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문제 정의
- . 따라서 본 연구에서는 인체 유방암세포주인 MCF-7 세포를 대상으로 하여 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母의 단독처리 및 복합처리에 따른 함암효과를 확인하기 위하여 각각의 시료들이 유발하는 세포독성 정도를 확인하였으며, 이들 중 세포독성 효과가 뛰어난 시료가 apoptosis 유발에 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다.
- 본 연구에서는 白花蛇舌草, 山慈姑 및 浙貝母가 유방암에서 유발하는 항암효능을 확인하기 위하여 유방암 세포주인 MCF-7세포를 이용하여 白花蛇舌草, 山慈姑 및 浙貝母의 단독처리 및 복합처리에 따른 세포의 생존율 및 증식에 미치는 영향과 그에 따른 형태변화를 조사하였고 apoptosis 유발 및 세포주기의 변화 여부를 확인하기 위하여 핵의 형태변화, DNA flow cytometry를 이용한 세포주기 변화 및 sub-G1기의 비율 확인과 더불어 DNA 단편화 현상 등을 조사하였다.
제안 방법
- 먼저 세포 배양용 6 well plate에 MCF-7 세포를 1 X 105 개/ml 씩 분주하여 적정농도로 처리하였다. 72 시간 동안 각각의 시료에 노출시킨 다음 시각적인 성장억제 정도와 형태변화 정도를 200 배의 배율로 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하고 차이점을 비교 분석하였다.
- Apoptosis 유발 신호에 의하여 활성화되는 endonuclease에의하여 형성되는 DNA fragmentation의 분석을 위하여 정상배지에서 자란 세포와 白花蛇舌草가 처리된 배지에서 자란 세포들을 모은 다음 원심분리를 이용하여 상층액을 제거하였다. 상층액이 제거된 세포에 850 μl의 lysis buffer [5 mM Tris-HCl (pH 7.
- Apoptosis 유발 여부를 확인할 수 있는 방법 중 하나인 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색을 통한 핵의 형태적 변화를 조사하기 위하여 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母 처리된 세포를 모은 다음 상층액을 제거하고 PBS를 1 : 9의 비율로 희석된 37% formaldehyde 용액으로 만든 fixing solution을 처리하여 30분 동안 고정하였다.
- PI로 염색된 세포를 PBS를 이용하여 세척하고 35 μm pore size의 nylon mesh를 이용하여 단일 세포로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software와 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母의 단독처리 및 복합처리에 따른 MCF-7 세포의 생존율 감소 현상을 재확인하기 위하여 MTT assay를 이용한 세포의 viability를 확인하였다. Viability 확인을 위하여 상기와 동일한 방법으로 세포를 6 well plate에 접종하고, 안정화시킨 후 각각의 시료를 처리하여 72 시간 동안 배양하였다.
- 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母의 단독처리 및 복합처리에 따른 암세포의 성장 및 형태변화는 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 시각적으로 확인하였다. 먼저 세포 배양용 6 well plate에 MCF-7 세포를 1 X 105 개/ml 씩 분주하여 적정농도로 처리하였다.
- 반응이 끝난 후 14,000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리 시킨 후 상층액을 제거하고 남은 pellet에 RNase A가 포함되어 있는 20 μl의 diethyl pyrocarbonate (DEPC) water를 이용하여 pellet을 녹이고 6X DNA gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)를 첨가하여 DNA sample을 만들었다.
- 본 실험에 사용된 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母는 세척하여 불순물을 제거한 후 건조시키고 분쇄하였다. 분쇄된 각각의 시료들의 추출을 위하여 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母 100 g에 증류수 1 L를 첨가하여 180-200℃로 3시간 가열한 후 원심분리하여 찌꺼기를 제거한 다음 상층액만 분리하였다. 분리된 상층액은 Whatman 필터(No.
- 5 g의 고형성분을 얻었다. 상기와 같은 방법으로 얻어진 고형성분은 실험 시 3차 증류수에 녹여 100 mg/ml의 농도로 만들고 단독처리군의 경우에는 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母를 적정 농도로 성장배지에 희석하여 세포에 처리하였고, 복합처리군의 경우에는 각각의 시료를 동량으로 섞은 다음 적정 농도로 성장배지에 희석하여 세포에 처리하였다.
- 05% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시켜 원심분리를 이용하여 상층액을 제거한 세포만 모은 다음 1 ml의 phosphate-buffered saline (PBS)로 세포를 부유시켰다. 여기에 동량의 0.5% trypan blue solution (Gibco BRL)을 처리하여 2 분간 염색시킨 다음 hemocytometer를 이용하여 염색이 되지 않은 살아있는 세포의 수를 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 계수하였다.
- 5 μg/ml 농도의 DAPI 용액을 처리하여 세포의 핵을 20 분 간 염색하였다. 염색이 끝난 후 증류수 및 PBS를 이용하여 염색이 되지 않은 DAPI 용액을 제거하고 충분히 말린 다음 mounting solution을 처리하고 형광 현미경(fluorescene microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다. 형광 현미경을 이용한 핵의 관찰은 400 배 배율로 실시하였으며, Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.
- 반응이 끝난 후 14,000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리 시킨 후 상층액을 제거하고 남은 pellet에 RNase A가 포함되어 있는 20 μl의 diethyl pyrocarbonate (DEPC) water를 이용하여 pellet을 녹이고 6X DNA gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)를 첨가하여 DNA sample을 만들었다. 이렇게 만들어진 DNA sample을 1.6% agarose gel에 loading하고 50 V에서 2 시간 정도 전기영동 시킨 후 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색하여 ultra vilolet (UV) 하에서 사진 촬영하여 DNA fragmentation 여부를 확인하였다.
- 염색이 끝난 후 증류수 및 PBS를 이용하여 염색이 되지 않은 DAPI 용액을 제거하고 충분히 말린 다음 mounting solution을 처리하고 형광 현미경(fluorescene microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다. 형광 현미경을 이용한 핵의 관찰은 400 배 배율로 실시하였으며, Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.
- 회전교반이 끝난 후 14,000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음 DNA와 RNA가 포함되어 있는 상층액 600 μl를 분리하여 300 μl의 100% isopropanol (Sigma)과 100 μl의 5 M NaCl를 첨가하고 4℃에서 24 시간 동안 반응시켜 DNA와 RNA를 고형화 시켰다.
대상 데이터
- 본 실험을 위하여 동의대학교 부속 한방병원에서 제공받은白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母를 아래와 같은 방법으로 추출한 후 사용하였다. 본 실험에 사용된 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母는 세척하여 불순물을 제거한 후 건조시키고 분쇄하였다. 분쇄된 각각의 시료들의 추출을 위하여 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母 100 g에 증류수 1 L를 첨가하여 180-200℃로 3시간 가열한 후 원심분리하여 찌꺼기를 제거한 다음 상층액만 분리하였다.
- 본 실험에 사용한 인체 유방암 세포주인 MCF-7 세포(American Type Culture Collection;ATCC, Rockville, MD, USA)는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA), 2 mM glutamine (Gibco BRL), 100 U/ml penicillin (Gibco BRL) 및 100 μg/ml streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 RPMI-1640 (Gibco BRL) 배지를 성장배지로 사용하여, 5% CO2, 37℃의 조건의 배양기를 사용하여 배양하였으며, 배양 접시의 전체 면적 중 90% 정도의 밀도에 도달하였을 경우 0.05% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (trypsin-EDTA, Gibco-BRL)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 적정수의 세포를 분주하여 재배양하였다.
- 본 실험을 위하여 동의대학교 부속 한방병원에서 제공받은白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母를 아래와 같은 방법으로 추출한 후 사용하였다. 본 실험에 사용된 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母는 세척하여 불순물을 제거한 후 건조시키고 분쇄하였다.
데이터처리
- 각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성 검증은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 한 후, Student t-test와 Duncan's multiple range test를 이용하여 p＜0.05 수준에서 검증하였다.
- 상기의 모든 실험 결과는 SPSS ver. 18.0 통계 프로그램을 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타냈다.
이론/모형
- 유방암 세포주인 MCF-7 세포에서 白花蛇舌草, 山慈姑, 浙貝母의 단독처리 및 복합처리에 따른 세포의 생존율을 확인하기 위하여 trypan blue 염색법을 사용하여 측정하였다. 먼저 MCF-7세포를 1 X 105 개/ml 씩 분주한 다음 72 시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- DNA flow cytometry를 이용하여 sub-G1기에 해당하는 세포를 측정한 결과는 Fig. 7A에 나타낸 바와 같이 白花蛇舌草를 처리하지 않았을 경우에는 sub-G1기의 빈도가 약 1.11%로 나타났으며, 0.6 mg/ml 처리군까지는 큰 변화가 나타나지 않았지만, 0.8 mg/ml, 1 mg/ml의 白花蛇舌草를 처리하였을 경우에는 sub-G1기의 빈도가 각각 4.5%, 12.25%로 나타나 고농도 처리군에서 약하게 sub-G1기의 빈도가 증가한다는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 Fig.
- MCF-7 세포핵의 형태변화를 확인함으로서 apoptosis 유발 여부를 조사한 결과 白花蛇舌草 단독처리군에서 밀도 감소현상이 유발되었지만 apoptosis 유발의 증거가 거의 나타나지 않는 것으로 확인되었고(Fig. 4), DNA flow cytometry로 세포주기의 변화 및 apoptosis 유발 정도를 확인한 결과 G1기에서의 세포주기 억제가 나타났지만 apoptosis는 고농도 처리군에서 약하게 나타났다(Fig. 5, 6 및 7A). DNA flow cytometry에 의하여 확인된 apoptosis 유발을 재확인하기 위하여 DNA 단편화 현상 정도를 조사해보니 白花蛇舌草 처리군에서 DNA 단편화 현상이 거의 나타나지 않았다(Fig.
- endonuclease에 의한 DNA 단편화 현상을 본 결과는 Fig. 7B에서 나타낸 바와 같이 전체적으로 DNA 단편화 현상이 나타나지 않았으며, 생존율 감소가 뚜렷한 1 mg/ml 농도에서 DNA가 끌리는 현상이 나타났지만 그 정도가 약한 것을 볼 수 있다. 따라서 상기 실험 내용과 종합해보면 白花蛇舌草는 MCF-7 세포에서 apoptosis 유발의 영향보다는 G1기에서의 세포주기 억제를 유발함으로서 생존율 감소, 증식억제 및 형태변화에 관여한다는 것을 알 수 있었다.
- trypan blue 염색법을 사용하여 세포의 생존율 변화를 확인한 결과 白花蛇舌草 단독처리군에서만 생존율 감소 현상이 강하게 유발되었고(Fig. 1), MTT assay를 이용하여 세포의 viability를 확인한 결과 마찬가지로 白花蛇舌草 단독처리군에서 성장억제가 유발되었다(Fig. 2). 이러한 생존율 감소 및 성장억제 현상이 세포의 형태에 어떠한 영향을 미치는지를 확인한 결과 저농도의 白花蛇舌草 단독처리군에서만 세포밀도 감소와 함께 형태변화가 나타났다(Fig.
- 山慈姑, 浙貝母는 MCF-7 세포의 생존율에 큰 영향을 주지 못하는 반면 白花蛇舌草는 MCF-7 세포의 생존율을 감소시켰으며, 세포 증식 억제 실험에서도 동일한 결과를 볼 수 있었고, 두 실험 모두 복합처리시 山慈姑와 浙貝母는 白花蛇舌草의 효능을 감소시킨 것으로 나타났다. 세포 관찰시 白花蛇舌草 단독처리군에서 세포의 밀도감소, 형태변화를 유발하였다.
- 3에 나타난 바와 같다. 白花蛇舌草 단독처리군의 경우에는 처리농도의 증가에 따라 부착력을 잃고 부유하는 세포는 거의 관찰되지 않았지만 전체적인 세포의 밀도 감소와 함께 세포의 모양이 길어지는 형태변화가 나타났다. 山慈姑와 浙貝母의 단독처리군 및 복합처리군에서는 세포의 밀도에도 거의 변화가 없었으며, 세포의 형태변화도 나타나지 않았다.
- 5 및 6에서와 같다. 白花蛇舌草를 처리하였을 경우에 G1기에 해당하는 세포의 빈도가 현저하게 증가되었으며, 반면에 S기 및 G2/M기에 해당하는 세포의 빈도는 감소하였고, 따라서 MCF-7 세포에서 白花蛇舌草에 의하여 유발되는 생존율 감소, 성장억제 및 형태변화 등과 같은 여러 가지 현상들은 G1기에서의 세포주기 억제와 밀접한 관련이 있다는 것을 알 수 있었다.
- 1에 나타난 바와 같다. 결과를 살펴보면 山慈姑와 浙貝母는 MCF-7 세포의 생존율에 큰 영향을 주지 못하는 반면 白花蛇舌草는 MCF-7 세포의 생존율을 감소시켰고, 山慈姑와 浙貝母가 포함되어 있는 단독처리군 및 복합처리군에서 白花蛇舌草가 약간의 생존율 감소현상을 유발시켰다.
- 5, 6의 DNA flow cytometry 결과처럼 생존율 감소 현상은 대부분 G1기에서의 세포주기 억제와 관련이 있었으므로 白花蛇舌草와 관련된 세포의 생존율이 뚜렷하게 감소한 1 mg/ml 농도에서도 apoptosis와의 관련성은 미약하다고 볼 수 있다. 따라서 MCF-7 세포에서 白花蛇舌草에 의하여 유발 되는 생존율 감소, 성장억제 및 형태변화 등과 같은 여러 가지 변화들은 apoptosis 유발 보다는 G1기에서의 세포주기 억제가 중요하게 작용한다는 것을 예상 할 수 있었다.
- 7B에서 나타낸 바와 같이 전체적으로 DNA 단편화 현상이 나타나지 않았으며, 생존율 감소가 뚜렷한 1 mg/ml 농도에서 DNA가 끌리는 현상이 나타났지만 그 정도가 약한 것을 볼 수 있다. 따라서 상기 실험 내용과 종합해보면 白花蛇舌草는 MCF-7 세포에서 apoptosis 유발의 영향보다는 G1기에서의 세포주기 억제를 유발함으로서 생존율 감소, 증식억제 및 형태변화에 관여한다는 것을 알 수 있었다.
- 4에 나타난 바와 같이 白花蛇舌草 단독처리군의 경우에는 전체적으로 핵의 밀도가 현저하게 감소하였다. 또한 apoptotic body 형성 및 DAPI의 투과성 증가에 따른 빛의 강도 증가 현상은 약하게 나타났고, 白花蛇舌草가 포함된 복합처리군에서는 빛의 강도 증가 현상은 거의 나타나지 않았다. 한편 山慈姑와 浙貝母의 단독처리군 및 복합처리군에서는 핵의 밀도 및 형태에 아무런 변화가 나타나지 않았다.
- 2에서 나타나 있다. 상기 생존율 감소현상 결과와 비슷하게 山慈姑와 浙貝母의 경우에는 본 연구에 사용된 농도에서 MCF-7 세포의 증식을 억제하지 못하였지만 白花蛇舌草는 강력한 증식억제 효능을 가지고 있다는 것을 알 수 있었으며, 山慈姑 및 浙貝母는 白花蛇舌草가 가지고 있는 증식억제 효과를 억제한다는 것을 예상할 수 있었다.
- 한편 山慈姑와 浙貝母의 단독처리군 및 복합처리군에서는 핵의 밀도 및 형태에 아무런 변화가 나타나지 않았다. 이러한 결과를 살펴볼 때 白花蛇舌草가 MCF-7 세포에서 유발하는 생존율 감소, 성장억제 및 형태변화는 apoptosis 유발에 의한 현상이 아니라 또 다른 요인이 관여한다는 것을 예상할 수 있었다.
- 2). 이러한 생존율 감소 및 성장억제 현상이 세포의 형태에 어떠한 영향을 미치는지를 확인한 결과 저농도의 白花蛇舌草 단독처리군에서만 세포밀도 감소와 함께 형태변화가 나타났다(Fig. 3).
- 이상의 결과를 종합해보면 白花蛇舌草가 생존율 감소 및 성장억제 현상을 강하게 유발하였으며, 이러한 현상은 apoptosis 유발보다는 주로 G1기에서의 세포주기 억제에 의하여 일어났다. 따라서 白花蛇舌草는 인체 유방암 세포의 항암 효능에 대한 기초 자료로서 그 가치가 높을 것으로 생각되며, 향후 이와 연관된 분자생물학적 기전에 대한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 판단되며, 白花蛇舌草와 다른 약물의 복합처리시 그 효능의 감소를 보인 것에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 보인다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해보면 白花蛇舌草가 생존율 감소 및 성장억제 현상을 강하게 유발하였으며, 이러한 현상은 apoptosis 유발보다는 주로 G1기에서의 세포주기 억제에 의하여 일어났다. 따라서 白花蛇舌草는 인체 유방암 세포의 항암 효능에 대한 기초 자료로서 그 가치가 높을 것으로 생각되며, 향후 이와 연관된 분자생물학적 기전에 대한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 판단되며, 白花蛇舌草와 다른 약물의 복합처리시 그 효능의 감소를 보인 것에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 보인다.
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