Clitocybe aurantiaca 균주가 생산하는 주름개선소재 clitocybin A의 대량 발효생산 및 MMP-1 발현저해활성 Fermentation Process for Mass Production of Clitocybin A, a New Anti-Wrinkle Agent from Clitocybe aurantiaca and Evaluation of Inhibitory Activity on Matrix Metalloproteinase-1 Expression원문보기
본 연구에서는 국내 자생버섯의 일종인 Clitocybe aurantiaca KCTC11143BP 균주가 생산하는 주름개선 화장품 신소재 clitocybin A의 발효생산 최적조건, 추출정제조건, 세포독성 및 자외선 조사에 따른 MMP-1 발현 저해활성을 규명하였다. C. aurantiaca 균주를 5 L 발효조를 이용하여 회분식으로 배양하였을 경우, PD 액체배지보다 YM 액체배지에서 양호하게 생육하는 것을 확인하였다. 300 L 용량의 대형 발효조에서 modified된 YM 배지를 이용한 유가식 배양으로 14일간 배양한 결과, 12.5 kg/120 L의 총 균체량을 얻었다. 발효 추출물로부터 항노화 소재인 clitocybin A를 추출정제를 한 후 HPLC를 실시하여 배양 4일째부터 clitocybin A가 생산되고 있음을 확인하였다. Clitocybin A 화합물의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시한 결과, 100 ${\mu}g/ml$ 농도로 처리하였을 경우 $134.6{\pm}10.4%$로 오히려 세포가 증식하여 안전한 소재임을 확인하였다. 반면, 대조군으로 사용한 oleanolic acid는 25 ${\mu}g/ml$ 농도에서도 강한 세포독성을 나타냈다. 또한, clitocybin A는 100 ${\mu}g/ml$ 처리시 33.1%의 MMP-1 발현 저해활성 보여 주름개선 기능성화장품 소재로 매우 우수한 화합물임을 확인하였다.
본 연구에서는 국내 자생버섯의 일종인 Clitocybe aurantiaca KCTC11143BP 균주가 생산하는 주름개선 화장품 신소재 clitocybin A의 발효생산 최적조건, 추출정제조건, 세포독성 및 자외선 조사에 따른 MMP-1 발현 저해활성을 규명하였다. C. aurantiaca 균주를 5 L 발효조를 이용하여 회분식으로 배양하였을 경우, PD 액체배지보다 YM 액체배지에서 양호하게 생육하는 것을 확인하였다. 300 L 용량의 대형 발효조에서 modified된 YM 배지를 이용한 유가식 배양으로 14일간 배양한 결과, 12.5 kg/120 L의 총 균체량을 얻었다. 발효 추출물로부터 항노화 소재인 clitocybin A를 추출정제를 한 후 HPLC를 실시하여 배양 4일째부터 clitocybin A가 생산되고 있음을 확인하였다. Clitocybin A 화합물의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시한 결과, 100 ${\mu}g/ml$ 농도로 처리하였을 경우 $134.6{\pm}10.4%$로 오히려 세포가 증식하여 안전한 소재임을 확인하였다. 반면, 대조군으로 사용한 oleanolic acid는 25 ${\mu}g/ml$ 농도에서도 강한 세포독성을 나타냈다. 또한, clitocybin A는 100 ${\mu}g/ml$ 처리시 33.1%의 MMP-1 발현 저해활성 보여 주름개선 기능성화장품 소재로 매우 우수한 화합물임을 확인하였다.
Clitocybin A is a novel anti-wrinkle cosmetic agent produced by the strain from a Korean native mushroom Clitocybe aurantiaca. In this study, fermentation, extraction, and purification conditions for a large scale production of clitocybin A were optimized, and its cytotoxicity and inhibition activit...
Clitocybin A is a novel anti-wrinkle cosmetic agent produced by the strain from a Korean native mushroom Clitocybe aurantiaca. In this study, fermentation, extraction, and purification conditions for a large scale production of clitocybin A were optimized, and its cytotoxicity and inhibition activity on the expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) were characterized. The mass production of anti-wrinkle agent was achieved according to the 300 L fermentation process with a fed-batch cultivation using the modified yeast-maltose (YM) broth, and a total of 12.5 kg of cell mass was obtained in a 120 L culture broth for 14 days. After extraction and purification, clitocybin A was identified by HPLC. The cytotoxicity of clitocybin A was examined by the MTT assay. When assayed at 100 and 200 ${\mu}g/ml$ concentrations, clitocybin A showed no cytotoxicity, demonstrating safety. The inhibition activity of clitocybin A on the expression of MMP-1 was examined against UV irradiation. Oleanolic acid (control group) showed a relatively low MMP-1 inhibiting activity (ca. 16.7%) at 10 ${\mu}g/ml$ and showed increased cytotoxicity at higher concentrations. In contrast, clitocybin A showed no cytotoxicity at 100 ${\mu}g/ml$, and exhibited a relatively high MMP-1-inhibiting activity (33.1%). These findings indicate that clitocybin A may be a safe and effective anti-wrinkle agent for use in functional cosmetics.
Clitocybin A is a novel anti-wrinkle cosmetic agent produced by the strain from a Korean native mushroom Clitocybe aurantiaca. In this study, fermentation, extraction, and purification conditions for a large scale production of clitocybin A were optimized, and its cytotoxicity and inhibition activity on the expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) were characterized. The mass production of anti-wrinkle agent was achieved according to the 300 L fermentation process with a fed-batch cultivation using the modified yeast-maltose (YM) broth, and a total of 12.5 kg of cell mass was obtained in a 120 L culture broth for 14 days. After extraction and purification, clitocybin A was identified by HPLC. The cytotoxicity of clitocybin A was examined by the MTT assay. When assayed at 100 and 200 ${\mu}g/ml$ concentrations, clitocybin A showed no cytotoxicity, demonstrating safety. The inhibition activity of clitocybin A on the expression of MMP-1 was examined against UV irradiation. Oleanolic acid (control group) showed a relatively low MMP-1 inhibiting activity (ca. 16.7%) at 10 ${\mu}g/ml$ and showed increased cytotoxicity at higher concentrations. In contrast, clitocybin A showed no cytotoxicity at 100 ${\mu}g/ml$, and exhibited a relatively high MMP-1-inhibiting activity (33.1%). These findings indicate that clitocybin A may be a safe and effective anti-wrinkle agent for use in functional cosmetics.
본 연구에서는 Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP 균주가 생산하는 항노화 활성물질인 clitocybin A 화합물의 대량생산을 위한 최적 배지의 선정 및 발효조건을 확립하고 발효생산물 중 clitocybin A 화합물의 추출정제 방법, 기능성 주름개선 화장품 소재로 활용하기 위한 세포독성 및 MMP-1 발현 억제활성 등을 조사하였다.
제안 방법
즉 세포 생존율은 HDF-N 세포를 이용하여 평가하였으며 시료를 제외한 배양 배지만 처리한 값(control)에 대한 백분율로 나타냈다. 즉 clitocybin A 를 최저 농도 0.001 µg/ml에서 최고 농도 200 µg/ml까지 각농도 별로 처리한 후 세포 생존율을 측정함으로서 본 화합물의 세포독성을 조사하였다.
대상 데이터
후)배 양시">배양시
yeast peptone은 ㈜Biospringer(USA)의 yeast peptone 0202를 사용하였다. 발효 중의 기포 발생억제를 위한 소포제는 ㈜Sigma(USA)의 antifoam 204를 사용하였다. 발효기는 ㈜Kobiotech(Korea)의 KFC LA-150 5 L 발효기 및 KFC 300LB 300 L 발효기를 사용하였으며 포도당 농도는 ㈜YSI(Korea) 2700 SELECT를 사용하여 조절하였다.
주름개선 소재인 clitocybin A의 발효생산을 위하여 사용된 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 보관하고 있는 Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP 균주를 사용하였다.
데이터처리
후)실험 결과는">실험결과는
각 군의 Student t-test를 이용하여 p-value를 구하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
Clitocybin A 화합물의 주름개선 효능을 확인하기 위하여 주름생성에 직접적으로 관여하는 콜라겐 분해효소인 MMP-1의 발현 저해효능을 immuno ELISA assay법을 이용하여 조사하였으며 이때 oleanolic acid를 표준 대조구로 비교 검토하였다(Table 2). 먼저 대조구인 oleanolic acid 처리구에서, oleanolic acid 0.
성능/효과
특히 Kim 등[6]은 주름개선 소재로 Sanguisorba officinalis 뿌리 추출물로부터 ziyuglycoside I을 분리한 후 MMP-1 및 type I collagen 합성능을 조사하여 우수한 효과가 있다는 것을 규명하여 화장품 소재로 활용하고 있다. 본 연구결과, 주름개선 소재로 활용되고 있는 대조군인 oleanolic acid는 10 µg/ml 처리까지는 16.6% 정도의 MMP-1 발현 저해활성을 나타내나 그 이상의 농도를 처리하면 오히려 급격한 역효과를 내고 있지만, clitocybin A는 100 µg/ml의 농도를 처리하여도 33.1%의 MMP-1 발현 저해활성을 보여 안전하면서도 주름개선 효과가 우수한 항노화 소재임을 확인하였다. 향후 clitocybin A의 주름개선 효과를 임상학적으로 검증할 예정이다.
후속연구
">확인하였다. 향후 clitocybin A의 주름개선 효과를 임상학적으로 검증할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
300 L 용량의 대형 발효조에서 modified된 YM 배지를 이용한 유가식 배양으로 14일 배양한 C. aurantiaca 균체량은 얼마인가?
aurantiaca 균주를 5 L 발효조를 이용하여 회분식으로 배양하였을 경우, PD 액체배지보다 YM 액체배지에서 양호하게 생육하는 것을 확인하였다. 300 L 용량의 대형 발효조에서 modified된 YM 배지를 이용한 유가식 배양으로 14일간 배양한 결과, 12.5 kg/120 L의 총 균체량을 얻었다. 발효 추출물로부터 항노화 소재인 clitocybin A를 추출정제를 한 후 HPLC를 실시하여 배양 4일째부터 clitocybin A가 생산되고 있음을 확인하였다.
MMP-1의 발현을 저해하는 화합물의 소재적 특징은 무엇인가?
인체의 주름생성에는 MMP-1효소가 매우 중요한 인자가 되며 따라서 MMP-1의 발현을 저해하는 화합물은 주름개선 화장품 소재로 효과가 있다는 것은 이미 잘 알려져 있다 [1, 6, 7, 9]. 특히 Kim 등[6]은 주름개선 소재로 Sanguisorba officinalis 뿌리 추출물로부터 ziyuglycoside I을 분리한 후 MMP-1 및 type I collagen 합성능을 조사하여 우수한 효과가 있다는 것을 규명하여 화장품 소재로 활용하고 있다.
발효 추출물로부터 항노화 소재인 clitocybin A의 세포 독성을 확인하기 위한 방법과 결과는 무엇인가?
발효 추출물로부터 항노화 소재인 clitocybin A를 추출정제를 한 후 HPLC를 실시하여 배양 4일째부터 clitocybin A가 생산되고 있음을 확인하였다. Clitocybin A 화합물의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시한 결과, 100 ${\mu}g/ml$ 농도로 처리하였을 경우 $134.6{\pm}10.4%$로 오히려 세포가 증식하여 안전한 소재임을 확인하였다. 반면, 대조군으로 사용한 oleanolic acid는 25 ${\mu}g/ml$ 농도에서도 강한 세포독성을 나타냈다.
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