[논문]청미래덩굴 잎 물추출물이 처리된 HepG2 세포에서의 포도당흡수기전 연구

강윤환; 김대중; 김경곤; 이성미; 최면

doi:10.4163/jnh.2014.47.3.167

청미래덩굴 잎 물추출물이 처리된 HepG2 세포에서의 포도당흡수기전 연구
Study of the mechanisms underlying increased glucose absorption in Smilax china L. leaf extract-treated HepG2 cells 원문보기

Journal of nutrition and health, v.47 no.3, 2014년, pp.167 - 175

강윤환 (강원대학교 강원웰빙특산물산업화지역혁신센터) , 김대중 (강원대학교 강원웰빙특산물산업화지역혁신센터) , 김경곤 (강원대학교 생명건강공학과) , 이성미 (강원대학교 생명건강공학과) , 최면 (강원대학교 강원웰빙특산물산업화지역혁신센터)

초록
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본 연구에는 SCLE를 이용하여 시도된 바가 없는 glucose uptake 유도 실험을 수행하여 HepG2 세포에서 포도당흡수가 증가함을 확인하였다. 또한 이런 포도당의 흡수는 HNF-$1{\alpha}$라는 transcription factor의 활성화를 통해 GLUT-2의 발현을 증가시키기 때문인 것을 실험적으로 증명하였다. 뿐만 아니라 Bacillus stearothermophilus 유래의 GK를 이용하여 활성을 측정한 결과 SCLE가 직접적으로 GK를 활성화하여 포도당의 인산화에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었으며 그 실험결과들은 Fig. 8에서 도식화 하였다. 본 연구를 통해 SCLE가 ${\alpha}$-glucosidase inhibition 활성에 의한 혈당의 개선과 당뇨예방 효과뿐만 아니라 다양한 세포내 기전을 통해 혈당 및 당뇨의 개선을 유도할 수 있음을 확인하였고, 이는 SCLE가 neutraceuticals 소재로서의 개발가치가 높음을 시사한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose: Previous studies have shown that treatment with Smilax china L. leaf extract (SCLE) produces antidiabetic effects due to ${\alpha}$-glucosidase inhibition. In this study, we examined the mechanism underlying these antidiabetic effects by examining glucose uptake in HepG2 cells cultured with SCLE. Methods: Glucose uptake and glucokinase activity were examined using an assay kit. Expression of glucose transporter (GLUT)-2, GLUT-4, and HNF-$1{\alpha}$ was measured by RT-PCR or western blot. Results: Treatment with SCLE resulted in enhanced glucose uptake in HepG2 cells, and this effect was especially pronounced when cells were cultured in an insulin-free medium. SCLE induced an increase in expression of GLUT-2 but not GLUT-4. The increase in the levels of HNF-$1{\alpha}$, a GLUT-2 transcription factor, in total protein extract and nuclear fraction suggest that the effects of SCLE may occur at the level of GLUT-2 transcription. In addition, by measuring the change in glucokinase activity following SCLE treatment, we confirmed that SCLE stimulates glucose utilization by direct activation of this enzyme. Conclusion: These results demonstrate that the potential antidiabetic activity of SCLE is due at least in part to stimulation of glucose uptake and an increase in glucokinase activity, and that SCLE-stimulated glucose uptake is mediated through enhancement of GLUT-2 expression by inducing expression of its transcription factor, HNF-$1{\alpha}$.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에는 SCLE를 이용하여 시도된 바가 없는 glucose uptake 유도 실험을 수행하여 HepG2 세포에서 포도당흡수가 증가함을 확인하였다. 또한 이런 포도당의 흡수는 HNF-1α라는 transcription factor의 활성화를 통해 GLUT-2의 발현을 증가시키기 때문인 것을 실험적으로 증명하였다.
이는 SCLE에 의해 증가된 mRNA가 안정적 으로 단백질 합성에 영향을 미쳤으며 GLUT-2가 배지 내에 존재하는 포도당의 운반에 지속적으로 작용을 하고 있음을 의미한다. 이런 SCLE처리에 의한 GLUT-2의 발현이 어떻게 이루어졌는지 확인하기 위해 GLUT-2 promoter에 결합하는 transcription factor들을 검토하였다. 그 결과 HNF-1α, HNF-4α, FOXA2, SREBP-1c, C/EBPβ 등¹⁹이 보고되어 있음을 확인하였고 그 중 HNF-1α와 C/EBPβ가 human GLUT-2의 promoter에서 연구된 것을 확인할 수 있었다.
이에 본 연구에서는 청미래덩굴 잎 물 추출물을 이용하여 HepG2세포에서의 GLUTs를 통한 포도당흡수 기전 연구 및 in vitro GK 활성 측정을 통해 포도당 대사에 미치는 영향을 평가하고 그 활용가능성을 제시하고자한다.

가설 설정

A: Effect of a Smilax china L. leaf extract (SCLE) on HNF-1α mRNA expression in HepG2 cells.
Measurement of GLUT-2, -4 mRNA expression. A: Effect of a Smilax china L. leaf extract (SCLE) treatment on GLUT-2 mRNA expression in HepG2 cells. B: Effect of SCLE treatment on GLUT-4 mRNA in HepG2 cells.
leaf extract (SCLE) treatment on GLUT-2 mRNA expression in HepG2 cells. B: Effect of SCLE treatment on GLUT-4 mRNA in HepG2 cells. Values are the Mean ± SD of triplicate determinations.
B: Effect of SCLE treatment on HNF-1α protein expression in HepG2 cells.

제안 방법

25 mg/ml)의 처리는 포도당에 의해 증가된 GLUT-2의 발현양을 통계적으로 유의하게 더욱 증가시켰다. 1 mM의 포도당 배지에서 SCLE의 처리는 GLUT-2의 mRNA 발현을 유도하지 못하였지만 5 mM, 25 mM 포도당 배지에서는 SCLE의 처리를 통해 각각 39%, 35%의 발현 증가를 유도하였다. GLUT-4는 인슐린 의존적으로 발현이 유도되며 조직특이성이 있지만 포도당은 GLUT-4의 발현을 강하게 자극 하지 못하는 것으로 알려져 있으며 몇몇 세포 또는 조직에서는 고농도의 포도당이 발현을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
2-4 본 실험에서는 청미래덩굴 잎물 추출물 (SCLE)을 이용하여 아직 시도된 적이 없는 포도당 흡수 기전 및 포도당 대사관련 연구를 수행하였다. 그 결과 SCLE의 처리가 HepG2 세포에서 인슐린 비의존적인 방법으로 glucose uptake를 유도한다는 것을 확인할 수 있었으며 이를 통해 SCLE가 인슐린 비의존적인 당뇨환자에게 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
40분 후, 1 μM의 인슐린과 SCLE (0.25 mg/ml)를 처리하여 20 분간 동안 더 배양한 다음 10 mM 2-deoxy-glucose를 20분간 처리하였다.
GLUT-2, GLUT-4 및 HNF-1α의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다.
Glucokinase 활성은 hexokinase colorimetric assay kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. Glucokinase 활성에 의해 생성된 glucose-6-phosphate (G6P)가 G6P dehydrogenase (G6PDH)와 반응할 때 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP⁺)가 NADPH로 환원되는 것을 이용하여 glucokinase 활성도를 측정하는 원리이다.
HepG2 세포를 6-well plates에 1 × 106 cells/ml로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 SCLE를 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 더 배양한 다음 lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.1 M EDTA, 10 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, protease inhibitor Cocktail)를 이용하여 4℃에서 용해시킨 후 원심분리 (14,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 얻은 단백질의 농도를 측정하였다.
6과 같다. MEK1/2와 histone H3 antibody로 cytosol과 nucleus 분획을 확인하였다. HNF-1α 단백질 발현을 확인한 결과 SCLE 처리군의 nucleus 분획에서 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
PCR tube에 Go Tag Green Master (Promega, Madison, WI, USA) 10 μl, forward primer (15 μM)와 reverse primer (15 μM)를 각각 0.5 μl, nuclease free water 8 μl, 합성한 first-stand cDNA 1 μl를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR를 실행하였으며 각각의 primer의 PCR조건은 Table 2와 같다.
5 μl, nuclease free water 8 μl, 합성한 first-stand cDNA 1 μl를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR를 실행하였으며 각각의 primer의 PCR조건은 Table 2와 같다. PCR 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가한 1.2% agarose gel에 100 V에서 30분간 전기영동 후 UV 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 imageJ (National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
SCLE에 의한 glucose uptake실험 결과를 바탕으로 포도당의 흡수증가가 어떻게 이루어지는지 확인하기 위해 간에서 주요 포도당 운반체로 기능하는 GLUT-2의 발현변화를 통해 확인하였다. 그 결과는 앞의 Fig.
그 후 GLUT-2 (200 : 1) 또는 HNF-1α (500 : 1) 1차 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)가 첨가된 buffer에서 1시간 동안 반응한 후 TBS-T (TBS containing 0.1% tween-20)로 5분간 3차례에 걸쳐 세척하였다.
24시간 후 배양중인 배지에 CCK-8 reagent를 10 μl씩 가해주고 3시간 동안 37℃에서 배양한 후 ELISA microplate reader (EL808; BioTek, Winooski, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 (control)의 흡광도 값을 기준으로 세포독성을 비교하였다.
시간에 따른 HNF-1α의 단백질발현 변화가 명확했던 N농도의 포도당 배지에서 0.25 mg/ml SCLE를 24시간 처리한 후 HepG2 세포를 cytosol과 nucleus로 분획하여 HNF-1α의 단백질발현을 확인한 결과 Fig. 6과 같다.
실험은 Bacillus stearothermophilus 유래의 glucokinase (Sigma, St. Louis, MO, USA) 1 unit과 SCLE (1 mg/ml)를 각각 50 μl씩 분주하여 혼합한 후 실온에서 20분 동안 incubation하였다.
5 × 10⁶ cells/ml로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 SCLE를 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 더 배양한 다음 4℃로 cooling된 PBS로 3회 세척한 후 scraper를 이용하여 세포를 harvesting한다. 원심분리(5,000 rpm, 5 min)를 통해 세포를 모은 후 cell fractionation kit (Cell signaling technology, Tokyo, Japan)의 사용방법에 따라 세포 분획을 진행하였다. 즉, 세포가 담긴 tube에 250 μl 의 cytoplasm isolation buffer를 넣고 5초 동안 vortexing한 후 ice에 5분 동안 정치한다.
청미래덩굴 잎 물 추출물 (SCLE)의 처리에 따른 HepG2 세포의 glucose uptake 변화는 glucose uptake colorimetric assay kit (Biovision, Milpitas, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 즉, HepG2 세포를 96-well plates에 1 × 10⁵ cells/ml로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 24시간 더 배양하였다.
추출한 RNA (2 μg)와 RNase free water로9 μl을 맞추고 70℃에서 5분간 반응시킨 후 2 × cDNA synthesis 완충용액 10 μl, cDNA synthsis Enzyme Mix 1 μl를 섞어 11 μl씩 각 PCR tube에 더한 후 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
HepG2 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Welgene, Daegu, Korea)과 1% penicillin-streptomycin (PEST, Welgene)이 첨가된 Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Life Technologies, CA, USA) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 필요에 따라 DMEM 배지의 포도당 농도는 1 mM, 5 mM, 25 mM로 각각 사용하였다.

대상 데이터

HepG2 세포 (hepatocellular carcinoma)는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. HepG2 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Welgene, Daegu, Korea)과 1% penicillin-streptomycin (PEST, Welgene)이 첨가된 Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Life Technologies, CA, USA) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.
HepG2 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Welgene, Daegu, Korea)과 1% penicillin-streptomycin (PEST, Welgene)이 첨가된 Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Life Technologies, CA, USA) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
그 밴드의 강도는 imageJ (National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다. 내부표준단백질은 actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 사용하였다.
실험에 이용된 청미래덩굴 잎은 경상남도 의령지역에서 채집하여 신흥묵교수 (동국대학교 한의과대학)에 의해 검수된 것을 사용하였으며, 건조 후 각각 마쇄한 뒤 무게 당 10배의 증류수를 가하여 60℃에서 24시간 교반하면서 유효성분을 추출하고 filter paper로 여과한 다음 감압 농축 후 동결건조 한 것을 시료로 사용하였다.

데이터처리

발색은 enhanced chemiluminescence method를 이용하여 x-ray 필름에 감광시켰다. 그 밴드의 강도는 imageJ (National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다. 내부표준단백질은 actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 사용하였다.
2% agarose gel에 100 V에서 30분간 전기영동 후 UV 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 imageJ (National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS (Statitical Package for Social Sciences) program을 이용하여 mean ± SD로 표시하였고, one-way ANOVA test 후 p ＜ 0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.

이론/모형

First strand cDNA를 합성하기 위하여 AmfiRiert Platinum cDNA snythesis Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 이용하였다. 추출한 RNA (2 μg)와 RNase free water로9 μl을 맞추고 70℃에서 5분간 반응시킨 후 2 × cDNA synthesis 완충용액 10 μl, cDNA synthsis Enzyme Mix 1 μl를 섞어 11 μl씩 각 PCR tube에 더한 후 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
그런 다음 membrane은 2차 anti-rabbit IgG conjugates horseradish peroxidase antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)가 첨가된 buffer를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응한 후 5분 단위로 3차례에 걸쳐 세척하였다. 발색은 enhanced chemiluminescence method를 이용하여 x-ray 필름에 감광시켰다. 그 밴드의 강도는 imageJ (National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
세포독성은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo laboratories, Kumamoto, Japan) assay를 통해 확인하였다. HepG2 cell을 96-well tissue culture plate에 1 × 10⁴cells/well로 100μl씩 분주하고 24시간 동안 배양한 후 FBS가 첨가되지 않은 배지에 SCLE를 농도별로 제조한 후 세포에 처리한 후 24시간 동안 37℃에서 배양 하였다.

성능/효과

20,21 SCLE의 처리에 의한 C/EBPβ의 발현 변화는 확인할 수 없었지만 (data not shown), HNF-1α의 mRNA 및 단백질 발현은 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
GLUT-4는 인슐린 의존적으로 발현이 유도되며 조직특이성이 있지만 포도당은 GLUT-4의 발현을 강하게 자극 하지 못하는 것으로 알려져 있으며 몇몇 세포 또는 조직에서는 고농도의 포도당이 발현을 감소시키는 것으로 알려져 있다.²⁶ 본 실험의 결과에서는 HepG2 세포에 포도당 농도를 증가시킬수록 GLUT-4의 발현이 증가하는 현상은 관찰되었으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었으며, SCLE의 처리에 의해서도 GLUT-4 mRNA의 발현은 증가하지 않았다. 인슐린 부재 상태에서 실험이 진행된 이유도 있겠지만, 이는 Fig.
7과 같은 결과를 확보하였다. Bacillus stearothermophilus 유래의 GK를 이용하여 활성을 측정한 결과 SCLE (0.25 mg/ml)에 의해 그 활성이 control 대비 약 3배 증가하는 것을 확인하였다.
Fig. 5A에서 HNF-1α의 mRNA 발현을 확인한 결과, N (5 mM)농도의 포도당에서 HNF-1α는 3~6시간에 0시간과 비교하여 약 20% 이상의 통계적으로 유의한 발현 증가를 확인할 수 있었으며 12시간 이후 0시간과 유사한 수준으로 발현이 감소함을 알 수 있었다.
Fig. 5B를 통해 HNF-1α의 단백질 발현을 확인한 결과 N농도의 포도당에서 HNF-1α는 24시간에 높은 발현을 보이다가 48시간에 0시간과 유사한 수준의 단백질 양으로 감소하는 것을 확인할 수 있었고 H농도의 포도당에서 HNF-1α는 N농도와 유사하게 24시간에 가장 높은 발현양을 보이다가 48시간에 소폭 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 GLUT-2는 췌장 β-cell에서 포도당 sensing을 통한 insulin의 분비를 유도하므로¹⁸ 이에 대한 연구 또한 필요할 것으로 판단된다. GLUT-2 mRNA 발현 확인 실험을 바탕으로 단백질 발현을 western blot으로 확인한 결과 SCLE의 처리에 의해 48시간 까지 안정적으로 GLUT-2단백질이 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 SCLE에 의해 증가된 mRNA가 안정적 으로 단백질 합성에 영향을 미쳤으며 GLUT-2가 배지 내에 존재하는 포도당의 운반에 지속적으로 작용을 하고 있음을 의미한다.
SCLE의 처리에 의해 HepG2 세포에서 GLUT-2의 발현이 증가한다는 것은 잠재적으로 간에서 GLUT-2의 발현을 유도하여 포도당의 흡수 및 이동에 도움을 줄 수 있다는 것을 의미하므로 그 활용이 기대되는 부분이다. GLUT-2 mRNA의 발현 증가에 있어서 L (1 mM) 농도의 포도당에서는 SCLE가 영향을 미치지 못하다가 N (5 mM) 또는 H (25 mM)의 포도당 농도에서 발현을 유도하는 결과가 확인되는데 이는 SCLE가 일정 농도 이상의 포도당 상태에서만 GLUT-2의 유전자 발현에 영향을 미치는 것을 의미한다. 이런 SCLE의 작용은 GLUT-2가 일정 농도 이상의 고농도 포도당상태에서 발현이 증가하여 활성을 갖는 특성^13,17을 도와주는 것으로 생각된다.
HNF-1α 단백질 발현을 확인한 결과 SCLE 처리군의 nucleus 분획에서 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
25 mg/ml SCLE을 처리한 결과 48시간까지 단백질의 양이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. N 농도의 포도당에서 SCLE의 처리 후 24시간에서 GLUT-2 단백질 발현양이 약 2.5배 증가한 것을 확인할 수 있었고 48시간에서 약 4배까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. H 농도의 포도당에서는 24~48시간까지 GLUT-2 단백질이 약 3배 증가한 것을 확인할 수 있었다.
SCLE 0.25 mg/ml을 처리하여 glucose uptake 활성변화를 실험한 결과 대조군과 비교하였을 때 인슐린을 처리하지 않은 군에서는 SCLE의 처리에 의해 52.28 ± 2.15 pmol에서 77.86 ± 3.62 pmol로 유의한 증가를 보였지만 인슐린을 처리한 군에서는 112 ± 4.12 pmol에서 108.21 ± 7.92 pmol로 SCLE의 처리가 통계적으로 유의성 있는 변화를 유도하지 않았다.
4와 같은 결과를 확인할 수 있었다. mRNA 발현에 영향을 미치지 못한 l (1 mM)을 제외하고 SCLE처리 효과가 관찰된 N (5 mM)과 H (25 mM)의 포도당 농도에서 0.25 mg/ml SCLE을 처리한 결과 48시간까지 단백질의 양이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. N 농도의 포도당에서 SCLE의 처리 후 24시간에서 GLUT-2 단백질 발현양이 약 2.
그 결과 HNF-1α, HNF-4α, FOXA2, SREBP-1c, C/EBPβ 등19이 보고되어 있음을 확인하였고 그 중 HNF-1α와 C/EBPβ가 human GLUT-2의 promoter에서 연구된 것을 확인할 수 있었다.
^2-4 본 실험에서는 청미래덩굴 잎물 추출물 (SCLE)을 이용하여 아직 시도된 적이 없는 포도당 흡수 기전 및 포도당 대사관련 연구를 수행하였다. 그 결과 SCLE의 처리가 HepG2 세포에서 인슐린 비의존적인 방법으로 glucose uptake를 유도한다는 것을 확인할 수 있었으며 이를 통해 SCLE가 인슐린 비의존적인 당뇨환자에게 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 아직 연구가 충분히 진행된 결과가 아니므로 추가적인 인슐린 비의존적 신호기전에 SCLE가 미치는 영향에 관한 연구와 인슐린 저항성이 유도된 실험 모델에서의 추가 검증이 필요할 것이다.
지금까지의 실험결과를 통해 SCLE가 HepG2 세포에서 glucose uptake를 유도하는 작용기전은 HNF-1α의 발현유도를 통한 GLUT-2의 증가에 의한 것임을 알 수 있었다. 그 다음으로 본 실험은 SCLE에 의해 유입된 세포내 포도당은 어떻게 처리되는지에 대한 연구를 GK 활성 측정을 통해 실험하였으며 그 결과 Fig. 7에서 설명한 바와 같이 SCLE가 직접적으로 GK의 활성을 촉진하여 포도당을 인산화 하는 것을 확인하였다. 이렇게 인산화된 포도당은 기존의 많은 연구결과에서 알려진 바와 같이 간에서 glycogen 또는 지방으로 합성 되어 저장되거나 에너지대사에 사용되어 소진되는 것을 예측할 수 있다.
그리고 H (25 mM)농도의 포도당에서 HNF-1α는 3시간 이후 지속적으로 유의한 수준의 증가된 발현양을 유지하는 것으로 관찰되었다.
또한 SCLE를 처리한 HepG2 세포의 nucleus 분획에서 HNF-1α 단백질의 발현증가가 뚜렷하게 확인되었다.
본 실험결과를 통해 HepG2 세포에서 SCLE의 처리에 의해 증가한 GLUT-2는 HNF-1α 단백질의 nucleus내 증가에 의한 것임을 유추할 수 있다.
GLUT-2의 발현이 포도당에 의해 유도된다는 것은 Nordlie 등¹⁷의 연구결과에서 보고된 바 있다. 본 실험에서도 L (1 mM), N (5 mM), H (25 mM)로 포도당의 농도를 증사시켰을 때 GLUT-2의 발현이 증가되는 것이 확인되 었으며 SCLE (0.25 mg/ml)의 처리는 포도당에 의해 증가된 GLUT-2의 발현양을 통계적으로 유의하게 더욱 증가시켰다. 1 mM의 포도당 배지에서 SCLE의 처리는 GLUT-2의 mRNA 발현을 유도하지 못하였지만 5 mM, 25 mM 포도당 배지에서는 SCLE의 처리를 통해 각각 39%, 35%의 발현 증가를 유도하였다.
본 연구를 통해 SCLE가 α-glucosidase inhibition 활성에 의한 혈당의 개선과 당뇨예방 효과뿐만 아니라 다양한 세포내 기전을 통해 혈당 및 당뇨의 개선을 유도할 수 있음을 확인하였고, 이는 SCLE가 neutraceuticals 소재로서의 개발가치가 높음을 시사한다.
또한 이런 포도당의 흡수는 HNF-1α라는 transcription factor의 활성화를 통해 GLUT-2의 발현을 증가시키기 때문인 것을 실험적으로 증명하였다. 뿐만 아니라 Bacillus stearothermophilus 유래의 GK를 이용하여 활성을 측정한 결과 SCLE가 직접적으로 GK를 활성화하여 포도당의 인산화에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었으며 그 실험결과들은 Fig. 8에서 도식화 하였다. 본 연구를 통해 SCLE가 α-glucosidase inhibition 활성에 의한 혈당의 개선과 당뇨예방 효과뿐만 아니라 다양한 세포내 기전을 통해 혈당 및 당뇨의 개선을 유도할 수 있음을 확인하였고, 이는 SCLE가 neutraceuticals 소재로서의 개발가치가 높음을 시사한다.
이를 통해 HNF-1α가 포도당 농도에 따라 유의하게 반응하는 유전자임을 확인할 수 있었다.
지금까지의 실험결과를 통해 SCLE가 HepG2 세포에서 glucose uptake를 유도하는 작용기전은 HNF-1α의 발현유도를 통한 GLUT-2의 증가에 의한 것임을 알 수 있었다.

후속연구

5 mg/ml, 1 mg/ml 농도에서 확인한 결과로 모든 농도에서 독성이 관찰되지 않았다. Glucose uptake는 2-deoxyglucose (2-DG)의 세포내 축적량을 측정함으로써 평가되는데, 유의한 효능이 나타나는 최소 농도를 테스트한 결과 (data not shown) 0.25 mg/ml에서 활성이 관찰되었으며 향후 포도당 흡수에 관련된 실험은 0.25 mg/ml에서 수행하였다. SCLE 0.
그 결과 SCLE의 처리가 HepG2 세포에서 인슐린 비의존적인 방법으로 glucose uptake를 유도한다는 것을 확인할 수 있었으며 이를 통해 SCLE가 인슐린 비의존적인 당뇨환자에게 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 아직 연구가 충분히 진행된 결과가 아니므로 추가적인 인슐린 비의존적 신호기전에 SCLE가 미치는 영향에 관한 연구와 인슐린 저항성이 유도된 실험 모델에서의 추가 검증이 필요할 것이다.
또한 GLUT-2는 췌장 β-cell에서 포도당 sensing을 통한 insulin의 분비를 유도하므로18 이에 대한 연구 또한 필요할 것으로 판단된다.
명확한 발현조절 기전을 확인하기 위해서는 SCLE처리에 의해 증가된 HNF-1α가 GLUT-2 promoter에 결합하는지에 대한 연구가 추가 되어야 하지만 본 실험을 통해 그 유기적인 발현조절 가능성이 제시되었으며 증가된 HNF-1α와 GLUT-2 promoter의 결합은 HNF-1α의 조절에 의한 GLUT-2 발현 변화에 대한 다수의 연구결과를 통해 예측이 가능한 것으로 판단된다.
본 실험의 결과들을 통해 SCLE가 HepG2 세포에서 포도당의 흡수를 돕고 대사작용을 유도하는 것을 확인함으로써 향후 당뇨의 예방 및 치료를 위해 활용이 가능한 잠재적 후보 소재임을 확인할 수 있었으며, 아직 안전성과 구체적인 작용기전에 대한 다양한 연구가 추가되어야 하지만 SCLE의 새로운 기능과 개발 가능성을 확인할 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	청미래덩굴이란 무엇인가?	청미래덩굴 (Smilax china L.)은 한국, 일본, 중국 등의 국가에서 널리 분포하는 백합과 (Liliaceae)의 덩굴성 갈잎떨기나무로 명감나무, 망개나무라고도 불린다. 5월에 황록색의 꽃이 피며 열매는 둥근 장과로 9~10월에 적색으로 익는다.
	청미래덩굴 잎 물 추출물에 의한 HepG2세포에 미치는 Glucose uptake 활성이 유의하게 나타나는 최소 농도는?	5 mg/ml, 1 mg/ml 농도에서 확인한 결과로 모든 농도에서 독성이 관찰되지 않았다. Glucose uptake는 2-deoxyglucose (2-DG)의 세포내 축적량을 측정함으로써 평가되는데, 유의한 효능이 나타나는 최소 농도를 테스트한 결과 (data not shown) 0.25 mg/ml에서 활성이 관찰되었으며 향후 포도당 흡수에 관련된 실험은 0.25 mg/ml에서 수행하였다.
	청미래덩굴 잎에 함유된 항균작용을 나타내는 성분은 무엇인가?	2 청미래덩굴 잎은 항균작용이 있어 민간에서는 망개떡 등에 사용되고 있다. 이들의 성분으로는 kaempferol-7-O-α-Lrhamnopyranoside과 kaempferol-3,7-O-α-L- dirhamnopyranoside 같은 flavonoid 계열 물질이 보고되었으며 항산화 활성과 함께 α-glucosidase inhibition 효과가 최근 본 연구그룹에 의해 보고되었다.3,4 그 외 청미래덩굴 뿌리를 이용한 혈당강하에 의한 항당뇨 효과가 Bhati 등5에 의해 보고된 바는 있으나 청미래덩굴 잎을 이용한 항당뇨 효능에 대한 구체적인 연구결과는 거의 알려지지 않았다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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