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문제 정의
- 약리적으로 부신 피질 호르몬 조절 작용, 항염증 및 항알레르기 작용, 소화계통에 대한 작용, 해독작용, 지질대사에 대한 영향, 실험성 황달에 대한 영향, 진해 작용, 진통 및 항경련 작용, 비뇨 생식기계통에 대한 영향, 항종양 작용 등이 있으며11), 감초에 대한 다양한 연구12-14)가 있어왔으나 감초 추출물 투여가 ovalbumin으로 유발된 마우스 알레르기성 천식에 미치는 영향에 대한 연구는 되어있지 않았다. 본 논문에서 저자는 ovalbumin (OVA)을 항원으로 유도한 기관지 천식 모델에서 감초의 투여가 bronchoaveloar lavage (BAL) 세포 수 변화와 폐조직의 조직학적 변화, 기도의 과민성 정도 및 폐 조직 내 사이토카인의 생성의 변화에 미치는 효과를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 100 μg의 OVA과 1 ㎎ Alum를 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) 0.2 ㎖에 혼합하여 복강내로 주사하였다.
- 2 ㎖에 혼합하여 복강내로 주사하였다. 1차 전신 감작(sensitization) 후, 15일째에 동일한 방법으로 2차 감작을 통해 면역 boosting을 유도 한 후, 5% OVA in PBS 20 ㎖를 분무하여 30분씩 22, 23, 24일에 3일 연속 흡입(Challenge)시켜 알러지성 천식을 유도하였다. 마지막 OVA을 분무한 24시간 후에 마우스를 분석하였다.
- OVA로 유도한 기관지 천식 모델에서 감초의 효과를 실험적으로 알아보기 위하여 기관지폐포세척액, 폐조직, 기도과민성, Th2 사이토카인의 생산 정도를 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 알레르기성 항원인 OVA에 특이적으로 작용한 T림프구들은 다수가 염증 부위인 폐조직으로 이동하여 Th-2 반응을 통하여 사이토카인을 생산하기 때문에 폐조직 내에서 발현되는 사이토카인양을 조사하였다17-8). T 세포의 체액성 면역을 유도하는 사이토카인으로 알려진 IL-4와, 혈관투과성을 증가시켜 호산성백혈구의 기관지 및 폐조직 내로 침윤을 증가시키고 점액을 생산하는 배상세포를 증가시키는 사이토카인인 IL-1319)을 mRNA 레벨에서 확인하였다(Fig. 5). IL-4는 대조군에서 정상군에 비하여 확연하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 실험군인 GUF 150 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏에서 농도 의존적으로 유의하게 억제되었다.
- mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위하여 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA 1㎕, Real time PCR master mix 4 ㎕ (Roche), primer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응시켰다.
- 감초 추출물을 얻기 위하여 감초 100g에 증류수 1ℓ를 가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하여 얻는 액을 흡입 여과한 후 얼렸고, 이를 다시 동결건조기(Freeze dryerm EYELA FDU-540, Japan)를 이용하여 완전 건조한 감초분말을 냉동(-80 ℃) 보관하면서 3차 증류수에 녹여 filter (0.2 ㎛ syringe filter)로 여과 한 후 필요한 농도로 사용하였다.
- 광학현미경×400 배율에서 관찰하여 단핵구(monocyte), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil), 림프구(lymphocyte) 등의 총 세포 수를 측정하였다.
- 기관지 천식 유발 마우스에 GUF의 투여가 폐조직의 변화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 OVA 마지막 24시간 후에 폐조직을 H&E 염색해 관찰하였다(Fig. 3).
- . 대조군과 실험군의 염증성 세포 수의 변화를 비교하기 위하여 OVA 마지막 분무 24시간 후 마우스의 BALF을 수거하여 세포의 수를 측정하였다. 그 결과 BALF 내 전체 세포수는 대조군에 비하여 실험군(GUF 150, 300 ㎎/㎏)에서 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 마우스에서 폐조직을 떼어내어 10% 포르말린에 고정시키고, 파라핀으로 embedding 한 후 4 ㎛ 두께로 조직을 잘라 슬라이드에 붙인뒤 Hematoxylin/eosin (H&E) 염색하여 ×400 배율로 관찰하였다.
- 1차 전신 감작(sensitization) 후, 15일째에 동일한 방법으로 2차 감작을 통해 면역 boosting을 유도 한 후, 5% OVA in PBS 20 ㎖를 분무하여 30분씩 22, 23, 24일에 3일 연속 흡입(Challenge)시켜 알러지성 천식을 유도하였다. 마지막 OVA을 분무한 24시간 후에 마우스를 분석하였다.
- 의 방법을 약간 변형하였다. 마지막 분무 24시간 후, methacholine(Sigma, USA)을 PBS로 희석하여 2.5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 20 ㎎/㎖, 및 50 ㎎/㎖의 농도로 각각 5분간 분무하여 노출시킨 후 동물용 체적 변동 측정기를 사용하여 Penh (enhanced pause) 값을 5초 간격으로 3분간 측정하여 평균을 대표값으로 취하였다.
- 본 연구에서 저자는 감초의 알레르기성 기관지 천식에 대한 효과를 알아보기 위하여 마우스 천식 모델을 이용하여, Balb/c 마우스에 ovalbumin으로 알레르기성 천식을 유발한 후 기관지폐포세척액(BALF)에 존재하는 총 세포수와 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil), 단핵구(monocyte), 림프구(lymphocyte)의 세포수를 측정하였다. 천식모델에서 BAL 세포를 연구하는 것은 천식 병리기전에 있어서 중요한 연구 방법으로 여겨지고 있으며, 다른 염증매개인자들을 제외하더라도 OVA로 유발된 이들 염증매개인자들은 BAL 세포에서 분비된다.
- 실험은 6마리를 한 군으로 하여 정상군 (control group, Con), 대조군 (positive group, OVA; 천식 유발군), 실험군으로 나누었으며, 실험군은 GUF 150㎎/㎏ group (천식 유발 후 GUF 150 ㎎/㎏ 투여군), GUF 300 ㎎/㎏ group (천식 유발 후 GUF 300 ㎎/㎏ 투여군)으로 나누었다. 정상군은 아무런 처치를 하지 않았고, 실험군은 분석 전 1주일간 (18-24일) GUF를 경구 투여하였으며, 대조군은 실험군과 같은 시간에 같은 양의 생리식염수를 투여하였다(Fig.
- 건조된 슬라이드는 Diff-Quick 용액을 이용하여 염색하였다. 이 슬라이드로부터 세포의 모양과 염색을 특징으로 면역세포의 type을 결정하였다. 광학현미경×400 배율에서 관찰하여 단핵구(monocyte), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil), 림프구(lymphocyte) 등의 총 세포 수를 측정하였다.
- 실험은 6마리를 한 군으로 하여 정상군 (control group, Con), 대조군 (positive group, OVA; 천식 유발군), 실험군으로 나누었으며, 실험군은 GUF 150㎎/㎏ group (천식 유발 후 GUF 150 ㎎/㎏ 투여군), GUF 300 ㎎/㎏ group (천식 유발 후 GUF 300 ㎎/㎏ 투여군)으로 나누었다. 정상군은 아무런 처치를 하지 않았고, 실험군은 분석 전 1주일간 (18-24일) GUF를 경구 투여하였으며, 대조군은 실험군과 같은 시간에 같은 양의 생리식염수를 투여하였다(Fig. 1).
- mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위하여 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA 1㎕, Real time PCR master mix 4 ㎕ (Roche), primer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응시켰다.
대상 데이터
- /c 생쥐를 (주)오리엔트바이오(성남, 한국)에서 공급받아 실험 당일까지 고형사료와 물을 충분히 공급하고, 실온 22±2 ℃를 유지하였다.
- 본 실험에 사용된 시약은 난알부민 (OVA, chicken egg ovalbumin, Grade Ⅴ)는 Sigma(St. Louis, USA)에서, Alum (Aluminium potassium sulfate)은 Pierce(Rockford, IL, USA)에서, Diff-Quik Kit는 Green Cross(Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 실험동물은 6주령된 암컷 Balb./c 생쥐를 (주)오리엔트바이오(성남, 한국)에서 공급받아 실험 당일까지 고형사료와 물을 충분히 공급하고, 실온 22±2 ℃를 유지하였다.
- 실험에 사용된 감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch. GUF)는 옴니허브(영천, 한국)에서 구입하여 oo대학교 한의과대학 oo학 교실에서 정선하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계적 처리는 SPSS(ver. 8.0)를 이용하였으며, 기술통계학적 분석을 통해 각 집단간의 유의성은 ANOVA test 방법으로 분석하였으며, 그 값이 0.05 이하일 경우 유의 수준으로 인정하였다. 실험치의 표현은 평균±표준편차 (mean±SD)로 하였다.
- 실험치의 표현은 평균±표준편차 (mean±SD)로 하였다.
성능/효과
- 1. 감초는 기관지폐포세척액에서 총 세포수와 호산구의 생성을 유의하게 억제하였다.
- 5 ㎎/㎖의 methacholine 농도에 노출시켰을 때는 모든 군에서 비슷한 정도의 Penh 값을 보였다. 10㎎/㎖ 이상의 농도부터는 대조군의 Penh 값이 가장 높게 나왔고, 정상군의 Penh 값이 가장 낮았으며, 실험군의 Penh 값은 150 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏ 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 2. 감초는 폐조직에서 기도협착과 기도 벽의 두께, 염증세포의 침윤을 유의하게 억제하였다.
- 3. 감초는 기도과민성을 유의하게 억제하였다.
- 4. 감초는 폐조직 내의 IL-4, IL-13의 생성을 유의하게 감소시켰다.
- 현재까지 연구결과에 의하면 호산구는 천식에서 기도염증을 일으키는데 가장 중요한 역할을 담당하는 세포이며, Th2 세포에 의해 매개되는 염증 및 IL-13을 활성화시켜 천식발생에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다23-5). BAL 세포 측정 후총 세포수와 호산구 세포수의 변화를 확인한 결과 감초 150, 300 ㎎/㎏를 처리하였을 때 대조군에 비해 유의성 있게 총 세포수와 호산구의 증식이 억제되었다. 이는 감초가 호산구 증식의 억제를 통하여 천식 억제에 유의한 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 3B). GUF 150, 300 ㎎/㎏ 군에서는 기도의 협착과 기도벽의 두께가 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3C, 3D). 폐조직 내의 염증 수준을 양적분석방법을 통하여 평가한 결과 정상군에 비해 대조군의 염증정도가 확연하게 증가하였으며, 실험군에서 GUF 농도에 따라 농도 의존적으로 폐의 염증이 감소하였다(Fig.
- IL-4는 대조군에서 정상군에 비하여 확연하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 실험군인 GUF 150 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏에서 농도 의존적으로 유의하게 억제되었다. IL-13 또한 IL-4와 마찬가지로 대조군에 비해 실험군인 GUF 150 ㎎/㎏, 300㎎/㎏에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 5). IL-4는 대조군에서 정상군에 비하여 확연하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 실험군인 GUF 150 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏에서 농도 의존적으로 유의하게 억제되었다. IL-13 또한 IL-4와 마찬가지로 대조군에 비해 실험군인 GUF 150 ㎎/㎏, 300㎎/㎏에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 4). 각 그룹간의 차이를 조사한 결과 0 ㎎/㎖, 2.5 ㎎/㎖의 methacholine 농도에 노출시켰을 때는 모든 군에서 비슷한 정도의 Penh 값을 보였다. 10㎎/㎖ 이상의 농도부터는 대조군의 Penh 값이 가장 높게 나왔고, 정상군의 Penh 값이 가장 낮았으며, 실험군의 Penh 값은 150 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏ 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 기관지 과민반응은 폐의 조직학적 검사에서 기관지의 수축과 함께 염증세포의 침착을 수반하게 된다. 감초가 이에 미치는 효과를 확인하기위하여 폐조직의 조직학적 검사를 통하여 기도벽의 두께와 염증세포의 침윤정도, 기관지의 수축 정도를 확인한 결과 대조군에서 기도의 협착과 기도 벽의 두께가 증가하였으며, 염증세포의 침착이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 실험군인 감초 150, 300 ㎎/㎏를 처리하였을 때 대조군에 비해 기도의 협착과 기도벽의 두께, 염증세포의 침착정도도 유의성 있게 감소하였다(Fig.
- 대조군과 실험군의 염증성 세포 수의 변화를 비교하기 위하여 OVA 마지막 분무 24시간 후 마우스의 BALF을 수거하여 세포의 수를 측정하였다. 그 결과 BALF 내 전체 세포수는 대조군에 비하여 실험군(GUF 150, 300 ㎎/㎏)에서 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 또한 염증 조직으로 모여든 CD4+ helper T cell은 항원에 의해 활성화되어 IL-4를 생산하며, IL-4는 B림프구의 IgE 생성에 필수적인 신호를 전달한다27). 따라서 감초 경구투여가 폐조직 내의 사이토카인의 생성에 양적 변화를 초래하는지 확인한 결과, OVA으로 천식을 유발한 대조군에서 IL-4, IL-13의 생산이 증가되었으나, 감초 150, 300 ㎎/㎏에서 IL-4, IL-13의 생산이 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- 따라서 본 실험에서 감초 경구투여로 Th2 세포에서 주로 생산되는 사이토카인인 IL-4, IL-13의 생산을 폐조직 내에서 유의하게 억제하였기 때문에 감초가 Th1 사이토카인인 INF-γ의 생성을 증가시켜 INF-γ에 의해서 IL-4, IL-13의 생성을 억제했을 가능성이 있다.
- 3). 또한 기관지 천식의 특징적인 증상인 기도과민성을 측정하는 Penh 값에서 대조군은 정상군에 비해 심한 기도수축이 나타났으나, 실험군인 감초 경구 투여군에서는 농도 의존적인 억제효과를 보였다(Fig. 4). 이와 같은 결과로 보아 감초가 기의 평활근 증식을 억제하여 기도 두께를 감소했을 가능성이 있고, 또한 호산구나 염증성세포의 기관지로 유입, 침윤을 막음으로서 기도과민성을 줄일 수 있었을 것으로 사료된다.
- 감초가 이에 미치는 효과를 확인하기위하여 폐조직의 조직학적 검사를 통하여 기도벽의 두께와 염증세포의 침윤정도, 기관지의 수축 정도를 확인한 결과 대조군에서 기도의 협착과 기도 벽의 두께가 증가하였으며, 염증세포의 침착이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 실험군인 감초 150, 300 ㎎/㎏를 처리하였을 때 대조군에 비해 기도의 협착과 기도벽의 두께, 염증세포의 침착정도도 유의성 있게 감소하였다(Fig. 3). 또한 기관지 천식의 특징적인 증상인 기도과민성을 측정하는 Penh 값에서 대조군은 정상군에 비해 심한 기도수축이 나타났으나, 실험군인 감초 경구 투여군에서는 농도 의존적인 억제효과를 보였다(Fig.
- 알레르기성 과민반응에 의해 나타나는 기도과민성의 변화를 확인하기 위하여 정상군, 대조군과 실험군에 methacholine을 농도별로 노출시켜 그에 대한 기도저항값 (Penh)을 조사한 결과 methacholine의 농도가 높을수록 Penh값이 상승하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 각 그룹간의 차이를 조사한 결과 0 ㎎/㎖, 2.
- BAL 세포 측정 후총 세포수와 호산구 세포수의 변화를 확인한 결과 감초 150, 300 ㎎/㎏를 처리하였을 때 대조군에 비해 유의성 있게 총 세포수와 호산구의 증식이 억제되었다. 이는 감초가 호산구 증식의 억제를 통하여 천식 억제에 유의한 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 이상의 결과, 감초가 Th2 세포의 분화 억제 및 호산구의 활성화, 증식 억제에 의하여 천식억제 효과를 보인 것으로 사료된다.
- 4). 이와 같은 결과로 보아 감초가 기의 평활근 증식을 억제하여 기도 두께를 감소했을 가능성이 있고, 또한 호산구나 염증성세포의 기관지로 유입, 침윤을 막음으로서 기도과민성을 줄일 수 있었을 것으로 사료된다.
- 3C, 3D). 폐조직 내의 염증 수준을 양적분석방법을 통하여 평가한 결과 정상군에 비해 대조군의 염증정도가 확연하게 증가하였으며, 실험군에서 GUF 농도에 따라 농도 의존적으로 폐의 염증이 감소하였다(Fig. 3E).
후속연구
- 이상의 결과는 감초가 알레르기성 기관지 천식 억제에 유효하다는 것을 확인 할 수 있었으며, 향후 이에 대한 지속적인 연구와 활용이 필요하리라 사료된다.
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