미세조류 유래 mycosporine-like amino acids (MAAs) 혼합물의 항주름활성을 분석하기 위하여 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자 발현분석을 실시하였다. Chlamydomonas sp.를 80% 에탄올로 추출하고, 컬럼을 통해 분획물을 정제하고, HPLC 분석을 통해 asterina 330+palythine (A+P) 및 shinorine+palythine (S+P) 혼합물을 정제하였다. MTT assay 결과 A+P 및 S+P는 0.1 mg/mL까지 세포독성을 나타내지 않았다. UV에 노출된 섬유아세포에 대한 MAAs 혼합물의 영향을 분석하였을 때, 0.05 mg/mL A+P 및 0.01 mg/mL S+P 농도에서 각각 2.7 및 3.6 배 PCOLCE mRNAs 발현이 증가하였다. Elastin 유전자는 0.01 mg/mL의 A+P 및 S+P를 처리하였을 때 각각 5.59배 및 3.1배 발현이 증가하였다. 특히 0.01 mg/mL의 A+P 및 S+P 농도에서 involucrin mRNAs 발현이 UV 처리된 대조구와 비교하였을 때 5배 및 2.5배 감소하였다. 결론적으로 Chlamydomonas sp. 유래 MAAs 혼합물은 주름개선용 기능성 화장품 개발을 위한 소재로써의 가능성이 충분한 것으로 판단되었다.
미세조류 유래 mycosporine-like amino acids (MAAs) 혼합물의 항주름활성을 분석하기 위하여 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자 발현분석을 실시하였다. Chlamydomonas sp.를 80% 에탄올로 추출하고, 컬럼을 통해 분획물을 정제하고, HPLC 분석을 통해 asterina 330+palythine (A+P) 및 shinorine+palythine (S+P) 혼합물을 정제하였다. MTT assay 결과 A+P 및 S+P는 0.1 mg/mL까지 세포독성을 나타내지 않았다. UV에 노출된 섬유아세포에 대한 MAAs 혼합물의 영향을 분석하였을 때, 0.05 mg/mL A+P 및 0.01 mg/mL S+P 농도에서 각각 2.7 및 3.6 배 PCOLCE mRNAs 발현이 증가하였다. Elastin 유전자는 0.01 mg/mL의 A+P 및 S+P를 처리하였을 때 각각 5.59배 및 3.1배 발현이 증가하였다. 특히 0.01 mg/mL의 A+P 및 S+P 농도에서 involucrin mRNAs 발현이 UV 처리된 대조구와 비교하였을 때 5배 및 2.5배 감소하였다. 결론적으로 Chlamydomonas sp. 유래 MAAs 혼합물은 주름개선용 기능성 화장품 개발을 위한 소재로써의 가능성이 충분한 것으로 판단되었다.
To examine the effects of a mycosporine-like amino acids (MAAs) mixture from microalgae, Chlamydomonas sp, on the anti-wrinkle activities, the expression levels of genes that are associated with skin aging, including type I procollagen, elastin and involucrin, were analyzed. Asterina 330+palythine (...
To examine the effects of a mycosporine-like amino acids (MAAs) mixture from microalgae, Chlamydomonas sp, on the anti-wrinkle activities, the expression levels of genes that are associated with skin aging, including type I procollagen, elastin and involucrin, were analyzed. Asterina 330+palythine (A+P) and shinorine+palythine (S+P) mixtures were purified from Chlamydomonas sp using the following steps: 80% methanolic extraction, column purification, and HPLC analysis. As a result of the MTT assay, A+P and S+P did not induce cellular cytotoxicity with up to 0.1 mg/mL of both MAAs. In addition, the treatment of UV-exposed fibroblasts with A+P (0.05 mg/mL) and S+P (0.01 mg/mL) increased the levels of the PCOLCE mRNAs by 2.7 and 3.6 fold compared to the control group, respectively, The levels of elastin gene expression were elevated 5.59 and 3.1 fold in the A+P and S+P treated (0.01 mg/mL) cells, respectively. In particular, at a concentration of 0.01 mg /mL, the A+P and S+P expression levels of Involucrin mRNAs were increased 3.5 and 2.5 fold in the UV-exposed cells compared to the control, respectively. In conclusion, the MAAs derived from Chlamydomonas sp can be utilized as functional cosmetic materials with anti-wrinkle effects on the skin.
To examine the effects of a mycosporine-like amino acids (MAAs) mixture from microalgae, Chlamydomonas sp, on the anti-wrinkle activities, the expression levels of genes that are associated with skin aging, including type I procollagen, elastin and involucrin, were analyzed. Asterina 330+palythine (A+P) and shinorine+palythine (S+P) mixtures were purified from Chlamydomonas sp using the following steps: 80% methanolic extraction, column purification, and HPLC analysis. As a result of the MTT assay, A+P and S+P did not induce cellular cytotoxicity with up to 0.1 mg/mL of both MAAs. In addition, the treatment of UV-exposed fibroblasts with A+P (0.05 mg/mL) and S+P (0.01 mg/mL) increased the levels of the PCOLCE mRNAs by 2.7 and 3.6 fold compared to the control group, respectively, The levels of elastin gene expression were elevated 5.59 and 3.1 fold in the A+P and S+P treated (0.01 mg/mL) cells, respectively. In particular, at a concentration of 0.01 mg /mL, the A+P and S+P expression levels of Involucrin mRNAs were increased 3.5 and 2.5 fold in the UV-exposed cells compared to the control, respectively. In conclusion, the MAAs derived from Chlamydomonas sp can be utilized as functional cosmetic materials with anti-wrinkle effects on the skin.
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문제 정의
)로부터 mycosporine-like amino acids (MAAs) 혼합물을 추출하고, MAAs 혼합물의 세포독성 분석을 위하여 MTT assay를 수행하였다. 또한 MAAs 혼합물의 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자 발현에 대한 영향을 분석하여 새로운 항주름 화장품 첨가제로써 MAAs의 활용가능성을 검토하였다.
추출물의 항 피부노화 활성분석을 위하여 다양한 연구방법이 적용되고 있는데, 특히 Procollagen C proteinase enhancer (PCOLCE), elastin 및 involucrin 유전자 발현 분석은 다양한 추출물 또는 화합물의 항피부노화 활성 분석에 적용되고 있다[17-20]. 본 연구에서는 미세조류 (Chlamydomonas sp.)로부터 mycosporine-like amino acids (MAAs) 혼합물을 추출하고, MAAs 혼합물의 세포독성 분석을 위하여 MTT assay를 수행하였다. 또한 MAAs 혼합물의 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자 발현에 대한 영향을 분석하여 새로운 항주름 화장품 첨가제로써 MAAs의 활용가능성을 검토하였다.
제안 방법
FBS free DMEM 배지로 교환 후 MAAs 혼합물을 처리하였다. 24시간 추가 배양한 후 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자의 발현을 UV 처리구와 UV+MAAs 처리구로 나누어 분석하였다.
항주름과 관련한 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자를 분석하기 위하여 합성된 cDNA를 주형으로 사용하였다. 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR machine (Qiagen)으로 수행하였다. 실험에 사용한 primers는 Qiagen사의 QuantiTect® primer assays (18S rRNA QT00199367, β-actin QT01680476, PCOLCE: QT01005725; Elastin: QT00034594; Involucrin: QT00082586)를 사용하였다.
1% 처리까지 세포독성을 보이지 않았다. A+P 및 S+P의 인간섬유아세포에서의 콜라겐 합성에 대한 영향을 분석하기 위하여 PCOLCE, elastin 및 involucrin 유전자의 발현을 분석하였다. A+P 및 S+P 는 각각 PCOLCE 및 elastin 유전자의 발현을 증가시켰으며, involucrin 유전자의 발현은 감소시켰다.
PCR 증폭 반응은 total 20 μL로 10X rection buffer 2 μL, 2.5 mM dNTPs 2 μL, Taq DNA polymerase 0.5 μL, cDNA 5 μL, SYBR 1 μL를 혼합하여 반응을 수행하였다.
5 mL/min의 속도로 전개하여 정제추출물-2를 얻었다. 각 추출물은 vacuum evaporator를 이용하여 농축하고, 진공건조시켜 고형화된 2종의 추출물을 획득하였다. 최종적으로 얻어진 2종의 추출물은 HPLC를 이용하여 mycosporine-like amino acids 조성을 분석하였다[21].
2) 여과지로 여과하여 상등액과 잔여 Chlamydomonas sp. 고형물을 분리시켰다. 분리된 잔여고형물로부터 상기의 추출 및 여과를 2회 더 반복하여 추출하였다.
1%까지 90%이상의 cell viability를 보여 세포독성이 없는 것으로 확인되었다[Table 1]. 따라서 항주름활성 분석시 0.1 mg/mL 농도 이하에서 처리하고, 활성을 분석하였다.
미세조류 유래 MAAs인 A+P 및 S+P의 피부세포에서의 콜라겐 생성에 대한 영향을 확인하기 위하여 PCOLCE, elastin 및 involucrin 유전자의 발현을 분석하였다. 각 유전자의 발현정도는 UV만을 조사한 시료에 대한 상대적인 발현량으로 표시하였다.
5 μL, cDNA 5 μL, SYBR 1 μL를 혼합하여 반응을 수행하였다. 반응 조건은 94℃에서 15초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초씩 각각 40 사이클을 실시하였다.
Fibroblast 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well 되도록 분주한 후 confluence가 80% 이상 도달할 때까지 배양하였다. 배지를 제거한 다음 50 mJ의 UV를 조사하여 염증을 유도하였다. FBS free DMEM 배지로 교환 후 MAAs 혼합물을 처리하였다.
고형물을 분리시켰다. 분리된 잔여고형물로부터 상기의 추출 및 여과를 2회 더 반복하여 추출하였다. 분리된 상등액을 모두 모은 후 vacuum evaporator로 농축하고 건조시켜서 고형화된 Chlamydomonas sp.
Chlamydomonas sp. 유래 asterina 330+palythine 혼합물(A+P) 및 shinorine+palythine 혼합물(S+P)의 세포독성을 MTT assay를 통하여 분석하였다. MTT assay 는 미토콘드리아에 존재하는 dehydrogenase에 의해 MTT로부터 형성된 MTT-formazan의 양을 측정하는 세포독성 분석 기법이다[22].
Chlamydomonas sp. 정제추출물 1 및 2의 MAAs 함량을 HPLC 흡광도를 이용하여 분석하였다. 정제추출물-1의 주요 MAAs 성분은 palythine과 asterina 330으로 나타났으며, 각각 5.
최근 주목을 받고 있는 미세조류 유래 mycosporinelike amino acids (MAAs)의 항주름효과를 분석하였다. 동결건조된 Chlamydomonas sp.
RNA 분리와 cDNA 합성은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN 216213)의 사용매뉴얼에 따라 실시 하였다. 항주름과 관련한 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자를 분석하기 위하여 합성된 cDNA를 주형으로 사용하였다. 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR machine (Qiagen)으로 수행하였다.
대상 데이터
Fibroblast 세포 배양을 위해서 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% Fatal bovine serum (FBS) 및 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO, Cat No. 15240-062)가 혼합된 배지에서 배양하였다.
실험에 사용한 primers는 Qiagen사의 QuantiTect® primer assays (18S rRNA QT00199367, β-actin QT01680476, PCOLCE: QT01005725; Elastin: QT00034594; Involucrin: QT00082586)를 사용하였다.
인간 섬유아세포(fibroblast 세포)는 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 분양받았다. Fibroblast 세포 배양을 위해서 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% Fatal bovine serum (FBS) 및 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO, Cat No.
추출물 수용액은 Prep LC system (Koto, Japan)을 이용하여 물-50% 메탄올 농도 구배로 전개시킨(5 mL/min) 후, UV detector 및 RI detector를 사용하여 280-400 nm의 자외선 파장을 흡수하는 Chlamydomonas sp. 추출 분획물을 획득하였다.
데이터처리
데이터의 normality와 균질성은 ANOVA로 확인 하였고, 실험구간의 차이는 one-way ANOVA와 Duncan’'s multiple range test로 평가하였다.
통계분석은 SPSS 통계 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 데이터의 normality와 균질성은 ANOVA로 확인 하였고, 실험구간의 차이는 one-way ANOVA와 Duncan’'s multiple range test로 평가하였다.
이론/모형
RNA 분리와 cDNA 합성은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN 216213)의 사용매뉴얼에 따라 실시 하였다. 항주름과 관련한 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자를 분석하기 위하여 합성된 cDNA를 주형으로 사용하였다.
항주름 활성은 UV (7.5 J/m2)에 노출된 fibroblast 세포의 type I procollagen, elastin 및 involucrin 유전자의 발현에 대한 MAAs의 영향을 qRT-PCR 법을 이용하여 분석하였다. Fibroblast 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well 되도록 분주한 후 confluence가 80% 이상 도달할 때까지 배양하였다.
성능/효과
A+P 및 S+P의 인간섬유아세포에서의 콜라겐 합성에 대한 영향을 분석하기 위하여 PCOLCE, elastin 및 involucrin 유전자의 발현을 분석하였다. A+P 및 S+P 는 각각 PCOLCE 및 elastin 유전자의 발현을 증가시켰으며, involucrin 유전자의 발현은 감소시켰다. 본 연구의 결과는 Chlamydomonas sp.
Elastin 유전자는 대조군과 비교하여 0.01% 및 0.05%의 A+P 처리시 각각 약 5.59배 및 3.37배 유전자 발현이증가하였으며, 동량의 S+P를 처리하였을 때 각각 약 3.1배 및 2.0배 유전자 발현이 증가하였다[Fig. 3]. Involucrin 유전자 발현은 0.
1B]. Palythine과 shinorine 은 함유율이 각각 20.8% 및 57.3%로 분석되었다.
각 유전자의 발현정도는 UV만을 조사한 시료에 대한 상대적인 발현량으로 표시하였다. UV만을 처리한 대조군과 비교하여 0.01% 및 0.05%의 A+P를 처리하였을때 PCOLCE 유전자 발현은 각각 약 1.4배 및 2.7배 증가하였으며, 0.01%의 S+P를 처리하였을 때 약 3.6배의 유전자 발현이 증가되었다[Fig. 2].
MTT assay 는 미토콘드리아에 존재하는 dehydrogenase에 의해 MTT로부터 형성된 MTT-formazan의 양을 측정하는 세포독성 분석 기법이다[22]. 배양된 HaCat 세포에 MAAs 혼합물을 각각 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mg/mL 농도로 처리하였을 때 A+P 및 S+P 모두 0.1%까지 90%이상의 cell viability를 보여 세포독성이 없는 것으로 확인되었다[Table 1]. 따라서 항주름활성 분석시 0.
동결건조된 Chlamydomonas sp. 분말을 80% 메탄올 용액, Prep LC system, size exclusive column 및 hydrophobic interaction column을 순차적으로 적용하여 MAAs를 추출하였고, HPLC를 이용하여 추출물이 asterina 330+palythine 혼합물(A+P) 및 shinorine+ palythine 혼합물(S+P)로 구성되어 있음을 확인하였다. 추출된 A+P 및 S+P는 0.
본 연구결과는 Chlamydomonas sp. 유래 MAAs인 A+P 및 S+P 추출물이 인간섬유아세포의 콜라겐합성에 긍정적인 영향을 주고 있으며, 항주름 화장품의 첨가물로 활용가능함을 보여준다.
정제추출물 1 및 2의 MAAs 함량을 HPLC 흡광도를 이용하여 분석하였다. 정제추출물-1의 주요 MAAs 성분은 palythine과 asterina 330으로 나타났으며, 각각 5.691 분과 6.09분에 검출되었다[Fig. 1A]. Palythine과 asterina 330은 함유율이 각각 15.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
피부노화의 외적요인은?
내적요인으로는 주로 개인의 유전적 배경에 의해 나타나지만[2], 라디칼 생성, 염증, 스트레스, 돌연변이 및 세포대사의 불균형 등이 영향을 미치는 것으로 알려져 있다[3]. 공해, 질병, 흡연 및 자외선 등은 피부노화를 유도하는 외적요인이며[4], 특히 장기적인 자외선 노출로 인한 피부노화는 광노화로 불리기도 한다[5]. 피부가 자외선에 지속적으로 노출되면 세포외기질을 생산하는 섬유아세포의 활성이 저하되고, 콜라겐 생합성이 감소하고, 변형된 엘라스틴이 증가하게 된다.
MAAs는 어떤 물질인가?
자외선 흡수/차단 화합물 중 MAAs는 자외선 광차단 기능이 알려지면서 주목을 받고 있다. MAAs는 남조류, 균류, 미세조류 및 해조류 등 대부분의 광합성 식물에서 합성되는 자외선 흡수물질이다[8-10]. 약 20여종의 MAAs가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 최대흡수파장은 310-360 nm이다[11], MAAs는 in vivo 에서 UV에 의해 유도되는 피부손상을 막는 기능[12]을 가지고 있기 때문에 피부관리와 화장품 소재로 사용된다[13].
광노화에 의해 주름이 생성되는 과정은?
공해, 질병, 흡연 및 자외선 등은 피부노화를 유도하는 외적요인이며[4], 특히 장기적인 자외선 노출로 인한 피부노화는 광노화로 불리기도 한다[5]. 피부가 자외선에 지속적으로 노출되면 세포외기질을 생산하는 섬유아세포의 활성이 저하되고, 콜라겐 생합성이 감소하고, 변형된 엘라스틴이 증가하게 된다. 또한 세포외기질을 분해하는 matrix metallo-proteinases (MMPs)의 중가로 콜라겐의 분해가 증가하게 되고, 활성 산소 등 해로운 성분이 쉽게 진피에 영향을 미치게 되어 주름이 생성되는 것으로 알려져 있다[3-5].
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