[논문]조협의 부위에 따른 항산화 전사인자 Nrf2 활성 효과

최지연; 김균하; 최준용; 한창우; 하기태; 정한솔; 주명수

조협의 부위에 따른 항산화 전사인자 Nrf2 활성 효과
Identification of the Plant Part of Gleditsia sinensis that Activates Nrf2, an Anti-oxidative Transcription Factor 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.28 no.3, 2014년, pp.303 - 309

최지연 (부산대학교 한의학전문대학원 응용의학부) , 김균하 (부산대학교 한의학전문대학원 응용의학부) , 최준용 (부산대학교 한방병원 내과학교실) , 한창우 (부산대학교 한방병원 내과학교실) , 하기태 (부산대학교 한의학전문대학원 응용의학부) , 정한솔 (부산대학교 한의학전문대학원 응용의학부) , 주명수 (부산대학교 한의학전문대학원 응용의학부)

Abstract ▼ AI-Helper

The fruit of Gleditsia sinensis has been extensively used as a key ingredient of an herbal remedy for the treatment of various inflammatory diseases in traditional Korean Medicine. However, the reason of using the fruit of G. sinensis for the remedy is unclear. Since Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) is a key anti-inflammatory transcription factor, which is activated by the fruit of G. sinesis, we examined whether other plant parts of G. sinensis are also capable of suppressing inflammatory responses by activating Nrf2. Water extracts of various parts of G. sinensis were prepared and tested for Nrf2 activation by reporter assay and western blot analysis. Our results show that the hull of G. sinensis is the most potent in activating Nrf2. Sequential organic solvent extraction of the hull show that all the fractions had a higher potency in activating Nrf2 than the water extract, albeit differential degrees. The hull originated from Korea in general activated Nrf2 strongly compared to that of China. Chloroform fraction of the hull was further examined, showing that the fraction induced nuclear localization of Nrf2, indicative of activated Nrf2, and Nrf2-dependent gene expression including NAD(P)H dehydrogenase quinone 1 (NQO-1), glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GCLC), and heme oxygenase - 1 (HO-1). Therefore, our results show that, among other plant parts examined in this study, the hull of G. sinensis is the most potent, providing the experimental basis for the use of the hull of G. sinensis as an active ingredient for an anti-inflammatory remedy.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

GS는 전통적으로 꼬투리를 주로 사용하고 있다¹³⁾. 꼬투리 외에 다른 부위에서도 염증억제효과가 있는지 조사하기 위해, 본 연구에서는 GS를 부위별 물 추출물(잎, 줄기-심재, 줄기-수피, 씨앗, 꼬투리)을 한국생명공학연구원에서 제공받아 세포 내 항염, 항산화를 조율하는 대표적인 전사인자인 Nrf2의 활성에 미치는 효능을 비교하였고, 이 중 가장 효능이 높은 꼬투리부분을 용매 분획한 후 각 분획별로 Nrf2 활성정도를 비교함으로써 GS의 약리효능에 대한 과학적 근거를 제시하고자 한다.
이와 같이 Nrf2 경로의 활성은 세포 내 ROS의 축적에 의해서도 촉진될 수 있는 것이다. 본 실험에서는 Nrf2 활성을 유도하고 있는 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물이 ROS의 생성을 통하여 Nrf2활성을 유도하는지 확인하고자 이들을 RAW 264.7 세포에 처리 한 후 ROS의 생성을 측정하였다. 실험결과 GS 꼬투리의 chloroform 분획물의 고농도 처리군(50 ㎍/㎖)에서 세포내 ROS의 생성을 증가시키지 않았다(Fig.
본 연구에서는 GS의 꼬투리, 씨앗, 줄기-심재, 줄기-수피, 잎의 물 추출물을 이용하여 luciferase assay를 통해 Nrf2의 전사활성을 확인해 보았다. 그 결과 꼬투리 부위의 물 추출물이 Nrf2전사활성을 가진 것으로 나타났다(Fig.
. 본 연구에서는 항염증 및 항알러지 작용에 관여하는 것으로 알려진 GS의 부위별 효능을 Nrf2 전사인자의 활성화와 연관하여 평가하고자 하였다.

제안 방법

50 ㎍/㎖ 농도의 각 분획물을 16 시간 동안 Nrf2-luciferase reporter construct를 안정적으로 지닌 RAW 264.7 cell 처리한 후 luciferase assay를 시행하였고, 양성대조군으로는 5 μ㏖의 SFN을 사용하였다.
GS의 잎(Leef; L), 줄기-심재(stem heartwood; SH), 줄기-수재(stem bark: SB), 씨앗 (seed), 꼬투리 (hull)의 물 추출물을 5 ㎍/㎖, sulforaphane (이하 SFN)을 5 μ㏖로 16시간 동안 Nrf2-luciferase reporter construct를 안정적으로 지닌 RAW 264.7 cell 처리하였고, 미처리군을 음성 대조군으로 삼았다.
Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 NAD(P)H dehydrogenase quinone 1 (NQO-1), glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GCLC), and heme oxygenase –1 (HO-1)의 상대적인 발현을 측정하기 위해 internal control로 사용하였고, 대표적인 PCR 결과를 ImageJ program (NIH, MA, USA)을 이용하여 분석하였다.
Nrf2 전사인자 활성도를 측정하기 위하여 Nrf2 reporter cell line을 구축하였다. 여기에 사용된 murine NQO-1 gene의 proximal 1kb-long promoter는 QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 분리한 genomic DNA와 5’-GCTATGTGGACCAGTCTGG-3’ 와 5’-GGCTCCAGATGTTGAGGGA-3’를 primer로 사용하여 PCR을 통해 증폭시켰다.
PCR product는 1.2% Agarose gel을 1× TBE buffer에 담가 100V로 30분 동안 전기영동하였고, ethium bromide로 염색을 한 후 ImageJ (National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA)를 사용하여 관찰하였다.
여기에 사용된 murine NQO-1 gene의 proximal 1kb-long promoter는 QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 분리한 genomic DNA와 5’-GCTATGTGGACCAGTCTGG-3’ 와 5’-GGCTCCAGATGTTGAGGGA-3’를 primer로 사용하여 PCR을 통해 증폭시켰다. PCR product를 sequencing을 통해 확인한 후 pGL4.17[luc2/Neo] vector (Promega)에 삽입하여 cloning하였다. 이렇게 생성한 NQO-1[luc/Neo] vector를 RAW 264.
측정하고자 하는 mRNA의 양을 측정하기 위해 합성한 cDNA를 3번에 걸쳐 1:5 end-point dilution (1:1, 1:5, 1:125)하고 dilution한 cDNA를 specific primer들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다. PCR 증폭을 위하여 TaqPCRx DNA polymerase, Recombinant (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였고, 반응조건을 다음과 같이 하였다. 95℃에서 5분간 초기 denaturation 시킨 후 22-30 cycle을 증폭시켰다.
RAW 246.7 세포 내 ROS의 생성은 형광표지자인 carboxy-H2 DCFDA 5-(and-6)- carboxy-2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 추출물의 처리 후 배양액에서 100uM의 carboxy-H2DCFDA을 처리하여 37℃에서 30분간 배양했다.
가장 Nrf2 활성능력이 강한 것으로 나타난 GS 꼬투리에 대하여 용매분획을 실시하여 Nrf2 활성능의 분포를 조사하였다. 중량 500 g의 중국산과 한국산 GS를 메탄올 (MeOH)로 상온에서 1일간 추출하고, MeOH 엑스를 증류수 1 ℓ로 현탁시킨 후, 동량의 hexane, chloroform, ethylacetate 및 butanol의 순으로 용매분획하여 각각의 분획물을 얻었다.
05 수준에서 one-way ANOVA분석을 통하여 분석하고 t-test를 통하여 사후 검정하였다. 각 자료는 3회 반복한 실험결과의 평균과 표준편차를 대조군을 기준으로 하여 상대적으로 표시하였다.
1). 다음으로 Nrf2 전사활성에 영향을 미치는 GS 꼬투리의 성분을 더욱 효율적으로 얻을 수 있는 방법을 찾기 위해 중국산, 한국산 GS의 꼬투리를 유기용매인 MeOH, hexane, chloroform, ethylacetate 및 butanol의 순으로 용매분획 후 각각의 분획물을 사용하여 RAW 264.7 cell에서의 Nrf2의 전사활성을 관찰하였다. 그 결과 모든 유기용매 추출물이 RAW 264.
각 추출물의 처리 후 배양액에서 100uM의 carboxy-H2DCFDA을 처리하여 37℃에서 30분간 배양했다. 배양 후 PBS로 세포 세척 후 excitation 488nm, emission 525nm에서 BD FACS Canto II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 형광측정 하였다.
앞선 실험 결과 Nrf2 전사활성을 가장 우수하게 유도했던 한국산 GS 꼬투리 chloroform 분획물을 농도별로(1, 5, 10, 20, 50㎍/㎖) RAW 264.7 cell에 16 시간 동안 처리한 후 western blot assay와 RT-PCR assay를 시행하였고, 미처리군을 음성대조군으로 SFN처리군을 양성대조군으로 설정하였다. 실험 결과 Nrf2의 핵내 발현은 Fig.
여기에 사용된 murine NQO-1 gene의 proximal 1kb-long promoter는 QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 분리한 genomic DNA와 5’-GCTATGTGGACCAGTCTGG-3’ 와 5’-GGCTCCAGATGTTGAGGGA-3’를 primer로 사용하여 PCR을 통해 증폭시켰다.
이후 1시간 동안 2차 항체를 반응시켜 chemiluminescence (SuperSignalWest Femto, Thermo Scientific)로 band를 확인하였다. 위 membrane은 stripping buffer (Thermo Scientific)를 이용하여 strip하고 위의 방법으로 다시 blocking한 후, 핵의 house keeping protein인 lamin A/C에 대한 polyclonal 항체로 처리하여 band를 확인함으로써 동일한 단백질의 분석여부를 확인하였다.
3A). 이어서 Nrf2에 의존적으로 발현하는 효소인 GCLC, NQO1, HO1의 mRNA 발현을 RT-PCR assay를 통하여 관찰하였다. 전자를 환원시키는 cytochrome P450 reductase 효소와 경쟁작용을 하여 quinone을 해독하는 NADPH quinone oxidoreductase 1 (NQO1)³¹⁾, 과산화수소를 물로 변환시키는 중요한 항산화물질인 환원형 글루타치온(GSH)의 합성이 관여하는 효소인 glutamate-cystein ligase subunit (GCLC)^32,33), 강력한 항산화단백으로 phase II 효소인 heme oxygenase-1 (HO-1)^34,35)의 mRNA 발현은 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물의 고농도 처리군 (50 ㎍/㎖) 에서 모두 두드러지게 증가하였다(Fig.
2B). 이처럼 luciferase assay의 실험 결과 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물이 가장 우수한 Nrf2 전사활성을 가지고 있는 것으로 관찰되어, 이들이 RAW 264.7 cell에서 핵 내 Nrf2의 발현을 증가시키는지 확인하고자 western blot assay를 시행하였다. 실험 결과 선행한 luciferase assay와 마찬가지로 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물은 50 ㎍/㎖의 농도에서 핵 내 Nrf2의 발현을 뚜렷하게 증가시켰다(Fig.
한국생명공학연구원 한국식물추출물은행으로부터 GS의 부위별(잎, 줄기-심재, 줄기-수피, 씨앗, 꼬투리) 물 추출물을 제공받았으며 한국산, 중국산 GS는 광명당 (울산, 한국) 으로부터 구입하였다. 중량 500 g의 GS 꼬투리를 MeOH로 1일 간 상온에서 추출하고, 추출액을 감압농축 후 MeOH엑스를 증류수 1L로 현탁시키고 동량의 hexane, chloroform, ethylacetate 및 butanol의 순으로 용매분획하여 각각의 분획물을 얻었다. 분획물은 3,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 취하였고, 회전감압농축기로 농축한 후 동결 건조하여 –80℃에서 보관하며 사용하였다.
가장 Nrf2 활성능력이 강한 것으로 나타난 GS 꼬투리에 대하여 용매분획을 실시하여 Nrf2 활성능의 분포를 조사하였다. 중량 500 g의 중국산과 한국산 GS를 메탄올 (MeOH)로 상온에서 1일간 추출하고, MeOH 엑스를 증류수 1 ℓ로 현탁시킨 후, 동량의 hexane, chloroform, ethylacetate 및 butanol의 순으로 용매분획하여 각각의 분획물을 얻었다. 50 ㎍/㎖ 농도의 각 분획물을 16 시간 동안 Nrf2-luciferase reporter construct를 안정적으로 지닌 RAW 264.
Total RNA는 QIAGEN RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여, 제조회사의 방법에 준하여 분리했다. 총 RNA의 2 ㎍을 M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하고 GAPDH 유전자의 cDNA의 양을 기준으로 각기 다른 샘플의 PCR 효율을 보정하였다. 측정하고자 하는 mRNA의 양을 측정하기 위해 합성한 cDNA를 3번에 걸쳐 1:5 end-point dilution (1:1, 1:5, 1:125)하고 dilution한 cDNA를 specific primer들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다.
총 RNA의 2 ㎍을 M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하고 GAPDH 유전자의 cDNA의 양을 기준으로 각기 다른 샘플의 PCR 효율을 보정하였다. 측정하고자 하는 mRNA의 양을 측정하기 위해 합성한 cDNA를 3번에 걸쳐 1:5 end-point dilution (1:1, 1:5, 1:125)하고 dilution한 cDNA를 specific primer들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다. PCR 증폭을 위하여 TaqPCRx DNA polymerase, Recombinant (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였고, 반응조건을 다음과 같이 하였다.
ROS는 염증반응을 악화시키고 Nrf2를 활성화시킨다. 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물이 ROS의 생성을 유도함으로써 Nrf2의 활성을 일으키는지에 대한 가능성을 조사하고자 50 ㎍/㎖의 농도의 한국산 GS chloroform 분획물을 RAW 264.7 cell에 16시간 동안 처리한 후 carboxy-H₂DCFDA로 염색하였고, flow cytometric analysis를 통하여 ROS의 생성을 측정하였다. Fig.

대상 데이터

RAW 264.7세포를 10cm 배양 용기에 5 × 106 만큼 배양하여 준비하였다.
Sulforaphane은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로 부터 구입하였다. TLR4-specific Escherichia coli 0111:B4 strain LPS는 Alexis Biochemical (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
Louis, MO, USA)로 부터 구입하였다. TLR4-specific Escherichia coli 0111:B4 strain LPS는 Alexis Biochemical (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 본 실험에서 사용한 모든 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로 부터 구입하였다.
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell은 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)로부터 분양을 받아 L-glutamine (200 ㎎/L)이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)에 10% FBS와 100U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin (Invitrogen)를 첨가하여 배양하였다.
TLR4-specific Escherichia coli 0111:B4 strain LPS는 Alexis Biochemical (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 본 실험에서 사용한 모든 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로 부터 구입하였다.
17[luc2/Neo] vector (Promega)에 삽입하여 cloning하였다. 이렇게 생성한 NQO-1[luc/Neo] vector를 RAW 264.7 세포에 transfection 시킨 후 G418 (600㎍/ml, Invitrogen)을 처리하여 NQO-1[luc/Neo] vector가 성공적으로 삽입 된 RAW 264.7 cell을 선별하였다. 다음 Nrf2 활성제로 잘 알려진 sulforaphane에 대한 반응성이 가장 좋은 것을 골라 Nrf2 reporter cell line으로 사용했다.
한국생명공학연구원 한국식물추출물은행으로부터 GS의 부위별(잎, 줄기-심재, 줄기-수피, 씨앗, 꼬투리) 물 추출물을 제공받았으며 한국산, 중국산 GS는 광명당 (울산, 한국) 으로부터 구입하였다. 중량 500 g의 GS 꼬투리를 MeOH로 1일 간 상온에서 추출하고, 추출액을 감압농축 후 MeOH엑스를 증류수 1L로 현탁시키고 동량의 hexane, chloroform, ethylacetate 및 butanol의 순으로 용매분획하여 각각의 분획물을 얻었다.

데이터처리

실험자료들은 Graphpad (Inc., San Diego, CA) 프로그램을 이용하여 P values < 0.05 수준에서 one-way ANOVA분석을 통하여 분석하고 t-test를 통하여 사후 검정하였다.

이론/모형

다음 Nrf2 활성제로 잘 알려진 sulforaphane에 대한 반응성이 가장 좋은 것을 골라 Nrf2 reporter cell line으로 사용했다. Luciferase assay는 luciferase assay kit (Promega)를 가지고 제조사에서 제시한 방법에 준하여 실시하였다.
Total RNA는 QIAGEN RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여, 제조회사의 방법에 준하여 분리했다. 총 RNA의 2 ㎍을 M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하고 GAPDH 유전자의 cDNA의 양을 기준으로 각기 다른 샘플의 PCR 효율을 보정하였다.
위와 동일한 조건으로 RAW 264.7 cell에 GS의 부위별 물 추출물을 처리한 후 핵 단백질을 추출하여 핵 내 Nrf2 단백질을 western blotting 방법에 의하여 검사하였다. Luciferase activity의 결과와 동일하게 GS 꼬투리의 물 추출물에서 Nrf2 단백질의 강한 발현이 관찰되었으며, 줄기-수재와 씨앗에서도 Nrf2 단백질의 발현증가가 관찰되었다(Fig.
7세포를 10cm 배양 용기에 5 × 10⁶ 만큼 배양하여 준비하였다. 핵단백질은 NE-PER nuclear extraction kit (Thermo Scientific, IL, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 분리했다. 분리한 단백질은 Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 정량하였다.

성능/효과

Equal loading was attested by western blotting of lamin A/C, house keeping genes in the nucleus. (B) Expressions of representative genes governed by Nrf2, such as NQO-1, GCLC and HO-1, were measured by semi-quantitative RT-PCR . The intensity of each PCR band was measured by densitometer and software (ImageJ), and relative expression of each gene was normalized against that of GAPDH.
GS의 부위별 Nrf2 활성 효능을 관찰한 결과 GS는 잎이나 줄기, 씨앗에서는 Nrf2 활성효능이 관찰되지 않았으나, 꼬투리부분에서는 Nrf2 활성유도 효능이 관찰되었고, 용매분획결과 이 가운데 chloroform 분획물에서 가장 우수한 Nrf2 활성 효능을 지니고 있었다. 또한 한국산 GS가 중국산 GS보다 Nrf2 활성 효능이 우수하였다.
7 cell에 GS의 부위별 물 추출물을 처리한 후 핵 단백질을 추출하여 핵 내 Nrf2 단백질을 western blotting 방법에 의하여 검사하였다. Luciferase activity의 결과와 동일하게 GS 꼬투리의 물 추출물에서 Nrf2 단백질의 강한 발현이 관찰되었으며, 줄기-수재와 씨앗에서도 Nrf2 단백질의 발현증가가 관찰되었다(Fig. 1B).
본 연구에서는 GS의 꼬투리, 씨앗, 줄기-심재, 줄기-수피, 잎의 물 추출물을 이용하여 luciferase assay를 통해 Nrf2의 전사활성을 확인해 보았다. 그 결과 꼬투리 부위의 물 추출물이 Nrf2전사활성을 가진 것으로 나타났다(Fig. 1). 다음으로 Nrf2 전사활성에 영향을 미치는 GS 꼬투리의 성분을 더욱 효율적으로 얻을 수 있는 방법을 찾기 위해 중국산, 한국산 GS의 꼬투리를 유기용매인 MeOH, hexane, chloroform, ethylacetate 및 butanol의 순으로 용매분획 후 각각의 분획물을 사용하여 RAW 264.
7 cell에서의 Nrf2의 전사활성을 관찰하였다. 그 결과 모든 유기용매 추출물이 RAW 264.7 cell에서 Nrf2 전사활성이 증가하였으나, 한국산 GS의 분획물이 더 활성이 높았으며, 그 가운데 chloroform 분획물의 Nrf2 전사활성이 가장 우수했다(Fig. 2A). 이에 중국산, 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물을 RAW 264.
3A와 같이 50 ㎍/㎖ 농도의 처리군에서 두드러지게 증가하였다. 동일한 조건에서 총 RNA를 추출한 후 Nrf2 dependent 유전자로 알려진 NQO1, GCLC, HO-1에 대한 semi-quantitative RT-PCR을 시행한 결과 western blot 분석의 결과와 상응하게 50 ㎍/㎖에서 Nrf2-dependent 유전자의 발현이 관찰되었다.
4C). 따라서 이들의 Nrf2활성을 유도는 ROS의 생성과는 무관한 것임을 확인할 수 있었다.
GS의 부위별 Nrf2 활성 효능을 관찰한 결과 GS는 잎이나 줄기, 씨앗에서는 Nrf2 활성효능이 관찰되지 않았으나, 꼬투리부분에서는 Nrf2 활성유도 효능이 관찰되었고, 용매분획결과 이 가운데 chloroform 분획물에서 가장 우수한 Nrf2 활성 효능을 지니고 있었다. 또한 한국산 GS가 중국산 GS보다 Nrf2 활성 효능이 우수하였다. 한국산 GS 꼬투리부분의 chloroform 분획물은 Nrf2의 전사를 활성화시켰으며, 핵 내 Nrf2의 발현과 Nrf2-dependent 유전자 발현을 증가시켰을 뿐만 아니라 ROS의 생성을 유도하지도 않았다.
7 cell에 16 시간 동안 처리한 후 western blot assay와 RT-PCR assay를 시행하였고, 미처리군을 음성대조군으로 SFN처리군을 양성대조군으로 설정하였다. 실험 결과 Nrf2의 핵내 발현은 Fig. 3A와 같이 50 ㎍/㎖ 농도의 처리군에서 두드러지게 증가하였다. 동일한 조건에서 총 RNA를 추출한 후 Nrf2 dependent 유전자로 알려진 NQO1, GCLC, HO-1에 대한 semi-quantitative RT-PCR을 시행한 결과 western blot 분석의 결과와 상응하게 50 ㎍/㎖에서 Nrf2-dependent 유전자의 발현이 관찰되었다.
7 cell에서 핵 내 Nrf2의 발현을 증가시키는지 확인하고자 western blot assay를 시행하였다. 실험 결과 선행한 luciferase assay와 마찬가지로 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물은 50 ㎍/㎖의 농도에서 핵 내 Nrf2의 발현을 뚜렷하게 증가시켰다(Fig. 3A). 이어서 Nrf2에 의존적으로 발현하는 효소인 GCLC, NQO1, HO1의 mRNA 발현을 RT-PCR assay를 통하여 관찰하였다.
7 세포에 처리 한 후 ROS의 생성을 측정하였다. 실험결과 GS 꼬투리의 chloroform 분획물의 고농도 처리군(50 ㎍/㎖)에서 세포내 ROS의 생성을 증가시키지 않았다(Fig. 4C). 따라서 이들의 Nrf2활성을 유도는 ROS의 생성과는 무관한 것임을 확인할 수 있었다.
7 cell 처리한 후 luciferase assay를 시행하였고, 양성대조군으로는 5 μ㏖의 SFN을 사용하였다. 실험결과 중국산 GS보다 한국산 GS의 모든 분획물의 Nrf2 전사활성이 더 두드러졌으며, 분획물 가운데 한국산 GS의 chloroform층의 분획물에서 Nrf2 전사활성을 가장 우수하게 유도하였다(Fig. 2A).
4C). 이러한 결과는 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물이 ROS의 생성과 관계없이 직접적으로 Nrf2의 활성을 유도하였음을 시사한 것이다.
이상의 결과 Nrf2를 활성효능은 GS의 꼬투리 부위의 주요한 성분에 의한 것임을 유추할 수 있었고, 이들의 Nrf2 활성화 기전이 ROS의 생성과 상관없음을 확인하였다. 이상의 연구 결과를 바탕으로 GS 꼬투리를 이용한 Nrf2 매개 항산화, 항염증 효능에 대한 전임상 연구를 심화시켜 나갈 수 있을 것으로 기대된다.
2A). 이에 중국산, 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물을 RAW 264.7 cell에 농도별로 처리한 후 Nrf2의 전사활성을 관찰한 결과 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물의 Nrf2에 대한 전사활성이 더 높았으며, 50 ㎍/㎖의 농도에서 유의성 있는 전사 활성의 유도를 관찰할 수 있었다(Fig. 2B). 이처럼 luciferase assay의 실험 결과 한국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물이 가장 우수한 Nrf2 전사활성을 가지고 있는 것으로 관찰되어, 이들이 RAW 264.
이에 한국산 중국산 GS 꼬투리의 chloroform 분획물을 농도별로 (0, 10, 20, 50 ㎍/㎖)동일한 조건에서 처리한 후 reporter gene assay를 시행한 결과 한국산 GS 꼬투리의 chloroform층의 고농도(50 ㎍/㎖)에서 SFN와 유사한 정도의 Nrf2 활성을 유도하고 있음을 확인하였다(Fig. 2B)

후속연구

이상의 결과 Nrf2를 활성효능은 GS의 꼬투리 부위의 주요한 성분에 의한 것임을 유추할 수 있었고, 이들의 Nrf2 활성화 기전이 ROS의 생성과 상관없음을 확인하였다. 이상의 연구 결과를 바탕으로 GS 꼬투리를 이용한 Nrf2 매개 항산화, 항염증 효능에 대한 전임상 연구를 심화시켜 나갈 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	GS는 어떤 병증의 치료에 사용되었는가?	GS는 주로 객담을 수반하는 기침 및 천식, 두통, 중풍을 치료하는데 사용해왔으며12), GS에서 추출되는 Saponin은 항궤양, 항염증 및 항알러지 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다30). 본 연구에서는 항염증 및 항알러지 작용에 관여하는 것으로 알려진 GS의 부위별 효능을 Nrf2 전사인자의 활성화와 연관하여 평가하고자 하였다.
	유전자들의 발현을 조절하는 중요한 전사인자 Nrf2의 결핍은 어떤 병증과 연관을 보이는가?	Nrf2는 평상시 cytoskeleton과 결합하고 있는 단백질인 Keap1에 의하여 세포질에 격리되어 있다가 산화적 스트레스 상황에 직면하게 되면 재빨리 Keap1과 분리되어 핵 안으로 들어가 ARE(antioxidant response elements)와 결합하며, 이어서 phase II enzyme 유전자 들의 전사를 활성화시키고, 이어서 hemeoxygenase-1(HO-1), NADPH quinone oxidoreductase 1 (NQO1), glutamate-cystein ligase subunit (GCLC) 등의 항산화 효소들을 만들어 낸다24-27). 또한 Nrf2의 결핍은 자가면역질환, 천식, 폐기종, 및 급성호흡부전증후군과 연관되어 있으며, 또한 위장관, 순환기계통, 신경계통 등 여러 신체 부위의 염증과도 연관되어 있다28). Nrf2는 폐에 편재하여 발현되고 있으며, 폐에서 생성되는 ROS를 억제함으로써, 폐기종, 천식, 폐암 등 다양한 호흡기 질환에 의한 산화적 손상으로부터 폐를 보호하고 있다29).
	皂莢이란 무엇인가?	皂莢(Gleditsia sinensis; 이하 GS)은 콩과(Leguminosae)에 속한 낙엽교목인 조각자나무 Gleditsia sinensis Lam.의 果實로性味는 溫辛하고 小毒이 있으며, 祛痰開竅, 散結消腫의 효능이 있다11). 頑痰이 阻塞되어 胸悶喘咳하고 喀痰이 잘 배출되지 않은 증상에 비교적 강한 祛痰작용이 있고, 갑자기 昏迷하여 口噤不開하거나 癲癎에 痰의 壅盛으로 關竅가 阻閉한 證과 腸燥便秘를 치료하는 것으로 알려져 있다12).

참고문헌 (37)

Itoh, K., Ishii, T., Wakabayashi, N., Yamamoto, M. Regulatory mechanisms of cellular response to oxidative stress. Free Radic Res 31: 319-324, 1999.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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