던 57.49 area%의 OOO가 6.53 area%로 감소하였다. 이는 각 free lipase들이 PEE와 StEE를 효소적 반응에 이용했기 때문이라고 판단된다.
- 고정화 전과 후의 단백질 함량 및 각 free lipase들과 immobilized lipase들을 이용한 interesterification 반응물의 지방산과 TAG 조성을 분석하였다. 또한, immobilized lipase에 있어 중요한 요인인 reusability를 확인하였다. Free lipase의 단백질 함량은 2.
- 이는 반응기질의 유속이 느릴수록 효소와 기질의 접촉하는 시간이 길어지므로 반응을 할 수 있는 시간이 증가함에 따라 interesterification 반응이 증가하고 따라서 반응물의 총 포화지방산의 조성이 증가하는 것으로 판단된다. 또한, 반응물을 구성하고 있는 TAG 분자들의 sn-2위치 지방산 조성은 반응 유속이 증가할수록 총 포화 지방산의 함량이 12.55 area% (0.6 g/min)에서 4.73 area% (1.2 g/min)로 감소하였다. 이와 같은 반응물의 지방산조성 변화로 인한 TAG 분자들의 조성변화를 알아보기 위하여 RP-HPLC를 이용하여 결과를 제시하였다(Table 3).
- 3 area%의 포화지방산 함량으로 가장 높은 활성을 보였다. 또한, 이를 사용하여 continuous type으로 반응하였을 때 유속이 느릴수록 효소와 기질 사이의 접촉 시간이 길어져 반응물의 총 포화지방산 함량이 증가함을 알 수 있었다. Reusability는 immobilized AK, AH와 PS 모두에서 두 번째 반복 반응을 하였을 때, 첫 번째 반응보다 총 포화지방산이 120-196.
- 91%)의 경우 두 번째 반응 후부터 활성이 감소하였는데 이는 support에 흡착되었던 free lipase AK가 탈착되어 나타난 것으로 생각된다. 반면, bounding protein이 48.36%이었던 immobilized lipase PS와 36.31%이었던 immobilized lipase AH는 6번째까지 활성이 비교적 유지되는 것으로 나타났다.
- 60 area%로 감소하였다. 반면, 포화 지방산인 palmitic acid와 stearic acid를 함유한 TAG species들의 함량이 증가하는 경향을 보여 POO의 함량이 26.06 area%로 증가하였으며, 1-stearoyl-2,3-dioleolyglycerol (SOO)도 12.94 area%로 증가하였다.
- 반응 기질로 사용된 카놀라유의 주요 지방산은 oleic acid (C18:1)로써 58.81 area%의 가장 높은 조성을 나타났으며 포화지방산인 palmitic acid (C16:0)와 stearic acid (C18:0)는 각각 5.97와 2.41 area%이었다(Table 2). 한편, 5종의 free lipase와 기질(카놀라유, PEE, StEE)을 이용한 batch type interesterification 반응물의 지방산 조성 변화를 Fig.
- 1(B)은 총 포화지방산의 합(palmitic acid, stearic acid)으로 반응 시간이 지남에 따라 증가하는 경향을 보였다. 반응 기질로 포화지방산의 ethyl ester인 PEE 와 StEE를 사용하여 interesterificaton 반응을 진행하였으며 lipase의 활성이 높을수록 반응물의 포화지방산(palmitic acid, stearic acid)의 조성 비율이 높아지는 것으로 보인다. 따라서 단백질 함량이 가장 높았던 free lipase AH (Table 1)가 PEE와 StEE의 포화 acyl기를 카놀라유의 TAG 분자들에 결합시키는 interesterification 반응을 가장 높게 수행하였음을 보여주었다.
- Immobilized lipase 중 위치적 특이성은 크지 않았지만 활성이 높았던 immobilized lipase AK를 scale-up 제조하여 continuous type reactor로 interesterification 반응을 수행할 때 유속의 변화가 반응물의 지방산 조성 변화에 미치는 영향을 살펴보았다(Table 2). 유속을 0.6, 0.8, 1.0 및 1.2 g/min으로 증가시키며 얻은 interesterification 반응물의 총 포화지방산 함량은 각각 20.42, 13.87, 12.60와 12.95 area%로 감소하였다. 이는 반응기질의 유속이 느릴수록 효소와 기질의 접촉하는 시간이 길어지므로 반응을 할 수 있는 시간이 증가함에 따라 interesterification 반응이 증가하고 따라서 반응물의 총 포화지방산의 조성이 증가하는 것으로 판단된다.
- 49 area% 순으로 나타났다. 이는 기질로 사용된 카놀라유의 palmitic acid와 stearic acid의 함량이 각각 5.97과 2.41 area%으로 총 포화지방산의 조성은 8.38 area%이었으며 반응시간이 증가함에 따라 interesterification의 기질로 사용된 PEE와 StEE가 반응 중 카놀라유의 TAG분자 안에 결합되어 총 포화지방산의 조성이 증가되었다는 것을 의미한다. 48시간 반응을 비교해보면 immobilized lipase AK가 38.
- 77 area%이었고, 1-palmitiyl-2,3- dioleolyglycerol (POO) 및 LPO/LOP 등이 존재하였다. 이러한 조성은 반응 시간이 길어질수록 카놀라유의 주요 TAG species인 OOO와 LOO의 함량이 감소하였는데, 특히 OOO의 경우 72시간 반응물에서 6.53 area%를 보이면서 크게 감소하였으며 LOO도 4.60 area%로 감소하였다. 반면, 포화 지방산인 palmitic acid와 stearic acid를 함유한 TAG species들의 함량이 증가하는 경향을 보여 POO의 함량이 26.
- 2). 카놀라유의 TAG 조성(Table 3)은 triolein (OOO)이 57.49 area%로 가장 높은 비율로 나타났으며, 그 다음으로 1-linolenoly-2,3-dioleolyglycerol (LOO)이 33.77 area%이었고, 1-palmitiyl-2,3- dioleolyglycerol (POO) 및 LPO/LOP 등이 존재하였다. 이러한 조성은 반응 시간이 길어질수록 카놀라유의 주요 TAG species인 OOO와 LOO의 함량이 감소하였는데, 특히 OOO의 경우 72시간 반응물에서 6.
- 80%로써 단백질 함량은 낮았지만 반응시간이 길어짐에 따라 총 포화지방산이 증가하는 것으로 나타나 lipase R은 본 실험 조건에서의 interesterification 반응성이 상대적으로 매우 낮은 것으로 판단된다. 한편, 5종의 free lipase 중에서 단백질 함량이 높았던 free lipase AH, PS와 AK는 72시간 반응물에서 35-40 area%의 총 포화지방산의 함량을 보여 반응 기질로 사용된 카놀라유의 총 포화지방산의 함량인 8.38 area%보다 크게 증가되는 것으로 나타나 free lipase AH, PS 및 AK가 PEE와 StEE를 interesterification 반응에 사용한 것으로 판단된다. 이와 같이 lipase를 사용하여 TAG의 지방산 조성을 변형시킨 재구성 지질을 제조하여 본래 유지가 갖고 있는 물리, 화학적 특성을 변화시키는 연구가 1970년대부터 진행되고 있음을 Rousseau와 Marangoni(21)가 설명하고 있다.
- 이는 각 free lipase들이 PEE와 StEE를 효소적 반응에 이용했기 때문이라고 판단된다. 한편, immobilized lipase AY와 R의 경우 반응시간이 1시간에서 48시간으로 증가하여도 카놀라유(0시간)의 총 포화지방산 함량과 큰 차이가 없었으나 immobilized AK의 경우 48시간에서 38.3 area%의 포화지방산 함량으로 가장 높은 활성을 보였다. 또한, 이를 사용하여 continuous type으로 반응하였을 때 유속이 느릴수록 효소와 기질 사이의 접촉 시간이 길어져 반응물의 총 포화지방산 함량이 증가함을 알 수 있었다.
- 41%로 AH가 가장 높았던 반면, immobilized lipase에서는 AH, PS와 AK가 mg protein/g support이 높았다. 한편, 반응 특성을 알아보기 위해 카놀라유, PEE와 StEE를 기질로 하여 batch type interesterification을 진행하였을 때, free lipase의 경우 free lipase R을 제외한 다른 free lipase들은 반응시간이 1시간에서 72시간으로 증가함에 따라총 포화지방산 함량이 증가하였으며 그 중 free lipase AH가 반응성이 가장 높았다. 또한, RP-HPLC를 통해 free lipase AK 반응물을 분석한 결과, 반응시간이 길어질수록 카놀라유(0시간)에서 볼 수 있었던 57.
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