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문제 정의
- 특히 MAAs 중에 porphyra-334가 주요한 물질로 알려져 있다. 본 연구에서는 MAAs 중 대표적인 물질인 Porphyra-334을 분리정제 하고 이를 이용하여 UV에 의한 인간 피부세포 손상을 방지함으로 자연친화적인 자외선 차단용 화장품 소재로써 가능성을 연구하고자 하였다.
제안 방법
- HaCaT을 24well plate에 1X105개의 세포를 분주하여 배양하였다. 24시간 후 FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고 24시간동안 starvation하고, 시료를 농도별로 처리하였다. 그 후 UVA(330-340nm) 조사 (10mJ/cm2)하여 24시간동안 배양하였다.
- 의 UVB를 조사하여 염증을 유도하였다. 4시간동안 추가 배양한 후 FastLane cell one-step buffer set(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하고 이를 template으로 하여 2X Quantitect SYBR green RT-PCR master mix kit(Qiagen) 매뉴얼에 따라 Rotor gene Q real-time PCR machine(Qiagen)으로 진행하였다. 그 결과는 glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)의 gene 발현양으로 normalization 하였다.
- DPPH는 화학적으로 안정화 된 수용성 자유 라디칼로 이를 이용해 P334에 의한 라디칼 소거 능력을 측정하였다. Fig.
- 분리 정제한 P334의 자외선 흡수능을 통한 세포손상을 방지하는지를 확인하고자 MTT assay를 이용하여 실험하였다. HaCaT cell에 MAA 물질인 P334를 처리하고 UVA를 조사하여 cell viability를 확인하였다. Fig.
- HaCaT을 96 well plate에 5×104개의 세포를 분주하여 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 제거한 다음 DMEM 배지로 교환하고 시료를 농도별로 처리한 후 50mJ/cm2의 UVB를 조사하여 염증을 유도하였다.
- UV protection 효과를 보인 P334가 UV 조사에 의해 유도된 염증 관련 유전자인 COX-2의 발현에 어떠한 영향이 있는지 real-time PCR을 이용하여 mRNA level에서 확인하였다. Fig.
- 양성대조군으로 5µM hydrocortisone을 처리하였다. UVB를 조사하기 전에 P334를 농도별로 처리하여 UV protection에 의한 COX-2의 발현을 확인하였다. 그 결과 처리한 농도가 증가할수록 COX-2의 발현이 감소하는 경향을 보였다.
- 4시간동안 추가 배양한 후 FastLane cell one-step buffer set(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하고 이를 template으로 하여 2X Quantitect SYBR green RT-PCR master mix kit(Qiagen) 매뉴얼에 따라 Rotor gene Q real-time PCR machine(Qiagen)으로 진행하였다. 그 결과는 glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)의 gene 발현양으로 normalization 하였다. 양성대조군으로 hydrocortisone을 사용하였다.
- 는 BBM(Bold's Basal Medium)배지에서 온도 25℃, 광량 60 µE/m/s, 12:12 LD의 광주기로 배양하였고, 200 ～ 300ml의 접종으로 시작해서 3L, 10L, 20L까지 대량배양하고, Fig. 1의 과정을 거쳐 분리하고 정제하였다.
- Chlamydomonas hedleyi.로부터 분리정제 된 P334를 HPLC를 사용하여 순도를 높여 분리정제 하였다.
- Chlamydomonas hedleyi.로부터 자외선 흡수능을 지닌 추출 분획물을 분리정제하여, 피부세포에서 P334의자외선 흡수능에 의한 UV protection 효과를 연구하였다. 그 결과 인간 각질형성 세포주인 HaCaT cell에 P334를 전처리하고 UVA를 조사하였을 때 UV에 의해 발생되는 세포손상이 감소함을 확인하였다.
- 미세조류 Chlamydomonas hedleyi. 배양하여 분리정제한 P334를 ESI-MS/MS를 이용하여 확인하였다. Fig.
- 분리 정제한 P334의 자외선 흡수능을 통한 세포손상을 방지하는지를 확인하고자 MTT assay를 이용하여 실험하였다. HaCaT cell에 MAA 물질인 P334를 처리하고 UVA를 조사하여 cell viability를 확인하였다.
- 양성대조군으로 5µM hydrocortisone을 처리하였다.
- 1mg/ml 농도로 처리한 실험군에서 5µM hydrocortisone을 처리한 대조군만큼 현저하게 COX-2의 발현이 감소하였다. 이를 통해 P334에 의한 UV protection 효과를 확인하였다.
- 45µm membrane filter를 사용하여 필터하였다. 준비된 샘플은 AB SCIEX 3200 QTRAP MS/MS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 기기의 ESI-MS/MS system을 사용하여 positive mode에서 product ion(MS2) scan으로 분석하였다.
대상 데이터
- Waters 1525µ Binary HPLC pump, Waters 996 photodiode array detector를 사용하였고 분리정제를 위해 Gemini 5µ C18 110 A(5µm, 4.6 × 250nm, Phenomenex) column을 사용하였다.
- 6 × 250nm, Phenomenex) column을 사용하였다. 분석을 위한 용매는 0.1% trifluoroacetic acid(TFA)를 포함한 water(용매 A)와 acetonitrile(용매B)를 사용하였고 1ml/min의 유속으로 332nm 파장에서 검출하였다.
- 그 결과는 glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)의 gene 발현양으로 normalization 하였다. 양성대조군으로 hydrocortisone을 사용하였다. 실험에 사용한 primer는 Quantitect primer assays(Qiagen)를 사용하였다[11,16].
- spectrophotometer(Thermo)로 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 vitamin C(Sigma)를 사용하였다[13-15].
- 인간 각질형성 세포주(HaCaT, keratinocyte)를 DMEM, 10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic(GIBCO)의 배지에서 dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
이론/모형
- 양성대조군으로 hydrocortisone을 사용하였다. 실험에 사용한 primer는 Quantitect primer assays(Qiagen)를 사용하였다[11,16].
성능/효과
- HaCaT cell에 MAA 물질인 P334를 처리하고 UVA를 조사하여 cell viability를 확인하였다. Fig. 4의 결과를 보면 자외선 흡수능 가진 P334를 처리한 실험군이 대조군에 비해 cell viability가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 0.
- 5는 P334의 라디칼 소거능을 보여준다. P334의 농도가 높아질수록 라디칼 소거능이 증가함을 확인하였고, 0.1mg/ml의 농도에서는 60%정도의 라디칼 소거능을 보였다. 양성대조군인 0.
- 로부터 자외선 흡수능을 지닌 추출 분획물을 분리정제하여, 피부세포에서 P334의자외선 흡수능에 의한 UV protection 효과를 연구하였다. 그 결과 인간 각질형성 세포주인 HaCaT cell에 P334를 전처리하고 UVA를 조사하였을 때 UV에 의해 발생되는 세포손상이 감소함을 확인하였다. 특히 UV에 의해 유도되는 염증관련 유전자인 COX-2의 발현을 감소시킴으로 항염증효과를 관찰할 수 있었다.
- UVB를 조사하기 전에 P334를 농도별로 처리하여 UV protection에 의한 COX-2의 발현을 확인하였다. 그 결과 처리한 농도가 증가할수록 COX-2의 발현이 감소하는 경향을 보였다. 특히 0.
- 또한 미세조류로부터 분리정제한 수용추출물을 HPLC로 분석하여 P334의 retention time이 5.808분으로 나타났고, P334가 수용추출물의 주요한 MAA임을 확인하였다[Fig. 3].
- 특히 UV에 의해 유도되는 염증관련 유전자인 COX-2의 발현을 감소시킴으로 항염증효과를 관찰할 수 있었다. 또한 우수한 자유 라디칼 소거능을 보였다. 이러한 우수한 UV protection 효과를 보이는 미세조류 자원에서 추출한 P334를 활용하여 자외선 흡수능을 지닌 자연친화적이고 친환경적인 신소재 개발함으로 다양한 자외선 차단 제품 보급에 기여할 것이다.
- 1mg/ml의 농도로 P334을 처리한 실험 군에서 약 26% 정도 증가하였다. 이 결과를 통해 피부세포에서 P334에 의한 UV protection 효과가 있음을 확인하였다.
- 그 결과 인간 각질형성 세포주인 HaCaT cell에 P334를 전처리하고 UVA를 조사하였을 때 UV에 의해 발생되는 세포손상이 감소함을 확인하였다. 특히 UV에 의해 유도되는 염증관련 유전자인 COX-2의 발현을 감소시킴으로 항염증효과를 관찰할 수 있었다. 또한 우수한 자유 라디칼 소거능을 보였다.
후속연구
- 또한 우수한 자유 라디칼 소거능을 보였다. 이러한 우수한 UV protection 효과를 보이는 미세조류 자원에서 추출한 P334를 활용하여 자외선 흡수능을 지닌 자연친화적이고 친환경적인 신소재 개발함으로 다양한 자외선 차단 제품 보급에 기여할 것이다.
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