[논문]재조합 Escherichia coli 시스템을 이용한 재조합 말라리아 항원의 발현 최적화 연구

홍성희; 박도영; 황영보; 박현; 황현아

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홍성희 (군산대학교 공과대학 화학공학과) , 박도영 (원광대학교 의과대학 기생충학 교실) , 황영보 (군산대학교 공과대학 화학공학과) , 박현 (원광대학교 의과대학 기생충학 교실) , 황현아 (원광대학교 의과대학 기생충학 교실)

본 연구에서는 말라리아 항원의 생물학적 대량 생산 공정을 디자인하기 위하여 자체 개발한 재조합 E. coli 시스템의 여러 가지 조업 조건들, 즉 균체 성장과 외래 단백질의 유도 발현에 영향을 미치는 초기 배지 pH, 유도 발현 이후의 조업 온도 및 타이밍 , 그러고 기간 등을 조사함과 동시에 최적 배양 전략을 탐색하였다.

The production of the recombinant Plasmodium vivax merozoite surface protein (PvMSP) has been investigated in the recombinant E.coli system. Experimental optimization of the culture conditions, such as the effect of initial pH, and operating temperature has been tried on the growth of recombinant E.coli and on the overproduction of the target foreign protein.

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문제 정의

상실한다는 사실이다. 따라서 유도물질에 의한 발현 야기와 동시에 조업 온도도 함께전이시킨으로써 내포체 형성을 줄일 가능성을 살펴보았다.
본 연구에서는 말라리아 진단에 사용되는 재조합 맒라리아 항원의 생물학적 대량 셍산을위하여, 보다 유용한 벡터 시스템을 숙주인 데장균에 도입하여, 보다 생산성이 뛰어난 재조한 미생물 시△템을 선별하는 동시에, 이렇게 개발된 균주 시스템의 최적 베양 및 발현 방법을 확립함으로써 보다 경제성이 있는 재조합 단백질의 제조 공정 및 배양진략을 확립하고자 한다
본 연구에서는 말라리아 항원의 생물학적 대량 생산 공정을 디자인하기 위하여 자체 개발한재조합 E. coli 시스템의 여러가지 조업 조건들, 즉 균체 성장과 외래 단백질의 유도 발현에 영향을 미치는 초기 베지 pH, 유도 발현 이후의 조업 온도 및 타이밍, 그리고 기간 둥을조사함과 동시에 최직 배양 진략을 탐색하였다.

제안 방법

재조합 Echerichia co"의 종균 배양은 LB베지를 사용하여 12시간 정도 진탕 베양기에서실시하였고, 최적 배양조건 탐색을 위한 회분배양 실힘을 위하여 modified LB 배지를 사용하여 IL baffled flask (working volume 300mL) 에 종균 배양액을 1% 접종하여 371, '220rpm의 조건으로 진탕 베양기에서 실험을 수행하였다.
측정함으로써 추정하였고, 다시 dry cell mass로 환산하였다. IPTG에 의한 재조합 외래 단백질의 발현 양상을 비교 검토하기 위하여, 시간별로 채취된 시료들을 12% polyacrylamide gel에서 SDS-PAGE 함과 동시에 최종적으로 얻어지는 gel을 다시 scanning 및 image analysis 하여 추정 농도를 살펴봄으로써 시간에 따른 목적 재조합 단백질의 발현양상을 서로 비교하였匸단백질 정량은 BSA(Bovine Serum Albumin)를 표준물질로 사용하였다.
따라서 균체 성장은 23'C인 경우가 빠른 균체성장을 나타내고 있으나 발현량은 많지 않았음을 확인할 수 있었다. 그리나 전술된 바와 같이 내포체의 형성을 줄이기 위한 방법으로서 유도발현과 동시에조업 온도의 전이에 대한 실험을 별도로 실시하였으며 그 걸과는 그림 5에 나타내었다.
0H 용액으로 pH 6~8까지 별도로 조절하여 각각 베양 및 IPTG 유도발현 시키면서 시간별로 시료를 체취하여 각 pH에서의 균체성장 및 재조합 단매질의 발현양을 측정하였다. 마지막으로 앞서 구한 최적 온도 및 pH 조건에서 발헌 유도물질인 IPTG의 농도 영향도 더불어 살펴보았다.
베양 온도에 따른 재조합 단백질의 발현양과 균체 성장 양상을 살펴보기 위해서 여러 가지 다른 온도(27, 32, 37C)에서 베양 및 IPTG 유도발현을 별도로 각각 실시하였으며, 또한초기 pH의 영향을 조사하기 위해서 재조합 단벡질 생산 베지의 초기 pH를 1N-HCI 및 4N-NH.0H 용액으로 pH 6~8까지 별도로 조절하여 각각 베양 및 IPTG 유도발현 시키면서 시간별로 시료를 체취하여 각 pH에서의 균체성장 및 재조합 단매질의 발현양을 측정하였다. 마지막으로 앞서 구한 최적 온도 및 pH 조건에서 발헌 유도물질인 IPTG의 농도 영향도 더불어 살펴보았다.
비양 과정에서의 균체 증식도는 UV spectrophotometer를 이용하여, 배양액의 광밀도 (OD600)를 측정함으로써 추정하였고, 다시 dry cell mass로 환산하였다. IPTG에 의한 재조합 외래 단백질의 발현 양상을 비교 검토하기 위하여, 시간별로 채취된 시료들을 12% polyacrylamide gel에서 SDS-PAGE 함과 동시에 최종적으로 얻어지는 gel을 다시 scanning 및 image analysis 하여 추정 농도를 살펴봄으로써 시간에 따른 목적 재조합 단백질의 발현양상을 서로 비교하였匸단백질 정량은 BSA(Bovine Serum Albumin)를 표준물질로 사용하였다.

성능/효과

그림 3의 균체 성장 곡선과는 반대로 37X?의 경우가 23P인 경우보다 높은 발현량을 나타내고 있다. 따라서 균체 성장은 23'C인 경우가 빠른 균체성장을 나타내고 있으나 발현량은 많지 않았음을 확인할 수 있었다. 그리나 전술된 바와 같이 내포체의 형성을 줄이기 위한 방법으로서 유도발현과 동시에조업 온도의 전이에 대한 실험을 별도로 실시하였으며 그 걸과는 그림 5에 나타내었다.
유도발현 이후 23P의 낮은 온도에서 배양하는 것이 내포체의 형성을 감소시키는데 효과가확신한을 학인할 수 있었으며 이리한 결과는 유도발현과 농시에 상대적으로 낮은 온도에서배양하는 것이 재조합 말라리아 항원 생산 속도룔 낮추어 천친히 생산됨으로서 발헌량은떨어지나 내포체 형 성올 줄일 수 있을 것으로 사려된다.

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