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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 세계적으로 많은 양이 생산되고 국내 소비자를 통해 대량 소비되고 있는 뉴질랜드산 ‘Zespri green kiwi fruit’에 대해 재배 및 수입 과정 등에서 발생될 수 있는 다양한 환경 변화 요인에 따른 주요 영양·화학적 특성을 재점검하고 더불어 in vitro 신경세포 보호효과를 밝혀 산업화 소재로서의 활용 가능성을 알아보고자 하였다.
- 신경세포막을 구성하고 있는 지질성분은 산화적 스트레스에 취약한 특성을 가지고 있으며, 세포막 손상 및 기타 단백질 손상과도 관계가 있다고 알려져 있다(24). 따라서 본 연구에서는 n-hexane 분획물의 지질 과산화 억제활성을 살펴보았다. n-hexane 분획물의 농도가 증가함에 따라 malondialdehyde (MDA)저해활성이 증가하는 것으로 나타났고(Fig.
제안 방법
- 시료 2g에 20 mL의 10% metaphosphoric acid를 가하여 10분간 현탁시킨 후 적당량의 5% metaphosphoric acid을 넣어 균질화한 다음 100 mL mass flask에 옮기고 소량의 5% metaphosphoric acid액으로 용기를 씻은 후 mass flask에 합하여 100 mL로 정용한 다음 0.22 µm syringe filter로 여과하여 HPLC (U3000, Dionex)로 분석하였다.
- 시료를 일정량 취하여 6 N HCl 용액을 가하고 진공 밀봉하여 heating block (110±1℃)에서 24시간 동안 가수분해 시킨 후 glass filter로 여과한 여액을 회전진공농축기(EYLYA, N-N series, Tokyo, Japan)를 이용하여 HCl을 제거하고 증류수로 3회 세척한 다음 감압 농축하여 sodium citrate buffer (pH 2.2) 2 mL로 용해한 후 0.22 µm membrane filter로 여과한 여액을 아미노산 동분석기 (Biochrom 30, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 이용하여 분석하였다.
- 80% 에탄올을 용매로 하여 환류냉각 방법으로 추출하여 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, distilled water를 활용하여 용매 계통 추출을 실시하여 실험을 진행하였다. 동결건조 시료 5g에 80% 에탄올 100 mL을 첨가하여 환류 냉각 하에 2시간 동안 추출하였으며, 이 추출액을 여과하여 감압 농축하였다.
- 동결건조 시료 5g에 80% 에탄올 100 mL을 첨가하여 환류 냉각 하에 2시간 동안 추출하였으며, 이 추출액을 여과하여 감압 농축하였다. 그 후 이 추출물을 극성 차를 이용해 서로 성질이 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다. 키위 과육 에탄올 추출물에 헥산과 물을 1:1 비율로 분획깔때기에 넣고 헥산 층과 물 층을 분획하였고, 물 층을 다시 클로로포름과 1:1 비율로 분획깔때기에 넣고 클로로포름과 물 층을 분획하였다.
- 그 후 이 추출물을 극성 차를 이용해 서로 성질이 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다. 키위 과육 에탄올 추출물에 헥산과 물을 1:1 비율로 분획깔때기에 넣고 헥산 층과 물 층을 분획하였고, 물 층을 다시 클로로포름과 1:1 비율로 분획깔때기에 넣고 클로로포름과 물 층을 분획하였다. 이 과정과 동일하게 에틸아세테이트를 추가하여 물 층과 분획을 실시한 후 농축하여 동결건조 시킨 후−20℃ 냉동고에 보관하면서 각 실험에 사용하였다.
- 무기성분 분석은 각 시료 0.1 g에 분해용액 (HClO4:H2SO4: H2O2=9:2:5) 25 mL를 가하여 열판(hot plate)에서 무색으로 변할 때까지 분해한 후 100 mL로 정용하여 여과(Whatman No. 2)한 후 inductively coupled plasma (Aton scan 25, Thermo Jarnell Ash Co., France)로 분석하였다. 분석조건 중 RF power는 1,300 W이며, analysis pump flow rate는 1.
- , France)로 분석하였다. 분석조건 중 RF power는 1,300 W이며, analysis pump flow rate는 1.5 mL/min으로 하였고, gas flows는 plasma: 15, auxiliary: 0.2, nebulizer: 0.8 L/min으로 하여 분석하였다(13).
- 식힌 시료를 250 mL 용량의 갈색 분액 여두로 옮겨 포화 식염용액 20 mL과 석유에테르 40 mL를 첨가하여 격렬하게 섞는다. 석유에테를 층만을 회수하여 40℃ 이하에서 농축한 후 여과하여 HPLC (U3000, Dionex)로 분석하였다. Column은 Dionex C18 (4.
- 모든 실험동물은 2마리씩 한 개의 사육케이스에 넣어 항온(22±2℃), 항습(50-55%)을 일정하게 유지하였고, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 동일한 환경에서 충분한 양의 식수와 사료를 공급하며 사육하였다(동물실험인가번호 GNU-120831-M0037).
- 키위 헥산 분획물을 PC12 세포에 처리하여 48시간 동안 pre-incubation한 후, 200 µM H2O2를 3시간 동안 처리하였다.
- 50 µM DCFH-DA를 넣어 50분간 배양하여 fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)를 사용하여 excitation 파장 485 nm와 emission 파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다(17).
- 이 혼합용액을 23℃에서 2시간 동안 정치한 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 gallic acid를 이용하여 작성된 검량선으로 총 페놀화합물 함량을 계산하였다(15).
- 뇌 조직을 이용한 지질 과산화 억제활성 측정은 Chang 등(16)의 방법을 변형하여 사용하였다. 4주령의 ICR-male mouse를 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입하여 7일간의 환경 적응 기간을 유지했다.
- ROS와 같은 oxidative stress에 대한 n-hexane 분획물의 지질 과산화 억제활성을 분석하여 항산화효과를 확인하였다. 신경세포막을 구성하고 있는 지질성분은 산화적 스트레스에 취약한 특성을 가지고 있으며, 세포막 손상 및 기타 단백질 손상과도 관계가 있다고 알려져 있다(24).
- Oxidative stress로 인해 세포내 생성된 ROS는 비형광성을 나타내는 DCF-DA를 산화시켜 형광물질인 DCF로 전환시키는데 이렇게 전환된 형광물질의 양을 측정하여 세포내 형성된 ROS를 측정하는 방법이다. 먼저 앞선 in vitro 항산화 활성 측정을 통해 상대적으로 우수한 활성을 보여준 n-hexane 분획물을 전처리한 다음, H2O2로 세포의 산화적 손상을 유도하여 DCF 형광강도를 관찰한 결과 Fig. 2A와 같다. H2O2를 단독 처리한 군에서는 143%로 대조구 100% 대비하여 약 43%의 형광강도 증가를 보인 반면, n-hexane 분획물을 처리한 구에서는 농도 의존적으로 산화적 손상 보호효과를 보였다.
- 조지방 추출은 분쇄된 시료 2g을 원통여지(Toyo Roshi Kaisha, Ltd, Tokyo, Japan)에 넣고 ethyl ether를 가하여 Soxhlet 추출법으로 약 16시간 추출하여 조지방을 얻고 이에 0.5 N NaOH-MeOH을 각각 첨가한 후 80℃에서 10분간 methyl ester화 시킨 다음 nheptane 4 mL를 첨가하여 4-5분간 방치하고, NaCl 포화용액 2 mL와 ether 20 mL을 첨가한 후 ether층을 감압 · 농축하여 GC (GC 5890, Hewlett-packard Co., Avondale, PA, USA)로 분석하였다.
- 분석조건은 column은 Supelco wax 10 (60 m×0.32 mm I.D.)를 사용하고, injector temp와 column oven temp은 각각 250℃와 260℃로 하며, detector temp와 carrier gas는 280℃와 N2로 하고, split ratio은 30:1로 맞추어 수행하였다(13).
대상 데이터
- Column은 Dionex C18 (4.6×250 mm, 5 µm)을 사용하였고, 이동상은 0.22 mM BHT를 함유시킨 ethyl acetate:acetonitrile:acetic acid (30:68:2, v/v/v)를 사용하였다.
- Column은 Dionex C18 (4.6×250 mm, 5 µm)를 사용하고, solvent와 flow rate는 각각 0.05 M KH2PO4:acetonitrile(60:40)과 1.0 mL/min으로 하였으며, UV파장과 injection volume은 254 nm와 20 µL로 하였다(11).
- Folin-Ciocalteu's phenol reagent, gallic acid, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic-acid)(ABTS), potassium ferricyanide, trichloroacetic acid, 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), H2O2, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-zolium bromide (MTT) assay kit은 SigmaAldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 뉴질랜드산 Zespri green kiwi (Actinide deliciosa)는 경남 진주시 농산물 도매시장에서 2012년 7월에 구매하여 냉장보관(4℃)하여 사용하였다. Folin-Ciocalteu's phenol reagent, gallic acid, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic-acid)(ABTS), potassium ferricyanide, trichloroacetic acid, 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), H2O2, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-zolium bromide (MTT) assay kit은 SigmaAldrich Chemical Co.
- Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다. 신경세포배양을 위해 필요한 RPMI1640 medium과 fetal bovine serum은 Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, penicillin, streptomycin, sodium bicarbonate와 HEPES 및 나머지 시약은 Sigma-Aldrich 제품을 구입하여 사용하였다.
- 뇌 조직을 이용한 지질 과산화 억제활성 측정은 Chang 등(16)의 방법을 변형하여 사용하였다. 4주령의 ICR-male mouse를 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입하여 7일간의 환경 적응 기간을 유지했다. 모든 실험동물은 2마리씩 한 개의 사육케이스에 넣어 항온(22±2℃), 항습(50-55%)을 일정하게 유지하였고, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 동일한 환경에서 충분한 양의 식수와 사료를 공급하며 사육하였다(동물실험인가번호 GNU-120831-M0037).
- 모든 실험동물은 2마리씩 한 개의 사육케이스에 넣어 항온(22±2℃), 항습(50-55%)을 일정하게 유지하였고, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 동일한 환경에서 충분한 양의 식수와 사료를 공급하며 사육하였다(동물실험인가번호 GNU-120831-M0037). 상기 환경에서 4주간 사육한 ICR mouse brain을 적출하여 실험에 사용하였다. 뇌 부위 조직에 10 volume의 ice cold Tris-HCl buffer (20 mM, pH 7.
- 본 실험에서 사용한 PC12 세포(KCLB 21721, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 신경세포의 특성을 나타내는 세포로 쥐의 pheochromocytoma로부터 유도된 것을 사용하였다. PC12세포를 25 mM HEPES, 25 mM sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum, 50 units/mL penicillin 및 100 µg/mL steptomycin이 포함된 RPMI 1640 배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복 실시하여 평균±표준편차로 나타내었으며, 각 평균값에 대한 검증은 SAS version 9.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 Duncan’s multiple range test로 검증하였다.
이론/모형
- 유리당 분석은 각 시료를 마쇄한 후 Choi 등(14)의 방법으로 유리당 획분을 0.45 µm membrane filter로 여과한 후 Sep-pak C18로 색소 및 단백성분을 제거한 다음 HPLC (U3000, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)로 분석하였다.
- H2O2에 의해 유도된 PC12 세포내 산화적 스트레스 생성량을 측정하기 위하여 DCF-DA assay를 이용하여 측정하였다. 먼저 세포를 96 well plate에 2×106 cells/well로 분주하고, 키위 헥산 분획물을 농도별로 처리한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 48시간 동안 배양하였다.
- H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스 상태에서 PC12 세포에 대한 보호효과를 MTT reduction assay로 측정하였다. 키위 헥산 분획물을 PC12 세포에 처리하여 48시간 동안 pre-incubation한 후, 200 µM H2O2를 3시간 동안 처리하였다.
성능/효과
- Zespri green kiwi fruit에 함유되어 있는 무기성분을 분석한 결과(Table 1) 총 8종이 분리되었으며, 그중 K이 129.36 mg/100 g으로 가장 많이 함유되어 있었고, 다음으로 P 70.30 mg/100 g, Ca 35.82 mg/100 g, Mg 26.19 mg/100 g순으로 높은 함유를 나타났으며, Fe과 Na 함유량은 각각 Fe 1.23 mg/100 g, Na 0.57 mg/100 g 으로 비교적 낮은 함유량을 나타내었다. 한국산 골드키위(Actinidia chinensis PI.
- 총 아미노산을 분석한 결과는(Table 2)와 같이 총 17종이 분리, 동정되었으며, 총 아미노산의 함유량은 869.84 mg/100 g이였고, 필수 아미노산 함유량은 298.84 mg/100 g로 나타났다. 분리·동정된 17종의 총 아미노산 중 주요 아미노산으로는 glutamic acid 165.
- 분리·동정된 17종의 총 아미노산 중 주요 아미노산으로는 glutamic acid 165.83 mg/100 g, aspartic acid 105.30 mg/100 g, arginine 60.09 mg/100 g, leucine 59.96 mg/100 g순으로 나타났다.
- 11%으로 함유되어 있었다. 또한 포화지방산과 불포화지방산의 비율은 10.73%와 89.25%로 불포화지방산이 높은 비율을 보였다. Piombo 등(20)은 키위 씨의 불포화 지방산의 함량이 78.
- 62 mg/100 g로 나타났다(Table 4). 한국산 골드키위(A. chinensis PI.)의 경우 fructose, glucose, sucrose 3종류의 유리당은 각각 1.86%, 2.17%, 1.04% 함유되어 있어(11) fructose의 함량은 green kiwi에서 조금 높은 것으로 나타났다. Matsumoto 등(21)은 숙성기간 동안 Hayward (A.
- Phenolic compounds는 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조를 갖는데, 특히 이중 phenolic hydroxyl기가 단백질 및 기타 거대분자들과 결합하는 성질이 강하여 항산화 등과 같은 생리활성 기능을 나타낸다(22). 추출방법정립을 위하여 80% 에탄올을 이용하여 환류냉각 추출을 실시하여 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, distilled water로 분획물을 얻어 total phenolics를 분석한 결과 80% 에탄올 3.16 mg GAE/g, n-hexane 11.8 mg GAE/g, chloroform 2.5 mg GAE/g, ethyl acetate 7.0 mg GAE/g, distilled water 1.3 mg GAE/g으로 n-hexane 분획물에서 가장 높은 함량을 보였다. 이에 반해 국내산 골드키위(A.
- n-hexane 분획물의 농도가 증가함에 따라 malondialdehyde (MDA)저해활성이 증가하는 것으로 나타났고(Fig. 1B), positive control로 사용된 catechin 100 µg/ mL보다는 저해 활성이 상대적으로 낮지만 n-hexane 분획물 1000µg/mL의 농도에서는 약 60%의 MDA 저해활성을 보였다.
- 특히 농도 1000 µg/mL에서는 95%로 H2O2대비 약 48%정도의 ROS 감소율을 보여주어 뛰어난 신경세포 보호효과를 지니는 것으로 확인되었다.
- Hurst 등(26)에 의하면 phenolic conpounds는 oxidative stress에 의한 세포 손상을 보호할 수 있다고 보고하였으며, 이에 따라 본 연구에서도 키위에 존재하는 phenolic compounds에 의해 oxidative stress가 감소하였을 것으로 판단된다. 이상의 결과를 종합해볼 때 키위의 n-hexane 분획물은 oxidative stress로 일어나는 신경세포의 사멸을 억제시킴을 알 수 있었다.
- n-hexane 분획물을 처리한 처리구에서는 62 µg/mL 이상의 농도에서 200 µM vitamin C와 유사한 보호효과를 보였으며, 특히 125 µg/mL 농도에서는 vitamin C보다 높은 신경세포 보호 효과를 보였다.
- 2B와 같다. H2O2를 처리한 처리구에서는 control group 100% 대비 86%의 생존율을 나타냈고 H2O2와 vitamin C를 동시에 처리한 처리구에서는 117%로 약 31% 정도의 신경세포 보호효과를 보였다. n-hexane 분획물을 처리한 처리구에서는 62 µg/mL 이상의 농도에서 200 µM vitamin C와 유사한 보호효과를 보였으며, 특히 125 µg/mL 농도에서는 vitamin C보다 높은 신경세포 보호 효과를 보였다.
- Zespri green kiwi의 무기질은 K, P, Ca 순으로 많았으며, 아미노산은 glutamic acid, aspartic acid, arginine 순으로 많이 함유되어 있었다. 지방산 함량은 a-linolenic acid, oleic acid 순으로 많이 함유되어 있었으며, 유리당은 fructose 함량이 가장 높았다.
- Zespri green kiwi의 무기질은 K, P, Ca 순으로 많았으며, 아미노산은 glutamic acid, aspartic acid, arginine 순으로 많이 함유되어 있었다. 지방산 함량은 a-linolenic acid, oleic acid 순으로 많이 함유되어 있었으며, 유리당은 fructose 함량이 가장 높았다. Vitamin C와 β-carotene 함량은 각각 29.
- 35 µg/100 g이었다. Total phenolics는 n-hexane 분획물이 11.83 mg GAE/g으로 가장 높았으며, ABTS radical 소거활성 및 지질 과산화 억제활성에서는 농도 의존적으로 in vitro 항산화 활성이 증가하는 경향을 보였다. 또한 oxidative stress에 대한 신경세포 보호효과 역시 농도 의존적 경향을 보여주었다.
후속연구
- 또한 oxidative stress에 대한 신경세포 보호효과 역시 농도 의존적 경향을 보여주었다. 본 연구 결과를 종합해볼 때, 생리 활성 소재로서의 phenolics를 함유한 kiwi fruit (A.deliciosa)는 in vitro 항산화 활성과 함께 신경세포 보호효과를 기초로 한 고부가가치 건강지향식품 소재로서의 활용가치가 높다고 판단된다.
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