[논문]전통장류로부터 혈전용해 활성이 우수한 효모균주의 분리

이재형; 허남기; 최병곤; 박은희; 권세영; 김명동; 홍운표; 여수환; 백성열

doi:10.4014/kjmb.1403.03006

전통장류로부터 혈전용해 활성이 우수한 효모균주의 분리
Isolation of Fibrinolytic Yeasts from Korean Traditional Fermented Soybean 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.42 no.2, 2014년, pp.184 - 189

이재형 (강원도농업기술원 농식품연구소) , 허남기 (강원도농업기술원 농식품연구소) , 최병곤 (강원도농업기술원 농식품연구소) , 박은희 (강원대학교 식품생명공학과) , 권세영 (강원대학교 식품생명공학과) , 김명동 (강원대학교 식품생명공학과) , 홍운표 (레인보우 바이오테크(주)) , 여수환 (농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효식품과) , 백성열 (농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효식품과)

초록
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본 연구에서는 강원전통장류로부터 혈전용해 활성이 우수한 효모를 분리하였다. 된장에서 분리한 AFY-1 균주는 혈전용해 활성 측정결과 양성대조구인 plasmin 보다 약 1.75배 높은 활성을 나타내었다. 분리한 효모는 18S rRNA 염기서열 및 탄소원 이용 특성 분석을 통하여 Saccharomycetales sp.로 동정되었으며, AFY-1 균주의 생육 최적온도는 $32^{\circ}C$였다. 본 연구에서 분리된 혈전용해능이 우수한 효모균주는 안전성 검증 등 추가연구를 통해 발효식품 제조용 스타터로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Yeast strains demonstrating fibrinolytic activity were isolated from traditional fermented soybean in Gangwon province, Korea. The AFY-1 strain isolated from fermented soybean paste showed the highest fibrinolytic activity (3.5 U/mg protein) corresponding to a 1.75 fold higher fibrinolytic activity compared with the plasmin (2.0 U/mg protein). The optimum temperature for the growth of AFY-1 strain was $32^{\circ}C$. Analysis of 18S rRNA gene sequence and carbon source utilization pattern indicated that the AFY-1 strain shares the highest homology (99%) with Saccharomycetales sp.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

강원도에서 생산되는 전통장류의 발효과정에서 유용한 효소생산에 관여하는 미생물을 선발·동정하여 추후 전통장류산업의 경쟁력 강화를 위한 기초자료를 제공하고자 본 연구를 수행하였다.
본 연구에서는 강원전통장류로부터 혈전용해 활성이 우수한 효모를 분리하였다. 된장에서 분리한 AFY-1 균주는 혈전용해 활성 측정결과 양성대조구인 plasmin 보다 약 1.
본 연구에서는 전통장류의 발효과정에 관여하는 효모를 분리하기 위해서 강원도 각 지역에서 전통방식으로 제조한 장류를 수집하여 미생물을 분리하였고, 분리된 효모 균주 중 혈전용해 효소(fibrinolytic enzyme) 활성이 있는 균주를 선발하였다. 강원도에서 생산되는 전통장류의 발효과정에서 유용한 효소생산에 관여하는 미생물을 선발·동정하여 추후 전통장류산업의 경쟁력 강화를 위한 기초자료를 제공하고자 본 연구를 수행하였다.
혈전용해 활성이 가장 우수한 AFY-1 균주의 대량배양을 위해 균주의 생육특성을 조사하였다. 배양온도가 AFY-1 균주의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 24-40^oC의 온도에서 24시간 배양한 후 균체농도를 측정한 결과 32^oC에서 균체농도는 9.

가설 설정

a)Cells were grown at each temperature for 24 h. Initial medium acidity was adjusted to pH 5.
b)ND: not detected.

제안 방법

Fibrinogen을 최종농도가 0.3% (w/v)가 되도록 PBS 완충액(0.1 M, pH 7.4)에 용해시켜 평판에 부은 후 1.5% (w/v) agarose 용액을 동량 첨가하여 혼합하였고 여기에 thrombin (20 U, Sigma-Aldrich, USA)을100 µl 첨가하여 상온에서 정치한 후 균주 배양액 20 µl를 분주하여 paper disk 방법[10]으로 활성을 측정하였다.
3)을 첨가하고 최종 부피를 50 µl로 하여 94^oC에서 3분간 반응시키고 94^oC에서 1분, 60^oC에서30초, 72^oC에서 1분 반응을 28회 수행한 후, 최종적으로 72^oC에서 10분간 반응시켰다. PCR 반응산물은 1.5% agarose gel을 사용하는 전기영동장치를 이용하여 분석하였고, 약 400 bp의 증폭산물의 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 NCBI (http://www.
분리된 균주의 탄소원 이용 특성은 API20C AUX kit (BioMèrieux, France)으로 조사하였다.
분리된 균주의 형태학적 특성을 확인하기 위하여 균주배양액을 원심분리(10,000 × g, 2분, 4oC) 한 후 상층액을 제거하고 생리식염수로 2회 세척하였다.
분리된 효모균주의 동정을 위하여 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')과 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC3') 프라이머를 사용하여 18S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다[9].
생리식염수 90 ml에 수집한 장류 시료 10 g을 넣어 교반기(hb-201SF, Hanbaek Scientific, Korea)로 10시간 진탕한 후 정치시키고 상등액 100 µl를 chloramphenicol (100 µg/ml)이 첨가된 YEPD (1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) glucose) 고체배지에 도말하여 30oC에서 48시간 배양한 후 단일집락을 형성하는 균주를 1차 선발하였다.
세포 파쇄액에 200 µl의 TE (0.01 M Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) 완충용액과 동량의phenol/chloroform을 첨가하고 교반한 후 4oC에서 원심분리(1,200 ×g, 10분)하여 상층액을 회수하였다.
염색체 DNA (10 ng)를 주형으로 사용하고 1.25 UTaq polymerase (Bioneer, Korea), 10 pmol primers, 0.2 mMdNTPs와 10배 농축반응용액(10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 105 mM MgCl2, pH 8.3)을 첨가하고 최종 부피를 50 µl로 하여 94oC에서 3분간 반응시키고 94oC에서 1분, 60oC에서30초, 72oC에서 1분 반응을 28회 수행한 후, 최종적으로 72oC에서 10분간 반응시켰다.
농도구배 에탄올(50-100%)로 각각 5분씩 탈수 후 100% hexamethyldisilazane (SigmaAldrich)으로 완전히 탈수한 후 건조시켰다. 전처리한 균주는 주사전자현미경(JSM-35CF, JEOL, Japan)을 사용하여 20,000배 배율로 관찰하였다.
항생제인 chloramphenicol이 함유된 YEDP 고체배지에서 1차 분리된 효모균주 중 혈전용해 활성이 우수한 균주를 선발하기 위하여 효모 균주를 YEPD 배지에서 12시간 배양 한 후 원심분리하고 상층액을 조효소액으로 사용하여 혈전용해활성을 측정하였다(Fig. 1A). 혈전용해활성의 상대적 비교를 위해서 단백질 농도를 측정하여 양성 대조구 농도로 희석한 후 각각 20 µl를 분주하여 사용하였다.
혈전용해 활성이 우수한 효모균주를 YEPD 배지가 포함된 20 L 발효조에서 24시간 동안 다양한 온도(24-40^oC)에서 배양한 후 균체농도(균체수)를 측정하였다. 무기염류가 효모균주의 성장에 미치는 영향도 같은 조건에서 수행하였다.
혈전용해활성의 상대적 비교를 위해서 단백질 농도를 측정하여 양성 대조구 농도로 희석한 후 각각 20 µl를 분주하여 사용하였다.
효모 균주를 200 ml의 YEPD 배지에서 12시간 동안 진탕배양한 후 원심분리(1,200 × g, 5분)하여 회수한 균체를 STES 완충용액(0.5 M NaCl, 0.2 M Tris-HCl, 001 M EDTA, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), pH 7.6)으로 세척하고 30 µl의 STES 완충용액으로 균체를 현탁하였다.
효모 균주의 혈전분해 효소 활성은 Astrup과 Mullerttz의 방법 [1]을 변형하여 측정하였다. Fibrinogen을 최종농도가 0.

대상 데이터

단백질은 Bradford protein assay plus kit (GenDEPOT, USA)을 이용하여 정량하였으며, 양성 대조구로는 plasmin (2 U/mg protein, Sigma-Aldrich)을 사용하였고, 혈전분해 활성이 없는 S. cerevisiae BY4742 [17] 균주 배양액을 음성대조구로 각각 20 µl를 분주하여 사용하였다.
2 U/mg protein의 혈전용해 활성을 나타내었다(Table 1). 대조구로 사용한 실험실 균주인 S. cerevisiaeBY4742는 혈전용해 활성을 나타내지 않았다.
본 연구에 사용된 전통장류는 강원도에서 전통적인 방법으로 제조되어 판매되고 있는 된장 10점, 고추장 5점, 막장 5점, 간장 5점, 그리고 청국장 5점 등 총 30점을 수집하여 사용하였다.

이론/모형

5% agarose gel을 사용하는 전기영동장치를 이용하여 분석하였고, 약 400 bp의 증폭산물의 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공하는 Blast 프로그램을 이용하여 염기서열을 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석한 후, Neighbor-joining method [8]을 사용하여 계통도를 작성하였다. 분리된 균주의 탄소원 이용 특성은 API20C AUX kit (BioMèrieux, France)으로 조사하였다.

성능/효과

본 연구에서는 강원전통장류로부터 혈전용해 활성이 우수한 효모를 분리하였다. 된장에서 분리한 AFY-1 균주는 혈전용해 활성 측정결과 양성대조구인 plasmin 보다 약 1.75배 높은 활성을 나타내었다. 분리한 효모는 18S rRNA 염기서열 및 탄소원 이용 특성 분석을 통하여 Saccharomycetales sp.
분리한 효모는 18S rRNA 염기서열 및 탄소원 이용 특성 분석을 통하여 Saccharomycetales sp.로 동정되었으며, AFY-1 균주의 생육 최적온도는 32^oC였다. 본연구에서 분리된 혈전용해능이 우수한 효모균주는 안전성 검증 등 추가연구를 통해 발효식품 제조용 스타터로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.
무기염류가 균체성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 K2HPO4, KH2PO4, 및 MgSO4·7H2O을 0-0.2% (w/v)의 농도로 첨가하여 32oC에서 24시간 동안 배양한 후 균체농도를 측정한 결과 K2HPO4 및 KH2PO4는 0.2% (w/v)농도에서, MgSO4·7H2O는 0.15% (w/v)에서 각각 균체성장이 증가하였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Table 4).
배양온도가 AFY-1 균주의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 24-40oC의 온도에서 24시간 배양한 후 균체농도를 측정한 결과 32oC에서 균체농도는 9.65 ± 0.24 log cfu/ml로 가장 우수한 균체성장을 나타내었다(Table 3).

후속연구

본 연구에서 전통 장류로부터 혈전용해능이 우수한 효모를 분리·확보함으로써 장류의 명품화 및 제조공정의 과학화에 기여할 것으로 사료된다
로 동정되었으며, AFY-1 균주의 생육 최적온도는 32^oC였다. 본연구에서 분리된 혈전용해능이 우수한 효모균주는 안전성 검증 등 추가연구를 통해 발효식품 제조용 스타터로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	기존 혈전용해 활성 미생물에 대한 연구는 대부분 어떤 것을 이용하였는가?	전통식품 유래의 혈전용해 활성 미생물에 대한 연구는 지속적으로 이루어져 왔으나 대부분 Bacillus나 곰팡이에 국한되어 있었다[12, 13]. 본 연구에서 전통 장류로부터 혈전용해능이 우수한 효모를 분리·확보함으로써 장류의 명품화 및 제조공정의 과학화에 기여할 것으로 사료된다.
	된장에서 분리한 AFY-1 균주는 양성대조구인 plasmin에 비교하여 어떤 특성을 가지는가?	본 연구에서는 강원전통장류로부터 혈전용해 활성이 우수한 효모를 분리하였다. 된장에서 분리한 AFY-1 균주는 혈전용해 활성 측정결과 양성대조구인 plasmin 보다 약 1.75배 높은 활성을 나타내었다. 분리한 효모는 18S rRNA 염기서열 및 탄소원 이용 특성 분석을 통하여 Saccharomycetales sp.
	전통발효 식품으로 혈전용해능을 연구한 나라는?	licheniformis의 경우 CoCl2·6H2O, ZnCl2, HgCl2, FeSo4·7H2O, AgNO3과 같은 무기염류는 균체의 생육을 저해하는 것으로 나타났다[34]. 현재까지 우리나라를 포함한 일본, 중국 등에서 콩을 이용한 발효식품의 혈전용해능 등 다양한 생리기능성이 보고되고 있으며[3], 특히 태국의 콩 발효식품에서 분리한 B. licheniformis와 B.

참고문헌 (38)

Astrup T, Mullertz S. 1952. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys. 40: 346-351.

상세보기
Baek SY, Yun HJ, Choi HS, Koo BS, Yeo SH. 2010. Isolation and physiological characteristics of microorganism producing extracellular enzymes from Korean traditional soybean sauce and soybean paste. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 38: 379-384.

원문보기 상세보기
Choi NS, Chung DM, Han YJ, Kim SH, Song JJ. 2009. Purification and characterization of a subtilisin D5, a fibrinolytic enzyme of Bacillus amyloliquefaciens DJ-5 isolated from Doenjang. Korean J. Food Sci. Technol. 15: 500-505.
Choi NS, Seo SY, Kim SH. 1999. Screening of mushrooms having fibrinolytic activity Korean J. Food Sci. Technol. 31: 553-557.

원문보기 상세보기
Choi WA, Lee JW, Lee KH, Park SH. 1998. Effects of environmental and nutritional conditions on fibrinolytic enzyme production from Bacillus subtilis BK-17 in flask culture. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 13: 491-496.

원문보기 상세보기
Gomez CC, Simoncarballo R, Coma AC, Sanchez de Leon T, Montero DE, Rodriguez PR. 1991. The relationship between lipid peroxidation and platelets aggregation in atherosclerotic patients. Angiologica 4: 241-246.
Harlan JM, Harker LA. 1981. Hemostasis, thrombosis, and thromboembolic disorders. Med. Clin. North. Am. 65: 855-857.

상세보기
Hasegawa M, Fujiwara M. 1993. Relative efficiencies of the maximum likelihood, maximum parsimony, and neighbor-joining methods for estimating protein phylogeny. Mol. Phylogenet. Evol. 2: 1-5.

상세보기
Hsiao CR, Huang L, Bouchara JP, Barton R, Li HC, Chang TC. 2005. Identification of medically important molds by an oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43: 3760-3768.

상세보기
Hwang JH. 2010. The fermentative characteristics of cheong-gukjang prepared by starter culture of Bacillus sp. with fibrinolytic activity. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 39: 1832-1838.

원문보기 상세보기
Jang IJ, Kim YH, Yi SH, Lim SI, Lee JS. 2011. Screening of a new fibrinolytic substances-producing yeast. Korean J. Mycol. 39: 227-228.

원문보기 상세보기
Jang YR, Kim WK, Kwon IB, Lee HY. 1998. Screening and identification of the fibrinolytic bacterial strain from Jeot-Gal, salt-fermented fish. Korean J. Food Sci. Technol. 30: 655-659.

원문보기 상세보기
Kim DH, Song HP, Kim KY, Kim JO, Byun MW. 2004. A correlation between fibrinolytic activity and microflora in korean fermented soybean products. J. Korean Soc. Food Sci. Nitr. 33: 41-46.

원문보기 상세보기
Kim HK, Kim GT, Kim DK, Choi WA, Park SH, Jeong YK, et al. 1997. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish. J. Ferment. Bioeng. 84: 307-312.

상세보기
Kim SH, Choi NS, Lee WY, Lee JW, Kim DH. 1998. Isolation of Bacillus strains secreting fibrinolytic enzymes from Doenjang. Korean J. Microbiol. 34: 87-90.
Kim WK, Choi KH, Kim YT, Park HH, Choi JY, Lee YS, et al. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang. Appl. Environ. Microbiol. 62: 2482-2488.

상세보기
Kumar C, Sharma R, Bachhawat AK. 2003. Investigations into the polymorphisms at the ECM38 locus of two widely used Saccharomyces cerevisiae S288C strains, YPH499 and BY4742. Yeast 20: 857-863.

상세보기
Lee CY. 1989. Korean soy seasonings and culture. Food Sci. Ind. 22: 3-7.
Lee SK, Heo S, Bae DH, Choi KH. 1998. Medium optimization for fibrinolytic enzyme production by Bacillus subtilis KCK-7 isolate from Korean traditional Chungkookjang. Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26: 226-231.
Masuda S, Yamaguchi H, Kurokawa T, Shirakami T, Tsuji RF, Nishimura I. 2008. Immunomodulatory effect of halophilic lactic acid bacterium Tetragenococcus halophilus Th221 from soy sauce moromi grown in high-salt medium. Int. J. Food Microbiol. 121: 245-252.

상세보기
Mullertz S. 1987. Fibrinolysis, general aspects, characteristic features and perspectives: International committee for fibrinolysis kabi prize lecture. Fibrinolysis 1: 3-12.

상세보기
Nakajima N, Mihara H, Sumi H. 1993. Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus. Biosci. Biotechnol. Biochem. 57: 1726-1730.

상세보기
Nakajima N, Taya N, Sumi H. 1993. Potent fibrinolytic enzyme from the lysate of Katsuwonus pelamis digestive tract (Shiokara): purification and characterization. Biosci. Biotechnol. Biochem. 57: 1604-1605.

상세보기
Nakamura T, Yamagata Y, Ichishima E. 1992. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto). Biosci. Biotechnol. Biochem. 56: 1869-1871.

상세보기
Nakashima A, Okada T, Sugie I. 1990. Fibrin-dependent activation of plasminogen by a proteolytic digest of streptokinase. Blood Coagul. Fibrinolysis 1: 279-284.

상세보기
Nicolet CM, Craig EA. 1989. Isolation and characterization of STI1, a stress-inducible gene from Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 9: 3638-3646.

상세보기
Noh K, Kim D, Choi N, Kim S. 1999. Isolation of fibrinolytic enzyme producing strains from Kimchi. Korean J. Food Sci. Technol. 31: 219-223.

원문보기 상세보기
Oh YS, Park JE, Oh HJ, Kim JH, Oh MC, Oh CK, et al. 2010. Isolation and Characteristics of microorganisms producing extracellular enzymes rom Jeju traditional fermented soybean paste(Doenjang). J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 39: 47-53.

원문보기 상세보기
Park JS, Hyun KW, Seo SB, Cho SM, Yoo CH, Lee JS. 2003. Detection of platelet aggregation inhibitors and fibrinolytic substances from mushrooms. Korean Soc. Mycology 31: 114-116.

원문보기 상세보기
Phromraksa P, Nagano H, Boonmars T, Kamboonruang C. 2008. Identification of proteolytic bacteria from Thai traditional fermented food and their allergenic reducing potentials. J. Food Sci. 73: 189-195.

상세보기
Rhee KH. 2011. Isolation and identification of a Streptomyces sp. that produces antibiotics against multidrug. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 39: 37-42.

원문보기 상세보기
Rijken DC, Sakharov DV. 2001. Basic principles in thrombolysis: regulatory role of plasminogen. Thromb. Res. 103: 41-49.

상세보기
Ryu BH. 2003. Development of functional Doenjang for antioxidative and fibrinolytic activity. Korean J. Life Sci. 13: 559-568.

원문보기 상세보기
Seo DS, Ko JA, Gal SW, Lee SW. 2010. Characterization of Bacillus licheniformis KJ-9 isolated from soil. J. Life Sci. 20: 403-410.

원문보기 상세보기
Sloma A, Rufo GA, Jr., Rudolph CF, Sullivan BJ, Theriault KA, Pero J. 1990. Bacillopeptidase F of Bacillus subtilis: purification of the protein and cloning of the gene. J. Bacteriol. 172: 5520-5521.
Voet D, Voet JG. 1990. Biochemistry. John Wiley & Sons, New York.
Wu XC, Nathoo S, Pang AS, Carne T, Wong SL. 1990. Cloning, genetic organization, and characterization of a structural gene encoding bacillopeptidase F from Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 265: 6845-6850.
Yoshikatsu M, Mitsuo Y. 2008. Traditional healthful fermented products of Japan. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35: 791-798.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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