본 연구에서는 전통발효식품 13종과 천연물 4종에서 27균주를 분리한 후 생육속도가 빠르고 pH 저하 능력이 우수한 3종의 균주를 1차 선발하였으며, 분자생물학적 방법을 이용하여 동정한 결과 Staphylococcus warneri, Sta. epidermidis, Lactobacillus plantarum과 99% 상동성을 보였다. 선발된 3균주의 발효소시지 스타터로서 이용가능성을 알아보기 위해 발효소시지의 환경과 유사한 model-system에서 배양하며 pH 저하 능력, 총산 생성 능력, 생육 능력, 아질산염 소거 능력을 발효소시지의 스타터로 많이 사용되고 있는 5균주 및 상업용 2균주와 비교하였다. Modelsystem에서 pH 저하능과 총산 생성능, 생육능은 관련성이 있었으며, 상업용 균주보다 분리한 Sta. epidermidis DO 10-1, Lac. plantarum MLK 14-2가 우수한 결과를 나타내었다. 아질산염 소거능의 경우에도 분리한 3균주가 상업용 균주보다 상대적으로 빠른 속도를 보였다. 분리한 3균주는 발효소지지 스타터로서의 발효 소거 능력은 우수할 것으로 보이지만 Staphylococcus는 잠재적인 위험성이 제기되는 균주이므로 Lac. plantarum이 발효소지지 제조에 가장 적합할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 전통발효식품 13종과 천연물 4종에서 27균주를 분리한 후 생육속도가 빠르고 pH 저하 능력이 우수한 3종의 균주를 1차 선발하였으며, 분자생물학적 방법을 이용하여 동정한 결과 Staphylococcus warneri, Sta. epidermidis, Lactobacillus plantarum과 99% 상동성을 보였다. 선발된 3균주의 발효소시지 스타터로서 이용가능성을 알아보기 위해 발효소시지의 환경과 유사한 model-system에서 배양하며 pH 저하 능력, 총산 생성 능력, 생육 능력, 아질산염 소거 능력을 발효소시지의 스타터로 많이 사용되고 있는 5균주 및 상업용 2균주와 비교하였다. Modelsystem에서 pH 저하능과 총산 생성능, 생육능은 관련성이 있었으며, 상업용 균주보다 분리한 Sta. epidermidis DO 10-1, Lac. plantarum MLK 14-2가 우수한 결과를 나타내었다. 아질산염 소거능의 경우에도 분리한 3균주가 상업용 균주보다 상대적으로 빠른 속도를 보였다. 분리한 3균주는 발효소지지 스타터로서의 발효 소거 능력은 우수할 것으로 보이지만 Staphylococcus는 잠재적인 위험성이 제기되는 균주이므로 Lac. plantarum이 발효소지지 제조에 가장 적합할 것으로 사료된다.
The aim of this study was to select the most suitable starter cultures for production of fermented sausages. A total of 27 strains isolated from Korean fermented foods and natural substances were characterized with respect to their physicochemical properties in a fluid (submerged) model system modif...
The aim of this study was to select the most suitable starter cultures for production of fermented sausages. A total of 27 strains isolated from Korean fermented foods and natural substances were characterized with respect to their physicochemical properties in a fluid (submerged) model system modified according to the special conditions of fermented sausages. Three of these strains were pre-selected for testing as potential cultures based on their ability to grow fast and initiate rapid acidification. The selected strains were identified by API and partial sequence analysis of 16S rRNA. The results exhibited sequence similarity to known sequences of Staphylococcus warneri, Staphylococcus epidermidis and Lactobacillus plantarum. Among them, relatively good growth properties and nitrite reduction activities were detected for S. epidermidis and L. plantarum and low pH values and high total acidities were observed in the model system fermented with these isolates compared with reference strains.
The aim of this study was to select the most suitable starter cultures for production of fermented sausages. A total of 27 strains isolated from Korean fermented foods and natural substances were characterized with respect to their physicochemical properties in a fluid (submerged) model system modified according to the special conditions of fermented sausages. Three of these strains were pre-selected for testing as potential cultures based on their ability to grow fast and initiate rapid acidification. The selected strains were identified by API and partial sequence analysis of 16S rRNA. The results exhibited sequence similarity to known sequences of Staphylococcus warneri, Staphylococcus epidermidis and Lactobacillus plantarum. Among them, relatively good growth properties and nitrite reduction activities were detected for S. epidermidis and L. plantarum and low pH values and high total acidities were observed in the model system fermented with these isolates compared with reference strains.
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문제 정의
본 연구에서는 전통발효식품과 천연물에 존재하는 젖산균 27종을 분리하고 발효소시지와 유사한 환경(model-system)에서 배양하며 생육 능력, pH 저하 능력, 산 생성 능력 및 아질산염 소거 능력 등을 분석하여 발효소시지 제조에 적합한 균주를 선발하고 동정하여 향후 발효소시지 제조에 실제 적용하기 위한 스타터를 개발하고자 한다.
제안 방법
Model-system에서 생육속도와 pH 저하 능력, 산 생성 능력, 아질산염 소거 능력이 우수한 균주 3종을 선발하였고, API 50CHL kit(API bioMerieux, Marcy-l'Etoil, France)와 16S rRNA sequencing은 KCCM(Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였다.
Model-system에서 젖산균을 배양한 후 배양 0, 4, 8, 12, 24시간에 샘플을 채취하였고 이후 168시간까지는 매 24시간마다 샘플을 채취하였다. 흡광도 값이 0∼1.
Model-system에서 젖산균의 생육곡선을 흡광도를 이용하여 측정하였으며 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 대부분의 균이 배양 168시간에 최대 흡광도에 도달하였으나, 도달하는 시간 및 도달 후 유지되는 양상은 균주에 따라 달랐다.
Lee 등(5)의 연구를 참고하여 발효소시지 제조와 유사한 model-system을 제조하였다. Model-system은 beef extract(12.0 g/L), glucose(10.0 g/L), NaCl(20.0 g/L), dipotassium hydrophosphate(2.0 g/L), MgSO4･7H2O(0.15 g/L), nitrite(0.15 g/L)로 구성하였으며, 초기 pH는 0.5 NHCl을 이용하여 5.8로 조정하였다. 각 젖산균은 Lactobacilli MRS broth를 이용하여 37°C에서 48시간 전 배양 후 model-system에 접종하였으며, 접종 시 초기 균수는 106~107 CFU/mL였고 20°C에서 168시간 동안 배양하며 시간대별로 샘플(50 mL)을 채취하여 분석하였다.
2 사이가 되도록 증류수로 희석한 뒤 spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 미생물 생육곡선을 작성하였다. pH는 pH meter(pH-250L, ISTEK, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였고, 총산도는 시료 1 mL를 증류수 4 mL에 가하여 희석한 후 0.1 N NaOH를 이용하여 적정하였으며, 이때 소요된 NaOH 소비량을 lactic acid(%)로 환산하여 계산하였다.
각 젖산균은 Lactobacilli MRS broth를 이용하여 37°C에서 48시간 전 배양 후 model-system에 접종하였으며, 접종 시 초기 균수는 106~107 CFU/mL였고 20°C에서 168시간 동안 배양하며 시간대별로 샘플(50 mL)을 채취하여 분석하였다.
plantarum과 유사한 것으로 판정되었다. 균의 상태에 따라 탄소원을 기질로 발효가 일어나는 조건이 조금씩 다를 수 있으므로 보다 정확한 결과를 확인하기 위해 16S rRNA sequence를 분석하고 이를 Gene Bank에 등록된 여러 젖산균들과 상동성을 비교하였다. 분리균주의 16S rRNA sequencing 결과 KI 7-3은 Sta.
발효소시지 제조를 위한 스타터를 발굴하기 위해 김치류 10종류, 젓갈류 및 장아찌류 3종류, 기타 천연물 4종류(fermented blueberry juice, black garlic vinegar, mozzarella cheese, neonate faces)를 수집하여 멸균한 생리식염수(0.9%)에 희석, 현탁하여 그 상등액을 Lactobacilli MRS agar(Difco, Detroit, Sparks, MD, USA) plate에 도말한 후 37°C에서 48시간 배양하였다.
배양 후 집락을 관찰하면서 single colony를 2회 계대 배양하여 총 27종을 분리하였고 4°C에서 보관하며 사용하였다.
Model-system에서의 결과를 바탕으로 생육속도가 빠르고 pH 저하 효과가 우수하며, 총산도가 높은 균주 3종을 선발하고 KI 7-3, DO 10-1, MLK 14-2로 명명하였다. 분리한 3종의 균주가 발효소시지 제조를 위한 스타터로서 적합한지 알아보기 위해 상업용 균주 2종과 발효소시지 제조에 주로 사용하는 균주 5종과 비교하여 model-system에서의 발효패턴을 분석하였다.
epidermidis, Lactobacillus plantarum과 99% 상동성을 보였다. 선발된 3균주의 발효소시지 스타터로서 이용가능성을 알아보기 위해 발효소시지의 환경과 유사한 model-system에서 배양하며 pH 저하 능력, 총산 생성 능력, 생육 능력, 아질산염 소거 능력을 발효소시지의 스타터로 많이 사용되고 있는 5균주 및 상업용 2균주와 비교하였다. Model-system에서 pH 저하능과 총산 생성능, 생육능은 관련성이 있었으며, 상업용 균주보다 분리한 Sta.
아질산염의 정량은 Kato 등(14)의 방법을 변형하여 다음과 같이 실시하였다. 시료 1 mL를 취하여 2% acetic acid 용액 5 mL, Griess 시약(30% acetic acid로 각각 조제한 1% sulfanilic acid와 1% naphthylamine을 1:1비로 혼합) 0.4 mL를 가하여 잘 혼합한 다음 실온에서 15분간 방치시킨 후 spectrophotometer를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정한 후 미리 작성한 검량선으로부터 아질산염 농도를 산출하였다. 아질산염 소거율은 배양 전의 아질산염 농도에 대한 배양 후의 농도를 백분율로 산출하였다.
4 mL를 가하여 잘 혼합한 다음 실온에서 15분간 방치시킨 후 spectrophotometer를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정한 후 미리 작성한 검량선으로부터 아질산염 농도를 산출하였다. 아질산염 소거율은 배양 전의 아질산염 농도에 대한 배양 후의 농도를 백분율로 산출하였다.
흡광도 값이 0∼1.2 사이가 되도록 증류수로 희석한 뒤 spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 미생물 생육곡선을 작성하였다.
대상 데이터
상대적인 비교를 위한 대조구로는 실제로 상용되고 있는 발효소시지 starter culture인 LS-25(LS-25, BITEC, Ontario, Canada), RPS(Roh Pokel Star, VAN HEES®, Walluf, Germany)와 실제 발효소시지 제조에 주로 이용되는 젖산균 5종류를 KCTC(Daejeon, Korea)로부터 분양받아 사용하였다(Lac. plantarum KCTC 3104, Lac. curvatus KCTC 3767, Lac. sakei KCTC 3598, Ped. acidilactici KCTC 1624, Ped. pentosaceus KCTC 3116).
이론/모형
Phylogenetic analysis of the isolate based on 16S rRNA gene sequences of other LAB. The tree was constructed by using the neighbor-joining method based on partial 16S rRNA sequences. The scale bar indicates the 0.
성능/효과
발효소시지 제조를 위한 스타터를 선발하기 위해서는 빠른 생육속도와 pH 저하 능력을 갖는 것이 무엇보다 중요하다(3). Model-system에서의 결과를 바탕으로 생육속도가 빠르고 pH 저하 효과가 우수하며, 총산도가 높은 균주 3종을 선발하고 KI 7-3, DO 10-1, MLK 14-2로 명명하였다. 분리한 3종의 균주가 발효소시지 제조를 위한 스타터로서 적합한지 알아보기 위해 상업용 균주 2종과 발효소시지 제조에 주로 사용하는 균주 5종과 비교하여 model-system에서의 발효패턴을 분석하였다.
coli, Salmonella, Staphylococcus와 같은 부패미생물의 성장을 억제시키고 제품의 저장 안정성을 증가(16)시키는 역할을 한다. Model-system의 환경은 실제 발효소시지를 제조하는 환경과는 다르지만 pH 결과만을 본다면 분리한 3종의 균주는 발효소시지 스타터로서 적합할 것으로 사료된다.
배양 168시간까지 아질산염 함량이 지속적으로 낮아지는 모습을 보였으며, 최종적으로 Lac. curvatus를 배양한 실험구가 잔존 아질산염 함량이 15.23%로 가장 낮은 함량을 보였다. Lac.
본 연구에서는 전통발효식품 13종과 천연물 4종에서 27균주를 분리한 후 생육속도가 빠르고 pH 저하 능력이 우수한 3종의 균주를 1차 선발하였으며, 분자생물학적 방법을 이용하여 동정한 결과 Staphylococcus warneri, Sta. epidermidis, Lactobacillus plantarum과 99% 상동성을 보였다. 선발된 3균주의 발효소시지 스타터로서 이용가능성을 알아보기 위해 발효소시지의 환경과 유사한 model-system에서 배양하며 pH 저하 능력, 총산 생성 능력, 생육 능력, 아질산염 소거 능력을 발효소시지의 스타터로 많이 사용되고 있는 5균주 및 상업용 2균주와 비교하였다.
분양받은 5종의 균주 모두 발효 24시간까지는 총산도의 증가가 미미했으나, 그 이후 급격하게 총산도가 증가하는 경향을 나타내었다. pH 측정 결과에서 나타난 것처럼 상업용 두 균주는 배양 0시간부터 총산도가 지속적으로 증가되었으며, 분리한 3균주는 배양 24시간 이후 총산도가 급격히 증가하는 것이 관찰되었다. 특히 DO 10-1과 MLK 14-2는 배양 72시간 이후에는 상업용 균주들보다 더 높은 총산도 값을 보였다.
2). 분양받은 5종의 균주 모두 발효 24시간까지는 총산도의 증가가 미미했으나, 그 이후 급격하게 총산도가 증가하는 경향을 나타내었다. pH 측정 결과에서 나타난 것처럼 상업용 두 균주는 배양 0시간부터 총산도가 지속적으로 증가되었으며, 분리한 3균주는 배양 24시간 이후 총산도가 급격히 증가하는 것이 관찰되었다.
plantarum MLK 14-2가 우수한 결과를 나타내었다. 아질산염 소거능의 경우에도 분리한 3균주가 상업용 균주보다 상대적으로 빠른 속도를 보였다. 분리한 3균주는 발효소지지 스타터로서의 발효 소거 능력은 우수할 것으로 보이지만 Staphylococcus는 잠재적인 위험성이 제기되는 균주이므로 Lac.
발효소시지 스타터가 증식함에 따라 젖산 등의 유기산이 생성되므로 pH 저하와 밀접한 관련이 있다. 특히 흡광도와 pH 사이의 상관관계(r2: 0.6378)보다는 흡광도와 총산도의 관련성(r2: 0.8154)이 높았으며 총산도와 pH 결과가 가장 높은 상관관계(r2: 0.8793)를 나타내었다.
8%로 배양 중 소거 능력이 상대적으로 낮았다. 한편 상업용 균주에 비해 분리한 균주를 첨가한 실험구들이 아질산염을 소거하는 속도가 빨랐으며, 최종 아질산염 함량은 MLK 14-2가 27.4%, DO 10-1이 30.7%로 상업용 균주에 비해 아질산염 소거 능력이 우수하였다. 아질산염은 발효소시지 제조과정에서 미생물의 오염을 방지하고 발색을 위해 첨가하지만, 아질산염을 일정 농도 이상으로 섭취할 경우 혈중에서 아질산염이 hemoglobin의 산화를 일으켜 중독증상을 발생시키고 2급, 3급 amine과 결합하여 발암물질인 nitrosoamine을 생성하므로 아질산염 소거능 평가는 발효소시지 스타터를 선발함에 있어 중요한 요소로 작용할 수 있다(17).
64로 가장 낮은 값을 보였다. 한편 상업용 균주인 LS-25와 RPS를 접종한 실험구는 다른 균주들과 다르게 배양 0시간부터 지속적으로 pH가 저하되었으며, 분리한 3균주를 접종한 실험구들은 발효 24시간 이후 pH가 급격하게 저하되는 것이 관찰되었다(Fig. 1B). Model-system에서의 pH는 상업용 균주인 LS-25와 RPS를 배양한 실험구가 가장 빠른 속도로 낮아졌지만, 최종 pH는 분리 균주인 DO 10-1과 MLK 14-2를 배양한 실험구가 4.
4에 나타내었다. 흡광도가 증가할수록 pH는 저하되는 반비례적 상관관계를 보이지만 총산도는 증가하는 비례적 상관관계를 나타내며 총산도가 증가할수록 pH는 감소하는 반비례적 상관관계를 보여준다. Kunz와 Lee(3)는 20∼24℃에서 발효할 경우 발효 2∼3일 후 젖산균의 수가 108 CFU/g에 이르게 되고 산의 생성 또한 왕성해지면서 빠른 pH 저하가 일어난다고 하였는데 이는 본 실험 결과와 일치한다.
후속연구
하지만 분리한 균주를 산업적으로 이용하기 위해서는 용혈현상, 암모니아나 인돌 생성여부, 젤라틴 용해여부와 phenylalanine deaminase, β-glucuronidase, β-glucosidase, 7α-dehydroxylase, nitroreductase 등의 효소활성에 대한 추가 연구를 통해 안전성을 검사하여야 한다(28).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
발효소시지는 무엇인가?
발효소시지는 세절된 육, 등 지방, 식염, 발색제, 당류 및 향신료 등을 혼합하여 casing에 충진시킨 후 발효 및 건조에 의하여 장기간의 보존성을 부여한 육제품이다(1). 발효소시지의 주재료는 고기와 지방이며, 이외에 미생물을 위한 탄소원으로 사용될 당분, 염지제, 향신료 그리고 스타터 등을 첨가하여 만든다(2).
발효소시지 스타터는 보존성을 위헤 첨가하는 어떤 물질에 저항력이 있어야 하는가?
발효소시지 스타터는 소시지의 환경(염 농도, 온도)에 잘 적응하고, 다른 미생물들과 경쟁하여 빠른 성장 능력과 pH 저하 능력을 가져 각종 유해 미생물들의 성장을 억제하여 안전성을 증진시킬 수 있어야 한다(5). 또한 발효소시지의 보존성을 위해 첨가하는 아질산염에 대해 저항력이 있고 아질산염을 소거시키는 능력이 있는 것이 좋으며(6), 짧은 숙성기간 중 독특한 맛과 풍미, 물성 및 색상을 형성하여 관능적인 특성에 긍정적으로 기여하여야 한다(3).
발효소시지의 스타터는?
스타터로 일부 곰팡이(Penicillium nalgiovense, Pen. chrysogenum)이나 효모(Debaryomyces hansenii)가 사용되고 있기도 하지만, 주로 Lactobacillus plantarum, Lac. pentosus, Lac. sakei, Lac. curvatus, Pediococcus pentosaceus, Ped. acidilactici 등의 lactic acid bacteria와 Staphylococcus carnosus, Sta. xylosus, Micrococcus varians 등의 catalase-positive cocci가 발효소시지 제조를 위한 스타터로 사용되고 있다(4). 발효소시지 스타터는 소시지의 환경(염 농도, 온도)에 잘 적응하고, 다른 미생물들과 경쟁하여 빠른 성장 능력과 pH 저하 능력을 가져 각종 유해 미생물들의 성장을 억제하여 안전성을 증진시킬 수 있어야 한다(5).
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