[논문]LC-MS/MS를 이용한 당귀수산 추출물 중 17종 성분의 함량분석

서창섭; 신현규

LC-MS/MS를 이용한 당귀수산 추출물 중 17종 성분의 함량분석
Quantitative Analysis of the Seventeen Marker Components in Dangguisu-san Using Ultra-performance Liquid Chromatography Coupled to Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.58 no.3, 2014년, pp.158 - 164

서창섭 (한국한의학연구원 한약방제연구그룹) , 신현규 (한국한의학연구원 한약방제연구그룹)

Abstract ▼ AI-Helper

Dangguisu-san is a well-known traditional Korean herbal medicine prescription and has been widely used to treat ecchymosis, blood stagnation, and pain resulting from physical shock in Korea. In this study, an ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometer method was established for the simultaneous determination of the 17 biomarker components in Dangguisu-san. All analytes were separated on an UPLC BEH $C_{18}$ ($100{\times}2.1$ mm, $1.7{\mu}m$) column and maintained at $45^{\circ}C$. The mobile phase consisted of two solvent systems, 0.1% (v/v) formic acid in water (A) and acetonitrile (B) by gradient flow. The injection volume was $2.0{\mu}l$ and the flow rate was 0.3 ml/min with detection at mass spectrometer. Calibration curves of the 17 biomarker components were acquired with $r^2$ values ${\geq}0.9951$. The values of limit of detection and quantification of all analytes were 0.02~6.32 ng/ml and 0.05~18.95 ng/ml, respectively. The amounts of the 17 components in Dangguisu-san sample were $3.17{\sim}13,224.50{\mu}g/g$.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 한약제제의 품질관리에 기초 자료를 제공하고자 한의학에서 타박상으로 인한 혈액의 응결에 널리 사용되는 당귀수산을 선정하여 구성 성분에 대한 분석을 실시하였다.⁵⁾ 본 처방의 구성 약재 중 nodakenin(당귀), albiflorin과 paeoniflorin(적작약), boldine과 norisoboldine(오약), nootkatone(향부자), juglone과 brazilin(소목), safflomin A와 sophoricoside(홍화), amygdalin(도인), coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde(계피) 및 liquiritin, liquiritigenine 및 glycyrrhizin(감초) 등 17종의 성분을 대상으로 electrospray ionization(ESI) 방식의 질량분석기가 결합된 초고성능 액체크로 마토그래피(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometer; UPLC-MS)를 이용하여 분석함으로써 한약 처방의 품질관리에 대한 기초 자료를 제공하고자 본 연구를 실시하였다.
이 와 같이 한약 처방에 대한 실험적 효능과 임상적 증례보고는 다수 발표가 되었지만 품질관리를 위한 분석에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 한약제제의 품질관리에 기초 자료를 제공하고자 한의학에서 타박상으로 인한 혈액의 응결에 널리 사용되는 당귀수산을 선정하여 구성 성분에 대한 분석을 실시하였다.⁵⁾ 본 처방의 구성 약재 중 nodakenin(당귀), albiflorin과 paeoniflorin(적작약), boldine과 norisoboldine(오약), nootkatone(향부자), juglone과 brazilin(소목), safflomin A와 sophoricoside(홍화), amygdalin(도인), coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde(계피) 및 liquiritin, liquiritigenine 및 glycyrrhizin(감초) 등 17종의 성분을 대상으로 electrospray ionization(ESI) 방식의 질량분석기가 결합된 초고성능 액체크로 마토그래피(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometer; UPLC-MS)를 이용하여 분석함으로써 한약 처방의 품질관리에 대한 기초 자료를 제공하고자 본 연구를 실시하였다.

제안 방법

17종의 표준품에 대한 검량선은 10, 50, 100 및 500 ng/ml의 농도로 작성하였으며, 작성된 검량선의 직선성은 상관계수(r²)를 구하여 판단하였다. 검출한계와 정량한계는 신호 대 잡음비인 3과 10으로 계산하였다.
4 g의 추출물을 얻었다. LC-MS/MS 정량분석을 위해 동결 건조된 당귀수산 물 추출물 100 mg을 정확히 취한 후 물을 넣어 5ml로 맞춘 후 5분간 초음파 추출하였다. 그 후 추출액 100 µl를 물을 이용하여 10 ml로 100배 희석한 후 0.
당귀, 적작약, 오약, 향부자, 소목, 홍화, 도인, 계피 및 감초 등 9종의 생약으로 구성된 당귀수산에서 17종 성분에 대하여 LCMS/MS를 이용한 함량분석을 실시하였다. 분석 결과 소목, 홍화, 적작약, 도인, 감초, 당귀 및 계지의 주요 성분인 safflomin A, paeoniflorin, albiflroin, amygdalin, glycyrrhizin, liquiritin, nodakenin 및 cinnamaldehyde 등이 다른 성분에 비해 다량 함유되어 있음을 확인하였다.
당귀수산 물 추출물을 확립된 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 17종의 성분에 대한 함량 분석을 실시하였다. Table III과 Fig.
당귀수산의 구성한약재를 Table I과 같이 무게 비율로 배합 (5.0 kg; 130.375 g×164.6)하여 초고속진공저온농축추출기 (Cosmos 660, Inchon, Korea)에 넣고, 물을 시료의 10배(50 l)로 첨가하여 100℃에서 1 kgf/cm2 압력하에서 2시간 전탕 한 후 표준체(No. 270, 53 µm, Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 이용하여 여과한 후 동결건조기(PVTFD100R, IlShinBioBase, Dongduchun, Korea)를 사용하여 동결 건조하였다.
0 µl였다. 또한 함량 분석은 ACQUITY TQD MS를 사용하여 양이온과 음이온 모드에서 검출하였다. 최적의 검출을 위해 Table II와 같이 capillary voltage(3.
성분의 분리를 위한 UPLC는 Waters사의 ESI 소스의 질량분석기가 결합된 ACQUITY UPLC를 사용하였다. 17종 성분은 ACQUITY UPLC BEH C₁₈(2.
확립 당귀수산의 구성 생약의 주요 성분, boldine, norisoboldine,safflomin A, amygdalin, brazilin, paeoniflorin, albiflorin, liquiritin, nodakenin, sophoricoside, liquiritigenin, coumarin, cinnamic acid, juglone, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 nootkatone 등 17종에 대하여 ACQUITY TQD LC-MS/MS를 이용하여 정확성과 감도가 우수한 ESI 방법의 MRM 방법으로 함량분석을 실시하였다. 이동상으로는 물(A)과 아세토나이트릴 (B)을 사용하여 성분의 분리 및 검출을 실시하였으며, tailing과 이온의 검출 감도를 높이고자 0.1%(v/v) 개미산을 추가하여 분석을 실시하였다. 이러한 조건을 토대로 주요 성분에 대한 분석을 실시한 결과 17종의 성분 중 10종은 양이온 모드에서 7종은 음이온 모드에서 10분 이내로 검출하였다(Table III 및 Fig.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 함량분석을 위한 UPLC는 pump, degasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 ACQUITY UPLC(Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 질량분석기는 ESI source가 장착된 탠덤 사중극자 질량분석기 (ACQUITY TQD LC-MS/MS, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 데이터의 수집과 처리는 Waters MassLynx software(version 4.
확립 당귀수산의 구성 생약의 주요 성분, boldine, norisoboldine,safflomin A, amygdalin, brazilin, paeoniflorin, albiflorin, liquiritin, nodakenin, sophoricoside, liquiritigenin, coumarin, cinnamic acid, juglone, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 nootkatone 등 17종에 대하여 ACQUITY TQD LC-MS/MS를 이용하여 정확성과 감도가 우수한 ESI 방법의 MRM 방법으로 함량분석을 실시하였다. 이동상으로는 물(A)과 아세토나이트릴 (B)을 사용하여 성분의 분리 및 검출을 실시하였으며, tailing과 이온의 검출 감도를 높이고자 0.
확립된 LC-MS/MS 분석 방법에 의해 당귀수산의 주요 성분에 대한 피크 확인을 실시하였다. 그 결과 boldine, norisoboldine, albiflorin, nodakenin, liquiritigenin, coumarin, cinnamic acid, juglone, cinnamaldehyde 및 nootkatone이 m/z 328.

대상 데이터

또한 nodakenin(9)은 NPC Bio Technology(Yeongi, Korea), norisoboldine(2), brazilin(5) 및 liquiritigenin(11)은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.(Chengdu, China) 및 safflomin A(3)와 sophoricoside(10)는 ChemFaces (Wuhan, China)로부터 각각 구입하여 사용하였다. 이들 표준물질의 순도는 모두 98% 이상이었다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, paeoniflorin(6), albiflorin(7), liquiritin(8), cinnamaldehyde(15), glycyrrhizin(16) 및 nootkatone(17)은 Wako Pure Chemical Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 또한 nodakenin(9)은 NPC Bio Technology(Yeongi, Korea), norisoboldine(2), brazilin(5) 및 liquiritigenin(11)은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.
이들 표준물질의 순도는 모두 98% 이상이었다. LC-MS 분석을 위한 물, 아세토나이트릴 및 물은 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 개미산은 특급시약으로 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 함량분석을 위한 UPLC는 pump, degasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 ACQUITY UPLC(Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 질량분석기는 ESI source가 장착된 탠덤 사중극자 질량분석기 (ACQUITY TQD LC-MS/MS, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다.
Table I과 같이 본 실험에 사용된 당귀수산을 구성하는 9종의 구성 생약은 모두 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 규격품을 구입하여 전문가로부터 감정 후 사용하였다. 당귀수산 구성 생약들의 표본(2012-KE33-1~KE33-9)은 한국한의학연구원 한약방제 연구그룹에 보관하였다.
본 연구는 한국한의학연구원에서 지원하는 '한약 처방의 과학적 근거 기반 구축사업 (K14030)'에 의해 수행되었으며 이에 감사드린다.
1, Milford, MA, USA)를 사용하였다. 시료 추출을 위해 경서기계산업의 초고속진공저온농축추출기(Cosmos 660, Inchon, Korea)를 사용하였다.
표준물질인 boldine(1), amygdalin(4), coumarin(12), cinnamic acid(13) 및 juglone(14)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, paeoniflorin(6), albiflorin(7), liquiritin(8), cinnamaldehyde(15), glycyrrhizin(16) 및 nootkatone(17)은 Wako Pure Chemical Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였다.

이론/모형

또한 함량 분석은 ACQUITY TQD MS를 사용하여 양이온과 음이온 모드에서 검출하였다. 최적의 검출을 위해 Table II와 같이 capillary voltage(3.3 kV), extract voltage(3 V), source temperature(120℃), RF lens(0.3 V), desolvation temperature(300℃), desolvation gas(600 l/h), cone gas(50 l/h) 및 collision gas(0.14 ml/min) 등의 파라미터와 각 성분의 precursor ion, product ion, cone voltage 및 collision energy 등에 대한 최적의 조건을 설정하여 다중반응탐색법(multiple reaction monitoring; MRM) 모드를 적용하여 정량을 실시하였다(Table III).

성능/효과

따라서 한약 처방은 여러 약재와 성분의 상호작용으로 다양한 질환들의 치료 또는 예방을 위해 사용되어 왔다.^1,2)이러한 한약 처방 중 하나인 당귀수산은 明代李³⁾의 「醫學入門」에 처음 수록된 처방으로 당귀(Angelica gigas), 적작약(Paeonia obovata), 오약(Lindera strichnifolia), 향부자(Cyperus rotundus), 소목(Caesalpina sappan), 홍화(Carthamus tinctorius), 도인(Prunus persica), 계피(Cinnamomum cassia) 및 감초(Glycyrrhiza uralensis) 등 9종의 생약으로 구성되어 있으며, 破瘀行氣溫經之劑로 氣血의 循環을 도우며 祛瘀하는 효능이 있어 打撲이나 落傷 등으로 전신 또는 국소에 血栓이나 血管鬱血이 생겨서 아프고 복부팽만감이 있을 때 사용되었다.^4,5) 본 처방의 실험적 연구로 항염증,⁶⁾ 초기 골절에 의한 골결합,⁷⁾피하혈종,⁸⁾항혈전⁹⁾ 및 뇌허혈 개선¹⁰⁾ 효과 등이 보고되었다.
LC-MS/MS를 이용하여 ESI 방법의 MRM 방식에서 17종 성분의 농도에 따른 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성한 결과 Table IV와 같이 상관 계수(r²) 값이 0.9951 이상으로 양호한 직선성을 보여주었다. 또한 검출한계와 정량한계는 0.
당귀수산 물 추출물을 확립된 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 17종의 성분에 대한 함량 분석을 실시하였다. Table III과 Fig. 2에서 보듯이 boldine, norisoboldine, safflomin A, amygdalin, brazilin, paeoniflorin, albiflorin, liquiritin, nodakenin, sophoricoside, liquiritigenin, coumarin, cinnamic acid, juglone, cinnamaldehyde, glycyrrhizin 및 nootkatone 등 17종의 성분들은 0.82, 0.82, 1.01, 1.17, 1.32, 1.39, 1.40, 1.65, 1.85, 1.99, 2.99, 3.06, 3.74, 4.23, 4.42, 5.20 및 8.64분에서 검출되었다. LC-MS/MS에서 정량분석을 위하여 모든 성분에 대한 precursor ion과 product ion 설정은 다음과 같다.
270, 53 µm, Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 이용하여 여과한 후 동결건조기(PVTFD100R, IlShinBioBase, Dongduchun, Korea)를 사용하여 동결 건조하였다. 그 결과 16.9%의 수율인 845.4 g의 추출물을 얻었다. LC-MS/MS 정량분석을 위해 동결 건조된 당귀수산 물 추출물 100 mg을 정확히 취한 후 물을 넣어 5ml로 맞춘 후 5분간 초음파 추출하였다.
그 결과 boldine, norisoboldine, albiflorin, nodakenin, liquiritigenin, coumarin, cinnamic acid, juglone, cinnamaldehyde 및 nootkatone이 m/z 328.3, 314.3, 481.4, 409.4, 257.2, 147.1, 149.1, 175.1, 133.1 및 219.2에서 [M+H]+ 형태의 분자이온 피크를 확인하였으며, safflomin A, amygdalin, brazilin, paeoniflorin, liquiritin, sophoricoside 및 glycyrrhizin은 m/z 611.5, 456.4, 285.2, 479.4, 417.4, 431.3 및 821.9에서 [M-H]− 형태의 분자이온 피크를 각각 확인하였다(Table III).
그 결과 당귀수산 추출물 중 17종의 물질에 대한 함량은 3.17~ 13,224.50 µg/g으로 검출이 되었다(Table V).
그 중 소목의 주요 성분인 brazilin이 가장 많은 13,224.50 µg/g으로 검출이 되었으며, 홍화, 적작약 및 도인의 주요 성분인 safflomin A, paeoniflorin 및 amygdalin 등도 각각 8,556.17, 5,262.17 및 5,091.17 µg/g로 다른 성분들에 비하여 다량으로 함유되어 있었다.
당귀, 적작약, 오약, 향부자, 소목, 홍화, 도인, 계피 및 감초 등 9종의 생약으로 구성된 당귀수산에서 17종 성분에 대하여 LCMS/MS를 이용한 함량분석을 실시하였다. 분석 결과 소목, 홍화, 적작약, 도인, 감초, 당귀 및 계지의 주요 성분인 safflomin A, paeoniflorin, albiflroin, amygdalin, glycyrrhizin, liquiritin, nodakenin 및 cinnamaldehyde 등이 다른 성분에 비해 다량 함유되어 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 당귀수산의 품질관리를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
1%(v/v) 개미산을 추가하여 분석을 실시하였다. 이러한 조건을 토대로 주요 성분에 대한 분석을 실시한 결과 17종의 성분 중 10종은 양이온 모드에서 7종은 음이온 모드에서 10분 이내로 검출하였다(Table III 및 Fig. 2).

후속연구

분석 결과 소목, 홍화, 적작약, 도인, 감초, 당귀 및 계지의 주요 성분인 safflomin A, paeoniflorin, albiflroin, amygdalin, glycyrrhizin, liquiritin, nodakenin 및 cinnamaldehyde 등이 다른 성분에 비해 다량 함유되어 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 당귀수산의 품질관리를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	당귀수산은 어떤 증상에 처방되는가?	따라서 한약 처방은 여러 약재와 성분의 상호작용으로 다양한 질환들의 치료 또는 예방을 위해 사용되어 왔다. 1,2) 이러한 한약 처방 중 하나인 당귀수산은 明代李3)의「醫學入門」에 처음 수록된 처방으로 당귀(Angelica gigas), 적작약(Paeonia obovata), 오약(Lindera strichnifolia), 향부자(Cyperus rotundus), 소목(Caesalpina sappan), 홍화(Carthamus tinctorius), 도인(Prunus persica), 계피 (Cinnamomum cassia) 및 감초(Glycyrrhiza uralensis) 등 9종의 생약으로 구성되어 있으며, 破瘀行氣溫經之劑로 氣血의 循環을 도우며 祛瘀하는 효능이 있어 打撲이나 落傷 등으로 전신 또는 국소에 血栓이나 血管鬱血이 생겨서 아프고 복부팽만감이 있을 때 사용되었다. 4,5) 본 처방의 실험적 연구로 항염증, 6) 초기 골절에 의한 골결합, 7) 피하혈종, 8) 항혈전9) 및 뇌허혈 개선10) 효과 등이 보고되었다.
	당귀수산은 어떤 생약으로 구성되는가?	따라서 한약 처방은 여러 약재와 성분의 상호작용으로 다양한 질환들의 치료 또는 예방을 위해 사용되어 왔다. 1,2) 이러한 한약 처방 중 하나인 당귀수산은 明代李3)의「醫學入門」에 처음 수록된 처방으로 당귀(Angelica gigas), 적작약(Paeonia obovata), 오약(Lindera strichnifolia), 향부자(Cyperus rotundus), 소목(Caesalpina sappan), 홍화(Carthamus tinctorius), 도인(Prunus persica), 계피 (Cinnamomum cassia) 및 감초(Glycyrrhiza uralensis) 등 9종의 생약으로 구성되어 있으며, 破瘀行氣溫經之劑로 氣血의 循環을 도우며 祛瘀하는 효능이 있어 打撲이나 落傷 등으로 전신 또는 국소에 血栓이나 血管鬱血이 생겨서 아프고 복부팽만감이 있을 때 사용되었다. 4,5) 본 처방의 실험적 연구로 항염증, 6) 초기 골절에 의한 골결합, 7) 피하혈종, 8) 항혈전9) 및 뇌허혈 개선10) 효과 등이 보고되었다.
	실험적 연구를 통해 보고된 당귀수산의 효능에는 어떤 것들이 있는가?	1,2) 이러한 한약 처방 중 하나인 당귀수산은 明代李3)의「醫學入門」에 처음 수록된 처방으로 당귀(Angelica gigas), 적작약(Paeonia obovata), 오약(Lindera strichnifolia), 향부자(Cyperus rotundus), 소목(Caesalpina sappan), 홍화(Carthamus tinctorius), 도인(Prunus persica), 계피 (Cinnamomum cassia) 및 감초(Glycyrrhiza uralensis) 등 9종의 생약으로 구성되어 있으며, 破瘀行氣溫經之劑로 氣血의 循環을 도우며 祛瘀하는 효능이 있어 打撲이나 落傷 등으로 전신 또는 국소에 血栓이나 血管鬱血이 생겨서 아프고 복부팽만감이 있을 때 사용되었다. 4,5) 본 처방의 실험적 연구로 항염증, 6) 초기 골절에 의한 골결합, 7) 피하혈종, 8) 항혈전9) 및 뇌허혈 개선10) 효과 등이 보고되었다. 또한 긴장형 두통 개선, 11) 알레르기성 紫斑證 개선, 12) 교통사고 환자의 피부저항변이도 특성13) 및 간장과 신장의 기능이상을 나타낸 重症跌撲瘀血痛 환자에서의 개선14) 등에 대한 효과와 같은 증례보고와 임상연구가 다수 보고되었다. 이 와 같이 한약 처방에 대한 실험적 효능과 임상적 증례보고는 다수 발표가 되었지만 품질관리를 위한 분석에 대한 연구는 미비한 실정이다.

참고문헌 (14)

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표제어: PCR

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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