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문제 정의
- 17-21) 또한 rs5569, rs17841329, rs192303 등은 메칠페니데이트 치료반응과의 연관성이 보고되었다.22,23) 따라서 메칠페니데이트 부작용 역시 SLC6A2와 연관성이 있을 가능성을 추측할 수 있으며, 본 연구에서는 SLC6A2의 SNP 중 유전체 전장 연관성 분석(Genome wide association study)에서ADHD와 연관성이 있다고 제안된 rs378514318)과 메칠페니데이트 반응과의 연관성이 제시된 rs192303,22) 이렇게 2개의 SNP와 OROS MPH의 부작용과의 연관성을 밝히고자 한다.
- 본 연구는 ADHD 아동에서 SLC6A2와 OROS MPH의 부작용의 연관성을 밝힌 연구이다. 연구 결과, rs3785143, rs192303은 모두 OROS MPH의 부작용 중 ‘짜증’과 연관성이 있었다.
- 본 연구는 SLC6A2의 SNP 중, rs192303, rs3785143과OROS MPH의 부작용과의 연관성을 밝혔다. ADHD의 병인론과 메칠페니데이트의 작용기전에 있어 노르에피네프린은 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
- 특히 Barkley’sSide Effect Rating Scale에서 정서와 연관된 척도들은 메칠페니데이트 치료 후에 호전되었다는 연구 결과들이 있어 이를 뒷받침한다.
제안 방법
- ADHD 및 공존질환은 한국어판 Kiddie-Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia-Present and LifetimeVersion(K-SADS-PL)25)을 이용해 숙련된 2명의 소아청소년정신과 전문의가 진단하였다. K-SADS-PL은 반 구조화된 면담 도구로서 ADHD에 대한 진단의 타당도는 높은 것으로 보고되었다.
- OROS MPH 18mg으로 약물 투여를 시작하였으며 1주, 2주, 4주, 8주째에 방문하도록 하여 증상의 호전 정도 및 부작용을 관찰하며 증량하였다. 치료 8주째에 보호자가 Barkley’sSide Effect Rating Scale을 작성하도록 하였다.
- 25unit을 넣고 최종부피가 10uL가 되도록 증류수를 넣어 혼합한 후 Dual 384-Well GeneAmp PCR System 9700을 이용하여 95℃, 10분,1cycle ; 95℃, 30초, 55℃, 1분, 72℃, 1분, 35cycles ; 72℃, 10분, 1cycle 동안 반응시킨 후 PCR을 수행하였다. Primer extension reaction을 위해 정제된 PCR 산물 1uL를 0.15pmoL genotyping primer가 포함된 SNaPshot Ready Reaction mixture에 넣어 96℃, 10초, 50℃, 5초, 60℃, 30초의 3단계를 25cycles 수행하였다. 과량의 fluorescent dye terminators를 제거하기 위하여 반응산물에 Shrimp Alkaline Phosphatase 1 unit을 넣어 37℃ 75분, 72℃ 15분간 반응시켰다.
- 2%)의 분포를 보였다. rs192303 GG 유전자형의 빈도수(N=3)와 rs3785143TT 유전자형의 빈도수(N=6)가 낮아 분석에 제한이 있으므로, 통계적인 유의성을 고려하여 rs192303은 CC(N=76)와 CG+GG(N=21) 두 군으로 분류하였고, rs3785143은 CC(N=64)와 CT+TT(N=33) 두 군으로 분류하여 분석하였다. 각 유전자형에 따른 인구학적 변인 및 8주째 kg당 약물 용량,ADHD 평정척도 등은 통계적으로 유의미한 차이가 없었다(Table 1).
- rs192303의 경우 CC 유전자형과 CG+GG 유전자형 두 군으로 나누어 분석을 시행하였으며 rs3785143의 경우 CC 유전자형과 CT+TT 유전자형으로 나누어 분석을 시행하였다. 대상군의 유전자형에 따라 인구학적 변인 및 kg당 OROS MPH 용량, 한국판 ADHD 평정 척도를 chi-square test, Fisher’sexact test 혹은 독립표본 t 검정으로 비교하였다.
- 말초혈액에서 정제 kit(FUJIFILM QuickGene DNA whole blood kit S)를 사용하여 genomic DNA를 분리하였다. SLC6A2 SNP 분석은 SNaPshot assay로 이루어졌다.
- 과량의 fluorescent dye terminators를 제거하기 위하여 반응산물에 Shrimp Alkaline Phosphatase 1 unit을 넣어 37℃ 75분, 72℃ 15분간 반응시켰다. 반응산물 1uL에 Hi-Di formamide 9uL를 넣어 95℃에 5분간 두었다가 얼음에 5분간 둔 후 ABI PrismⓇ 3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 결과의 분석은 GeneMapper4.
- 유전자형별로 부작용의 빈도를 비교하기 위해 Barkley’s Side Effect Rating Scale의 17개 항목별 점수를 ‘0’인 경우는 부작용이 ‘없음’으로, ‘1’ 이상인 경우를 부작용이 ‘있음’으로 간주하였다.
- rs192303은 GTGTGTCCATTTTGCAT(Forward)와 GGGAGAGTTTCCTCTCCT(Reverse)를, rs3785143은 CTGG AAAAGAT CAGCCTGT(Forward)와, CAAGAAGGTGCTGTGGTTA(Reverse)를 이용하여 SNP를 포함하는 부분을 증폭하였다. 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction,PCR)을 위한 반응액은 template DNA 10ng, forward/reverse primer 각각 0.5pM, 10X PCR buffer 1uL,dNTP 250uM, DNA Taq polymerase 0.25unit을 넣고 최종부피가 10uL가 되도록 증류수를 넣어 혼합한 후 Dual 384-Well GeneAmp PCR System 9700을 이용하여 95℃, 10분,1cycle ; 95℃, 30초, 55℃, 1분, 72℃, 1분, 35cycles ; 72℃, 10분, 1cycle 동안 반응시킨 후 PCR을 수행하였다. Primer extension reaction을 위해 정제된 PCR 산물 1uL를 0.
대상 데이터
- 115명의 아동이 연구에 참여하였으며 모두 18명의 아동이 탈락하였다. 연구 참여자와 탈락자의 성별, 나이 등은 통계학적으로 유의미한 차이가 없었다.
데이터처리
- 유전자형별로 부작용의 빈도를 비교하기 위해 Barkley’s Side Effect Rating Scale의 17개 항목별 점수를 ‘0’인 경우는 부작용이 ‘없음’으로, ‘1’ 이상인 경우를 부작용이 ‘있음’으로 간주하였다. rs192303, rs3785143의 각 유전자별로 부작용 빈도에 대해 chi-square test를 시행하였다. 각 부작용의 정도를 비교하기 위하여 rs192303, rs3785143 각각의 유전자 유형을 독립변수로 하고 Barkley’s side effect rating scale 각 항목별 점수를 종속변수로 하여 독립표본 t 검정을 하였다.
- 각 부작용의 정도를 비교하기 위하여 rs192303, rs3785143 각각의 유전자 유형을 독립변수로 하고 Barkley’s side effect rating scale 각 항목별 점수를 종속변수로 하여 독립표본 t 검정을 하였다.
- 반응산물 1uL에 Hi-Di formamide 9uL를 넣어 95℃에 5분간 두었다가 얼음에 5분간 둔 후 ABI PrismⓇ 3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 결과의 분석은 GeneMapper4.0 analysis software(Applied Biosystems, Foster City, CA,USA)를 이용하였다.
- 대상군의 유전자형에 따라 인구학적 변인 및 kg당 OROS MPH 용량, 한국판 ADHD 평정 척도를 chi-square test, Fisher’sexact test 혹은 독립표본 t 검정으로 비교하였다.
이론/모형
- 말초혈액에서 정제 kit(FUJIFILM QuickGene DNA whole blood kit S)를 사용하여 genomic DNA를 분리하였다. SLC6A2 SNP 분석은 SNaPshot assay로 이루어졌다. rs192303은 GTGTGTCCATTTTGCAT(Forward)와 GGGAGAGTTTCCTCTCCT(Reverse)를, rs3785143은 CTGG AAAAGAT CAGCCTGT(Forward)와, CAAGAAGGTGCTGTGGTTA(Reverse)를 이용하여 SNP를 포함하는 부분을 증폭하였다.
- 치료 8주째에 보호자가 Barkley’sSide Effect Rating Scale을 작성하도록 하였다.
성능/효과
- 메칠페니데이트(methylphenidate)는 ADHD 치료의 첫번째 선택 약물로서 널리 사용되고 있으며 65-75%의 치료반응률을 보이는 것으로 알려져 있다.2) 이러한 메칠페니데이트의 우수한 치료 효과에도 불구하고 ADHD 치료 약물의 중단, 혹은 비순응은 13.2-64%로 비교적 높은 수치이며3) ADHD 치료 약물 중단의 여러 원인 중의 하나는 약물 부작용으로 보고 되었다.4) ADHD 아동의 약물치료에 관한 인식을 조사한 연구에서는, 12.
- 2-64%로 비교적 높은 수치이며3) ADHD 치료 약물 중단의 여러 원인 중의 하나는 약물 부작용으로 보고 되었다.4) ADHD 아동의 약물치료에 관한 인식을 조사한 연구에서는, 12.7%의 아동이 메칠페니데이트를 복용한 후 부정적인 느낌을 보고하였으며, 약물치료에 대한 부정적 인식에 가장 많은 영향을 주는 인자는 약물 부작용인 것으로 생각되었다.5) Multimodal Treatment Study of Children with ADHD 연구에서 보고된 바로는 정신자극제 복용 14개월 후 49.
- 7%의 아동이 메칠페니데이트를 복용한 후 부정적인 느낌을 보고하였으며, 약물치료에 대한 부정적 인식에 가장 많은 영향을 주는 인자는 약물 부작용인 것으로 생각되었다.5) Multimodal Treatment Study of Children with ADHD 연구에서 보고된 바로는 정신자극제 복용 14개월 후 49.8%의 아동이 경미한 부작용을, 11.4%의 아동이 중등도의 부작용을, 2.9%가 심각한 부작용을 경험하였다.6) 오로스 메칠페니데이트(osmotic-release oral system methylphenidate,OROS MPH)의 비교적 흔한 부작용으로는 식욕부진, 불면, 두통, 복통 등이 있다.
- 6) 오로스 메칠페니데이트(osmotic-release oral system methylphenidate,OROS MPH)의 비교적 흔한 부작용으로는 식욕부진, 불면, 두통, 복통 등이 있다.7,8) OROS MPH를 복용한 569명의 ADHD 아동을 대상으로 한 국내 다기관 관찰 연구에서도 20.7%의 아동이 부작용을 호소하였으며 각 부작용의 빈도는 식욕부진(12.5%), 불면(8.2%), 두통(3.5%), 오심(2.6%)의 순으로 나타났다.9) 메칠페니데이트로 인한 심각한 부작용은 드물고 시간에 따라 호전되는 경우가 대부분이지만,2) 약물 부작용은 치료 순응도를 떨어뜨리는 중요한 요인 중의 하나이므로 이에 대한 예측 인자를 밝혀내는 것이 ADHD 치료 효과를 높이는 데 매우 중요하겠다.
- 6%)의 순으로 나타났다.9) 메칠페니데이트로 인한 심각한 부작용은 드물고 시간에 따라 호전되는 경우가 대부분이지만,2) 약물 부작용은 치료 순응도를 떨어뜨리는 중요한 요인 중의 하나이므로 이에 대한 예측 인자를 밝혀내는 것이 ADHD 치료 효과를 높이는 데 매우 중요하겠다.
- rs192303, rs3785143 SNP 모두 17가지 부작용 항목 중 ‘짜증’ 항목만이 통계적으로 유의미한 차이를 보였다(Table 2).
- SLC6A2 SNP 분석은 SNaPshot assay로 이루어졌다. rs192303은 GTGTGTCCATTTTGCAT(Forward)와 GGGAGAGTTTCCTCTCCT(Reverse)를, rs3785143은 CTGG AAAAGAT CAGCCTGT(Forward)와, CAAGAAGGTGCTGTGGTTA(Reverse)를 이용하여 SNP를 포함하는 부분을 증폭하였다. 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction,PCR)을 위한 반응액은 template DNA 10ng, forward/reverse primer 각각 0.
- rs3785143 CC 유전자형은 35.9%의 대상이 OROS MPH의 부작용으로 ‘짜증’을 보였으나 CC+CT 유전자형은 12.1%의 대상만이 ‘짜증’을 보였다(p=.010).
- rs192303 GG 유전자형의 빈도수(N=3)와 rs3785143TT 유전자형의 빈도수(N=6)가 낮아 분석에 제한이 있으므로, 통계적인 유의성을 고려하여 rs192303은 CC(N=76)와 CG+GG(N=21) 두 군으로 분류하였고, rs3785143은 CC(N=64)와 CT+TT(N=33) 두 군으로 분류하여 분석하였다. 각 유전자형에 따른 인구학적 변인 및 8주째 kg당 약물 용량,ADHD 평정척도 등은 통계적으로 유의미한 차이가 없었다(Table 1).
- 본 연구 결과, rs192303, rs3785143은 모두 OROS MPH의 부작용 중 ‘짜증’과 연관성이 있었다.
- 셋째, Barkley’sSide Effect Rating Scale의 항목들이 약물 부작용보다는 ADHD의 임상적 특성을 반영할 가능성이 있다.
- 연구 결과, rs3785143, rs192303은 모두 OROS MPH의 부작용 중 ‘짜증’과 연관성이 있었다.
후속연구
- 연구에 포함된 대상과 탈락한 대상의 유전자형은 통계적으로 유의미한 차이가 없었으나, 탈락된 대상군이 분석에 포함되지 않았다는 점이 연구 결과에 영향을 미쳤을 수 있다. 둘째, 본 연구는 위약대조군 연구가 아니었기 때문에 위약 효과를 배제하지 못하였다는 점이다. 셋째, Barkley’sSide Effect Rating Scale의 항목들이 약물 부작용보다는 ADHD의 임상적 특성을 반영할 가능성이 있다.
- 즉, 연구 결과를 바탕으로 개인의 유전 정보를 통해 약물에 대한 반응과 부작용을 예측하여 효과적인 약물을 빠른 시간 내에 찾아 치료 효과를 최대화할 수 있겠다. 본 연구는 위의 여러 가지 제한점에도 불구하고, SLC6A2와 OROS MPH의 부작용과의 연관성을 밝힌 연구이며, 향후 더욱 많은 수의 샘플을 대상으로 부작용에 대한 좀 더 객관적인 평가를 바탕으로 한 위약 대조군 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 본 연구의 결과에서 의미 있는 결과를 보인 ‘말을 적게 함’, ‘짜증’, ‘두통’, ‘졸림’ 등의 증상은 OROS MPH의 부작용이 아닌, 공존질환, 특히 기분장애 등으로 인한 증상일 가능성도 있으며 향후 연구에서는 공존질환에 대한 고려가 반드시 필요할 것으로 생각된다.
- 본 연구의 제한점은 첫째, OROS MPH를 8주까지 성공적으로 복용한 대상만을 포함했다는 점이다. 즉, 8주 이전에 탈락한 대상의 탈락 이유를 파악하지 못하였으며, 치료 유지를 하지 못할 정도의 심각한 부작용을 보인 대상들이 탈락하였을 가능성이 있다.
- 약물 유전학 연구를 통해, 특정 유전자와 약물의 임상적 반응과의 관계를 분석하고, 나아가 유전자가 약물의 부작용에 미치는 영향을 알 수 있다. 즉, 연구 결과를 바탕으로 개인의 유전 정보를 통해 약물에 대한 반응과 부작용을 예측하여 효과적인 약물을 빠른 시간 내에 찾아 치료 효과를 최대화할 수 있겠다. 본 연구는 위의 여러 가지 제한점에도 불구하고, SLC6A2와 OROS MPH의 부작용과의 연관성을 밝힌 연구이며, 향후 더욱 많은 수의 샘플을 대상으로 부작용에 대한 좀 더 객관적인 평가를 바탕으로 한 위약 대조군 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 부작용의 심각도 비교에서는 rs192303은 ‘말을 적게 함’, ‘관심이 없음’이 rs3785143은 ‘관심이 없음’과 ‘짜증’이 연관성을 보였다. 향후 SLC6A2를 중심으로 메칠페니데이트의 부작용에 관한 더욱 많은 약물 유전학 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 또는 이 두 SNP가, SLC6A2의 발현이나 단백질의 기능 혹은 구조에 영향을 줄 수 있는 기능적 변이들과 높은 연관 불균형(linkage disequilibrium)을 보일 가능성을 가정해 볼 수 있다. 향후 rs3785143과 rs192303 SNP의 기능적 결과를 밝혀내는 것, 혹은 이들 SNP 부위의 자세한 염색체 지도 작성이 OROS MPH 부작용과의 연관성에 대한 기전을 밝혀내는 데 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.
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