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문제 정의
- 본 연구에서는 식용 및 약용 가치가 있는 것으로 알려진 외생균근균을 탄소원이 서로 다른 MMN 액체배지에 각각 배양하여 균사 생장에 적합한 탄소원을 조사하고, 동일종 내 균주 간 탄소원 이용력을 비교하였으며, 균사체의 형태학적 생장 특성을 기술하였다.
- 탄소원 시험배지에 외생균근균을 접종하여 회분식 배양(batch culture)을 할 경우, 시간이 경과함에 따라 배지 내에는 균의 각종 대사산물들이 존재하게 되며, 이들이 수소이동 농도의 변화를 가져와 균사 생장에 영향을 끼칠 것으로 생각된다. 이에 본 연구에서는 60일간 균을 배양하고 회수한 7종류의 탄소원 배지를 대상으로 final pH를 측정하여 initial pH (pH 5.5)와의 차이가 있는 지를 조사하였다.
제안 방법
- 국내 및 스웨덴에서 수집하여 순수분리를 통해 국립산림과학원에 보존 중인 외생균근균을 대상으로 액체배지 내 탄소원 변화에 따른 균사생장 특성을 조사하였다(Table 1). 식용 가능하며 상업적 가치가 있다고 판단되는 균종의 종별 또는 동일 종내 균주 간 균사생장 특성을 비교하기 위해 다색벚꽃버섯, 향버섯, 접시껄껄이그물버섯, 송이 등을 각 균종별로 2균주씩 선택하여 총 8개 균주를 시험에 사용하였다.
- MMN 배지 내 유기질소원(malt extract)과 무기질소원((NH4)2HPO4, thiamin·HCl) 및 기타 미량 성분들은 그대로 유지한 채 포도당을 탄소원으로 하는 배지와 이를 대체하여 분자구조가 서로 다른 6종의 탄소원을 선택하여 10 g/L씩 배지에 동일하게 첨가하여 총 7종류의 시험배지를 제조하였다.
- 모든 시험균을 25±2℃에서 60일간 암배양한 후, 배양체의 형태적 특성(균사체의 색, 집락 수를 기준으로 한 생장 형태, 배지 착색)을 관찰하여 기록하였다.
- MMN 배지 내 유기질소원(malt extract)과 무기질소원((NH4)2HPO4, thiamin·HCl) 및 기타 미량 성분들은 그대로 유지한 채 포도당을 탄소원으로 하는 배지와 이를 대체하여 분자구조가 서로 다른 6종의 탄소원을 선택하여 10 g/L씩 배지에 동일하게 첨가하여 총 7종류의 시험배지를 제조하였다. 단당류로는 D-(+)-mannitol (FW 182.17)과 D-(+)-glucose (FW 180.16), 이당류는 D-(+)-trehalose dehydrate (FW 378.33), 삼당류는 D-(+)-raffinose pentahydrate (FW 594.51) 그리고 다당류로는 homoglycan계열 2종(soluble starch, dextrin from corn)과 heteroglycan 계열 1종(pectin from citrus peel)을 각각 첨가하여 제조하였다. 각 배지에 1 M HCl 또는 1M NaOH를 가하여 pH 5.
- 탄소원이 서로 다른 7종의 시험배지를 준비한 후, 각 배지 20 mL 당 시험균(직경 6 mm 크기의 접종원)을 1개씩 접종하였다. 모든 시험균을 25±2℃에서 60일간 암배양한 후, 배양체의 형태적 특성(균사체의 색, 집락 수를 기준으로 한 생장 형태, 배지 착색)을 관찰하여 기록하였다.
- 모든 시험균을 25±2℃에서 60일간 암배양한 후, 배양체의 형태적 특성(균사체의 색, 집락 수를 기준으로 한 생장 형태, 배지 착색)을 관찰하여 기록하였다. 또한 정성원형 여과지(직경 110 mm, Advantec No.5A, Japan)에 배양체를 여과하여 70℃에서 2일간 건조한 후, 균사체 건중량(mg/flask)을 측정하였다. 이와 함께 배양체 여과액을 회수하여 final pH를 측정하고 시험배지의 pH 변화를 조사하여 균사 생장과의 상관성을 조사하였다.
- 5A, Japan)에 배양체를 여과하여 70℃에서 2일간 건조한 후, 균사체 건중량(mg/flask)을 측정하였다. 이와 함께 배양체 여과액을 회수하여 final pH를 측정하고 시험배지의 pH 변화를 조사하여 균사 생장과의 상관성을 조사하였다.
- 공시한 외생균근성 버섯 균주의 균사 생장에 탄소원이 미치는 영향을 조사하기 위하여 Modified Melin-Norkran(MMN; sucrose 대신 glucose 10 g, malt extract 3 g, (NH4)2HPO4 0.25 g, CaCl2 0.05 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4·7H2O 0.15g, NaCl 0.025 g, 1% FeCl3 1.2 mL, thiamine·HCl 100 µg per 1 L) 배지를 기본배지로 사용하였다[3].
- 특히 생장 형태는 fungal colony의 크기에 상관 없이 시험배지 내 탄소원을 이용하여 세포의 생장점을 증가시킬만한 형태로 균사체가 분산되어 생장하는 지에 기준을 두어 임의로 배양 용기 내에 존재하는 fungal colony의 수에 따라 2종류로 구분하였다.
- 식용 가능하며 상업적 가치가 있다고 판단되는 균종의 종별 또는 동일 종내 균주 간 균사생장 특성을 비교하기 위해 다색벚꽃버섯, 향버섯, 접시껄껄이그물버섯, 송이 등을 각 균종별로 2균주씩 선택하여 총 8개 균주를 시험에 사용하였다. 접종원으로 사용할 순수배양체를 얻기 위해 potato dextrose agar (PDA) 사면배지에 냉장보존(4℃) 중이던 시험 균주들을 각 균종별로 PDA 또는 MMNA 배지(modified Melin-Norkran agar)에 접종하여 25℃에서 1~2개월간 암배양 하였다.
대상 데이터
- 민달걀버섯(Amanita caesarea)의 일부 균주는 단당류의 유도체인 sugar alcohol 계열의 만니톨이 함유된 고체 배지에서 균사 생장이 가장 우수하였고[11], 이당류인 trehalose와 heteroglycan계열의 펙틴 또한 바보송이(Tricholoma bakamatsutake)의 액체배양 시 균사 생장력이 우수한 탄소원으로 보고되었다[12]. 이와 같은 기존 연구를 참조하여 본 연구에서는 탄소원 7종(glucose, mannitol, trehalose, raffinose, starch, pectin, dextrin)을 선택하였다.
- 국내 및 스웨덴에서 수집하여 순수분리를 통해 국립산림과학원에 보존 중인 외생균근균을 대상으로 액체배지 내 탄소원 변화에 따른 균사생장 특성을 조사하였다(Table 1). 식용 가능하며 상업적 가치가 있다고 판단되는 균종의 종별 또는 동일 종내 균주 간 균사생장 특성을 비교하기 위해 다색벚꽃버섯, 향버섯, 접시껄껄이그물버섯, 송이 등을 각 균종별로 2균주씩 선택하여 총 8개 균주를 시험에 사용하였다. 접종원으로 사용할 순수배양체를 얻기 위해 potato dextrose agar (PDA) 사면배지에 냉장보존(4℃) 중이던 시험 균주들을 각 균종별로 PDA 또는 MMNA 배지(modified Melin-Norkran agar)에 접종하여 25℃에서 1~2개월간 암배양 하였다.
- 시험에 사용한 외생균근균의 대부분은 강원도(홍천, 평창, 고성)와 경남 지역의 에서 수집한 것이다(Table 1). 다색벚꽃버섯 KFRI 818과 1987, 향버섯 KFRI 1676, 접시껄껄이그물버섯 KFRI 1194와 1195은 신갈나무(Quercus mongoloca)나 Quercus sp.
성능/효과
- MMN 배지 내 탄소원 종류를 달리하여 외생균근균을 60일 간 배양한 결과, 송이 2균주(KFRI 1256, 1266)와 능이 1균주(KFRI 1677)를 제외한 대부분의 균주들은 pectin을 탄소원으로 한 배지에서 균체량이 가장 낮게 나타났다(Fig. 1~4). 이와 달리 총 8개의 시험균주 중 5균주(다색벚꽃버섯 KFRI 1987, 향버섯 KFRI 1676과 1677, 접시껄껄이그물버섯 KFRI 1194, 송이 KFRI 1256)는 dextrin이 함유된 배지에서 최대 균체량을 나타냈다.
- 1~4). 이와 달리 총 8개의 시험균주 중 5균주(다색벚꽃버섯 KFRI 1987, 향버섯 KFRI 1676과 1677, 접시껄껄이그물버섯 KFRI 1194, 송이 KFRI 1256)는 dextrin이 함유된 배지에서 최대 균체량을 나타냈다. 다당류 3종에 대한 이용도를 비교한 결과, 송이 KFRI 1256을 제외한 7개의 균주들은 heteroglycan보다는 homoglycan 계열의 탄소원에서 균사생장이 더 우수하였다.
- 이와 달리 총 8개의 시험균주 중 5균주(다색벚꽃버섯 KFRI 1987, 향버섯 KFRI 1676과 1677, 접시껄껄이그물버섯 KFRI 1194, 송이 KFRI 1256)는 dextrin이 함유된 배지에서 최대 균체량을 나타냈다. 다당류 3종에 대한 이용도를 비교한 결과, 송이 KFRI 1256을 제외한 7개의 균주들은 heteroglycan보다는 homoglycan 계열의 탄소원에서 균사생장이 더 우수하였다.
- 다색벚꽃버섯의 경우, KFRI 818과 KFRI 1987 균주는 pectin이 함유된 배지에서 최소 균체량을 나타냈으며, 두 균주 간 균체량이 약 2배 정도 차이를 보여 동일 균종이라도 pectin을 탄소원으로 이용하는 능력이 균주 간에 서로 다름을 알 수 있었다(Fig. 1). KFRI 818은 7종류의 탄소원 중 이당류인 trehalose가 함유된 배지에서, KFRI 1987은 삼당류인 raffinose (63.
- 향버섯 2균주는 Fig. 2에서와 같이 다당류인 homoglycan 계열의 dextrin을 탄소원으로 하는 시험배지에서 균체량이 최대에 달했으며, 두 균주 간 균체량에도 큰 차이를 보이지 않았다(KFRI 1676: 67.3±3.0 mg/flask, KFRI 1677: 63.3±1.5 mg/flask).
- 5 mg/flask). KFRI 1676은 starch가 함유된 배지에서도 높은 균체량을 나타냈는데, dextrin배지에서의 균체량과 통계적으로 유의한 차이가 없어 이 두 성분이 KFRI 1676의 균사생장에 적합한 탄소원임을 알 수 있었다. KFRI 1677은 다당류인 starch에서도 높은 균사 생장력을 나타냈는데, 이 균주의 경우 단당류, 이당류, 삼당류보다는 homopolycan 계열의 두 다당류에서 균 생장력이 높아 다당류의 이용 능력이 우수함을 알 수 있었다.
- KFRI 1676은 starch가 함유된 배지에서도 높은 균체량을 나타냈는데, dextrin배지에서의 균체량과 통계적으로 유의한 차이가 없어 이 두 성분이 KFRI 1676의 균사생장에 적합한 탄소원임을 알 수 있었다. KFRI 1677은 다당류인 starch에서도 높은 균사 생장력을 나타냈는데, 이 균주의 경우 단당류, 이당류, 삼당류보다는 homopolycan 계열의 두 다당류에서 균 생장력이 높아 다당류의 이용 능력이 우수함을 알 수 있었다. 접시껄껄이그물버섯 역시 7종류의 탄소원 중 pectin이 함유된 배지에서 균 생장력은 최저로 나타났으며, KFRI 1194와 KFRI 1195 간 균체량은 유사하였다(Fig.
- 3). KFRI 1194의 탄소원별 균사 생장력을 비교한 결과, dextrin, starch, trehalose, monosaccharides (mannitol, glucose), raffinose, pectin 순으로 균체량이 높게 나타났다. KFRI 1195는 단당류나 다당류보다는 raffinose와 trehalose와 같은 탄소원에서 최대 균체량을 나타냈으며, pectin과 dextrin이 함유된 배지는 다른 탄소원 6종에 비해 균체량이 현격히 낮았다(Fig.
- KFRI 1266은 KFRI 1265와는 달리 dextrin에서 균체량이 최소였으며, starch와 mannitol 및 trehalose에서의 균체량은 통계적으로 유의한 차이가 없었다(p<0.05).
- 0까지 감소하였다. 다색벚꽃버섯을 접종한 탄소원 시험배지에서의 initial pH와 final pH 값의 평균치를 기준으로 격차 범위를 조사한 결과, pH는 최소 1.1~최대 2.7까지 감소하였다. KFRI 818의 경우 pectin이 함유된 배지에서 final pH 값이 4.
- 이상과 같이 MMN 배지를 기본으로 탄소원을 달리하여 외생균근균을 액체배양할 경우, 대부분의 외생균근균들은 균체량이 증가함에 따라 배지의 final pH가 감소하는 특성을 나타냈다. 이는 MMN 배지 또는 암모늄 형태의 무기질소원으로 치환된 MMN 변형배지에 외생균근균을 배양한 선행 연구 결과와도 일치하는 것으로, 송이를 포함한 몇몇 외생균근균들을 액체배양한 경우 두 배지 모두 final pH가 3.
- 다색벚꽃버섯 KFRI 818의 균사생장 특성을 조사한 결과, pectin을 제외한 6종의 탄소원 시험배지 모두에서 백색의 균사체가 관찰되었으며, 균의 영양세포가 분열한 후 배지 내에 여러 개로 흩어져 fungal colony를 형성한 것으로 추정되는 multiple colony의 생장 형태를 나타냈다(Table 3). 또한 액체배지를 착색시킬만한 멜라닌 색소 등은 관찰되지 않았다.
- Pectin이 함유된 배지에서는 KFRI 818과 1987 모두 접종원을 중심으로 균 생장이 매우 저조한 single colony 형태로 생장하였다. 향버섯 2균주는 7종의 탄소원 시험배지에서 모두 multiple colony의 형태로 생장하였으며, 배지 착색은 관찰되지 않았으나, 균사체의 색은 KFRI 1676과 KFRI 1677 간 다르게 나타났다(Table 3). KFRI 1676은 pectin을 제외한 6종의 탄소원 시험배지에서 백색의 균사체를 형성한 반면, KFRI 1677은 탄소원 배지별로 백색과 옅은 자주색(또는 옅은 갈색)이 혼합되어 있거나 옅은 자주색과 갈색이 혼합되어 있는 등 다양한 색상의 균사체가 관찰되었다(Table 3).
- 또한 pectin은 물과 접촉 시 점성이 증가하고, 매우 빠르게 수화되어 clump를 형성하는 경향이 있어 가정용 잼 등을 제조하는 데에도 이용된다[13]. 본 실험에서는 사용한 pectin은 감귤류 껍질에서 추출한 heteropolysaccaride로, 외생균근균의 균사체 주변에 수화된 pectin 고분자가 흡착하거나 포위하여 세포의 생장점 증가 기회를 감소시킴으로써 light brown 계열의 single colony로 남게 된 것으로 보인다. 접시껄껄이그물버섯의 두 균주는 pectin을 포함한 3종류의 다당류 모두에서 single colony의 형태로 균사체가 생장하는 데, pectin보다 soluble starch나 dextrin에서의 균체량이 유의하게 많아 heteroglycan보다 homoglycan 구조의 다당류에 대한 이용도가 높았던 것으로 생각된다.
- 또한 KFRI 1256과 KFRI 1266은 동일한 균종임에도 불구하고, 7종류의 탄소원을 그들의 균사 생장을 위해 이용하는 능력이 서로 다른 특성을 보였다.
- 1로 측정되어 다른 탄소원 시험배지에 비해 높았다. 또한 KFRI 1195의 균체량은 다른 종류의 탄소원 시험배지보다 pectin이나 dextrin이 함유된 시험배지 에서 유의하게 낮아 균체량과 시험배지의 final pH값이 역시 반비례 관계를 나타냈다. 송이 2균주 역시 7종류의 탄소원 중 pectin이 함유된 배지에서의 final pH값이 높게 나타났다.
후속연구
- 이 두 종류의 균류와 함께 외생균근균과 부생균의 탄소원 섭취 방식을 오가는 facultative ECM fungi를 구별하기란 쉽지 않을 것으로 생각되나, 특정 탄소원이 함유된 배지에서 균을 배양하여 그 균이 세포 외로 방출하는 효소에 대한 활성을 검정하고 효소 발현을 주도하는 genome sequence를 밝힌다면 균류의 진화적 측면에서 이들을 일차적으로 구별할 수도 있을 것이다.
- 동일한 송이균종임에도 불구하고 이와 같이 두 균주 간 탄소원 이용 능력이 서로 다른 이유는 명확히 알 수 없으나 두 균주가 발생한 지역의 식생이 서로 다른 데에 기인한 결과로 추정된다. 또한 시험 규모가 적어 시험균주들의 식생과 탄소원 이용과의 상관관계를 통계적으로 제시하기는 어려우나, 활엽수와 침엽수에서 발생한 균종 간의 탄소원 이용도에 차이가 있는 것으로 보아 기주식물의 종류와 외생균근균이 주로 이용하는 특정 탄소원과의 상관관계를 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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